王剛 ，楊丹 ，段壬澤 ，楊麗君 ，陳娟 趙方毓 ，陳顯兵

1.湖北民族大學(xué)附屬民大醫(yī)院，湖北 恩施 445000； 2.湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部，湖北 恩施 445000

卒中后認(rèn)知障礙（post-stroke cognitive impairment，PSCI）是指在卒中后6個(gè)月內(nèi)發(fā)生的從輕度認(rèn)知損害到癡呆的一系列綜合征，是臨床常見(jiàn)的腦血管病變及神經(jīng)退行性疾病[1]。2020年發(fā)布的《中國(guó)卒中報(bào)告》顯示，我國(guó)卒中患病率為1.11%，年發(fā)病率為0.25%，病死率為0.15%，其中約1/3的卒中患者會(huì)經(jīng)歷PSCI[2]。

PSCI發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前普遍認(rèn)為，腦血管病變引起腦部缺血或出血，進(jìn)而導(dǎo)致腦神經(jīng)解剖結(jié)構(gòu)損害是其主要發(fā)病機(jī)制[3]。在卒中期間，被剝奪正常代謝底物耗氧和耗能的神經(jīng)元在幾秒內(nèi)停止正常運(yùn)作，并在2 min內(nèi)顯示出結(jié)構(gòu)性損傷的跡象[4]。隨著能量依賴過(guò)程的加重，神經(jīng)元無(wú)法維持其正常生理功能，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，最終損害感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)功能。近年來(lái)，隨著神經(jīng)外科手術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的患者在急性腦卒中后幸存下來(lái)，但大多數(shù)患者術(shù)后仍患有持續(xù)的感覺(jué)運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知功能障礙[5]。

延齡草為百合科延齡草屬植物延齡草Trillium tschonoskiiMaxim的干燥根莖，味甘，性平，有小毒。研究發(fā)現(xiàn)，延齡草總皂苷具有抗氧化、延緩衰老、促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶等作用[6-7]，但其對(duì)腦卒中后引發(fā)的神經(jīng)疾病的作用研究較少。本研究采用改良線栓法制備PSCI大鼠模型，初步探討延齡草總皂苷對(duì)PSCI大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬神經(jīng)元突觸損傷的影響及作用機(jī)制，為PSCI臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)6～7周齡雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量（200±20）g，三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK （ 鄂） 2017-0012， 動(dòng)物合格證號(hào)42010200005116。飼養(yǎng)于湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部清潔動(dòng)物房，溫度23～25 ℃，相對(duì)濕度50%～60%，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。本研究經(jīng)湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批（202159）。

1.2 藥物

延齡草采自恩施，由湖北民族大學(xué)中藥實(shí)驗(yàn)室鑒定為百合科延齡草屬植物延齡草的干燥根莖。藥材潔凈后，經(jīng)干燥、粉碎、提取、藥液過(guò)濾、濃縮干燥，最終得含量為61.48%的延齡草總皂苷，稱取1 g延齡草總皂苷，加入100 mL雙蒸水溶解備用。鹽酸多奈哌齊片，批號(hào)0000001782，浙江華海藥業(yè)，5 mg/片，將5 mg藥片研粉，加入111 mL雙蒸水溶解備用。

1.3 主要試劑與儀器

TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒（批號(hào)E-CK-A321，武漢伊萊瑞特生物），高爾基染色液（批號(hào)GMS80020.3，美國(guó)GENMED），尼氏染色液、SDS-PAGE快速配制試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、Akt抗體（批號(hào)分別為C0117、P0012AC、P0010、AA326，上海碧云天生物），PSD95 抗體、SYN 抗體、Caspase-3 抗體、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（批號(hào)分別為ab18258、ab52636、ab32351、ab6721、ab6789，英國(guó)Abcam），Bcl-2抗體、Bax抗體（批號(hào)分別為A19693、A19684，武漢ABclonal），PI3K抗體、p-Akt 抗體（批號(hào)分別為4255S、4060S，美國(guó)Cell Signaling Technology），β-actin抗體（批號(hào)66009-1-Ig，武漢三鷹生物）。

JSZ5B型體視顯微鏡（江南公司），Top Scan2.00水迷宮系統(tǒng)（美國(guó)Clever Sys），VT1200S震蕩切片機(jī)（德國(guó)Leica Biosystems公司），1510型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司），Tanon-5200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海天能科技公司），5810R高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），Western blot電泳及轉(zhuǎn)膜裝置（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.4 分組、造模及給藥

