肖豆 ，馬文娟 ，唐雅妮 ，謝崢嶸 ，潘江 ，劉民權 ，章薇 ，陳成

1.同濟大學附屬楊浦醫(yī)院，上海 200090； 2.長沙市中醫(yī)醫(yī)院，長沙市第八醫(yī)院，湖南 長沙 410100；3.長沙民政職業(yè)技術學院，湖南 長沙 410004； 4.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007

腦缺血是因大腦血液循環(huán)受阻，缺血、缺氧導致局限性腦組織缺血性壞死或軟化，進而引起相應神經(jīng)系統(tǒng)功能缺損的一種疾病。患者腦缺血后多伴有肢體功能障礙，甚至造成終身殘疾。神經(jīng)修復是促進腦缺血患者神經(jīng)功能康復的重要途徑[1]。研究認為，神經(jīng)功能因子及炎癥介質的相互作用是影響神經(jīng)修復的關鍵因素[2]。其中髓鞘相關生長抑制因子A（Nogo-A）與Nogo 受體1（NgR1）均具有抑制神經(jīng)細胞遷移和擴散、阻礙軸突