60只大鼠隨機(jī)分為造模組50只和假手術(shù)組10只，造模組參照文獻(xiàn)[8]采用改良線栓法制備PSCI大鼠模型，假手術(shù)組僅切開(kāi)皮膚，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈后立即縫合切口，不插入線栓。術(shù)后按照Longa 5分法[8]對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，評(píng)分1～3分為造模成功，共得到30只造模成功大鼠。將成模大鼠隨機(jī)分為模型組、延齡草總皂苷組和鹽酸多奈哌齊組，每組10只，延齡草總皂苷組予10 mg/mL延齡草總皂苷溶液100 mg/kg灌胃，鹽酸多奈哌齊組予0.045 mg/mL鹽酸多奈哌齊溶液0.45 mg/kg灌胃，灌胃體積10 mL/kg，假手術(shù)組和模型組予等體積雙蒸水灌胃，連續(xù)28 d。

1.5 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

給藥結(jié)束當(dāng)天開(kāi)始定位航行實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)自動(dòng)將圓形水面分為4個(gè)象限，求生平臺(tái)放在第3象限低于水面0.6～1 cm處，將大鼠面向池壁分別于第1、2、4象限放入，系統(tǒng)自動(dòng)記錄大鼠60 s內(nèi)尋找平臺(tái)所需時(shí)間，即逃避潛伏期。每日1次，連續(xù)5 d，第6日休息。第7日上午進(jìn)行正式定位航行實(shí)驗(yàn)，將大鼠沿第1象限放入，記錄大鼠逃避潛伏期。下午進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，撤去平臺(tái)，將大鼠沿第1象限放入，記錄大鼠60 s內(nèi)穿越平臺(tái)次數(shù)及目標(biāo)象限停留時(shí)間比（第3象限停留時(shí)間÷總時(shí)間×100%）。

1.6 HE、尼氏染色

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組隨機(jī)選取2只大鼠，10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉，經(jīng)心臟灌注多聚甲醛固定后，斷頭取全腦，沿大腦視交叉處做4～5 mm冠狀切片，將切片置于4%多聚甲醛中固定48 h。常規(guī)脫水、石蠟包埋后，行4 μm 石蠟切片，經(jīng)HE、尼氏染色后，中性樹(shù)膠封片，掃描切片，觀察腦組織病理變化。

1.7 TUNEL染色

石蠟切片常規(guī)脫蠟后置于PBS中備用，滴加適量蛋白酶K工作液覆蓋組織，37 ℃反應(yīng)20 min。PBS洗滌切片3次，每次5 min，滴加適量1×DNaseⅠ Buffer工作液，室溫平衡5 min，滴加適量DNaseⅠ工作液，37 ℃孵育10～30 min。PBS洗滌切片3次，每次5 min，滴加適量TdT Equilibration Buffer覆蓋組織，37 ℃孵育10～30 min。滴加適量陽(yáng)性標(biāo)記工作液，濕盒37 ℃避光反應(yīng)60 min，PBS洗滌3次，每次5 min，滴加適量DAPI，室溫避光孵育5 min，PBS洗滌切片4次，每次5 min，滴加抗熒光淬滅封片劑，蓋玻片封片，熒光顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡情況。

1.8 高爾基染色

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組隨機(jī)選取3只大鼠進(jìn)行高爾基染色。大鼠經(jīng)心臟灌注生理鹽水后，沿海馬區(qū)冠狀位做5 mm切塊進(jìn)行媒染，2周后將組織放入震蕩切片機(jī)中，行40 μm切片，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)將切好的組織依次放入染液中染色，明膠封片。采用Image Pro Plus 6.0軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析，計(jì)算樹(shù)突棘密度。

1.9 Western blot檢測(cè)

將各組剩余5只大鼠麻醉，斷頭取腦，冰上分離左側(cè)海馬，按1 mg組織加入9 μL裂解液、0.09 μL蛋白酶抑制劑進(jìn)行組織勻漿、超聲，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液，BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。制備12%分離膠，每孔上樣4 μL，依次進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、血清封閉15 min、TBST洗膜，將膜置稀釋后的一抗中（PI3K 1∶1 000、p-Akt 1∶2 000、Akt 1∶1 000、Bcl-2 1∶1 000、Bax 1∶1 000、Caspase-3 1∶5 000、SYN 1∶5 000、PSD-95 1∶1 000），4 ℃孵育過(guò)夜。TBST 洗膜，置于稀釋后的二抗中，室溫孵育1 h，TBST洗膜，滴加ECL顯色液進(jìn)行曝光，采用GIS 1D圖像分析軟件計(jì)算蛋白灰度值。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 延齡草總皂苷對(duì)模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期顯著增加，穿越平臺(tái)次數(shù)及目標(biāo)象限停留時(shí)間比顯著減少（P＜0.01）；與模型組比較，延齡草總皂苷組和鹽酸多奈哌齊組大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期顯著減少，穿越平臺(tái)次數(shù)及目標(biāo)象限停留時(shí)間比顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（±s）

表1 各組大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

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2.2 延齡草總皂苷對(duì)模型大鼠腦組織病理變化的影響

假手術(shù)組大鼠海馬CA1 區(qū)及皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元飽滿豐富、排列整齊、數(shù)量較多，細(xì)胞核著色清晰，未見(jiàn)明顯細(xì)胞壞死及空泡化現(xiàn)象；模型組大鼠海馬CA1區(qū)及皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元排列紊亂、數(shù)量較少，出現(xiàn)核固縮，尼氏體數(shù)量減少；延齡草總皂苷組及鹽酸多奈哌齊組大鼠海馬CA1 區(qū)及皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元較飽滿、數(shù)量增多，空泡化及壞死細(xì)胞明顯減少，尼氏體數(shù)量增加。見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 各組大鼠腦組織形態(tài)（HE染色，標(biāo)尺=50 μm）

圖2 各組大鼠腦組織形態(tài)（尼氏染色，標(biāo)尺=50 μm）

2.3 延齡草總皂苷對(duì)模型大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡的影響

TUNEL 染色藍(lán)色為細(xì)胞核，綠色為凋亡細(xì)胞。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬CA1區(qū)凋亡神經(jīng)元數(shù)量增加；與模型組比較，延齡草總皂苷組和鹽酸多奈哌齊組大鼠海馬CA1 區(qū)凋亡神經(jīng)元數(shù)量減少。見(jiàn)圖3。

圖3 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡陽(yáng)性表達(dá)（TUNEL染色，×200）

2.4 延齡草總皂苷對(duì)模型大鼠海馬組織樹(shù)突棘密度的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織樹(shù)突棘密度顯著減?。≒＜0.01）；與模型組比較，延齡草總皂苷組和鹽酸多奈哌齊組大鼠海馬組織樹(shù)突棘密度顯著增加（P＜0.01）。見(jiàn)圖4。

圖4 各組大鼠海馬組織樹(shù)突棘密度比較（高爾基染色，×1 000，±s，每組3只）

2.5 延齡草總皂苷對(duì)模型大鼠海馬組織蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織Bcl-2、SYN、PSD-95、PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.01），Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，延齡草總皂苷組和鹽酸多奈哌齊組大鼠海馬組織Bcl-2、SYN、PSD-95、p-Akt蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01），Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.01，P＜0.05），延齡草總皂苷組PI3K蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01）。見(jiàn)圖5、表2。

圖5 各組大鼠海馬組織Bcl-2、Bax、Caspase-3、SYN、PSD-95、PI3K、Akt、p-Akt蛋白免疫印跡

表2 各組大鼠海馬組織Bcl-2、Bax、Caspase-3、SYN、PSD-95、PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達(dá)比較（±s）

表2 各組大鼠海馬組織Bcl-2、Bax、Caspase-3、SYN、PSD-95、PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

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3 討論

認(rèn)知是腦的高級(jí)功能，海馬及大腦皮層是大腦記憶網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分。大腦缺血后可引起海馬體及皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元損傷，從而導(dǎo)致認(rèn)知功能減退或永久性記憶損害，是腦卒中最嚴(yán)重的功能障礙之一[9-10]。本研究采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，結(jié)果顯示，模型組大鼠逃避潛伏期顯著增加，目標(biāo)象限停留時(shí)間比顯著減少，表明造模后大鼠出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙。經(jīng)延齡草總皂苷干預(yù)后，大鼠逃避潛伏期顯著減少，目標(biāo)象限停留時(shí)間比顯著增加，表明延齡草總皂苷對(duì)急性腦缺血引起的認(rèn)知功能障礙具有明顯改善作用。

神經(jīng)元損傷的常見(jiàn)原因之一是缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[11-12]。急性缺血性腦卒中后，大腦中動(dòng)脈供血區(qū)域的循環(huán)氧氣輸送減少，造成局部神經(jīng)元快速凋亡。本研究采用HE染色及尼氏染色對(duì)大鼠缺血側(cè)腦組織進(jìn)行觀察，模型組大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)由缺血、缺氧造成的神經(jīng)元壞死最為明顯，核固縮及空泡化現(xiàn)象突出，海馬CA1區(qū)出現(xiàn)神經(jīng)元排列疏松、尼氏體數(shù)量減少、核固縮現(xiàn)象。經(jīng)延齡草總皂苷干預(yù)后，大腦皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元空泡化及核固縮現(xiàn)象減輕，海馬CA1區(qū)空泡化不明顯，說(shuō)明延齡草總皂苷對(duì)缺血、缺氧造成的神經(jīng)元丟失及損傷具有抑制作用。

細(xì)胞凋亡在腦缺血發(fā)作數(shù)小時(shí)后開(kāi)始，受Bcl-2家族、Caspase家族等多基因調(diào)控，Bcl-2是抗凋亡蛋白，可被Bax干擾，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Caspase-3是大腦發(fā)育的重要蛋白，在介導(dǎo)神經(jīng)元凋亡中起著重要作用。腦缺血后，Bcl-2表達(dá)減少，Bax表達(dá)增加，Bcl-2和Bax結(jié)合形成凋亡二聚體，從而激活Caspase，觸發(fā)依賴性凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞明顯增加，延齡草總皂苷干預(yù)后，海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞明顯減少；Western blot結(jié)果顯示，延齡草總皂苷能上調(diào)海馬組織Bcl-2蛋白表達(dá)，下調(diào)Bax及Caspase-3蛋白表達(dá)，提示延齡草總皂苷能抑制神經(jīng)元凋亡，對(duì)神經(jīng)元起保護(hù)作用。

神經(jīng)元和突觸是海馬依賴性學(xué)習(xí)記憶的生物學(xué)基礎(chǔ)。研究顯示，缺血性腦卒中損害神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和細(xì)胞間信號(hào)傳遞的完整性，并導(dǎo)致認(rèn)知障礙[13]。PSD-95 和SYN是突觸可塑性的重要指標(biāo)，參與興奮性突觸的成熟和突觸接觸的穩(wěn)定[14]。樹(shù)突棘的可塑性是認(rèn)知功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，與神經(jīng)元回路的重新連接有關(guān)，樹(shù)突棘可塑性增強(qiáng)有助于皮質(zhì)功能恢復(fù)[15]。PI3K/Akt信號(hào)通路是細(xì)胞代謝、生長(zhǎng)、凋亡等生理活動(dòng)的經(jīng)典通路，可通過(guò)調(diào)控氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等過(guò)程參與缺血性腦卒中發(fā)生發(fā)展[16-17]。缺血性腦卒中發(fā)生后，人體釋放神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)因子、整合素等激活酪氨酸激酶受體，磷酸化PI3K和Akt，觸發(fā)PI3K/Akt通路激活。本研究發(fā)現(xiàn)，模型大鼠予延齡草總皂苷后，海馬組織PSD-95、SYN、PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)和樹(shù)突棘密度均顯著增加，表明延齡草總皂苷可以激活PI3K/Akt信號(hào)通路，從而對(duì)PSCI 大鼠海馬神經(jīng)元突觸損傷發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述，延齡草總皂苷可以改善PSCI大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，減輕神經(jīng)元突觸損傷，其機(jī)制可能與激活PI3K/Akt信號(hào)通路，上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，下調(diào)Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。本研究從神經(jīng)元凋亡和突觸損傷角度初步探討延齡草總皂苷對(duì)PSCI大鼠的保護(hù)作用及機(jī)制，鑒于PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)控靶點(diǎn)的復(fù)雜性及中藥治療多靶點(diǎn)、多途徑等特點(diǎn)，今后將從其他途徑進(jìn)行深入研究。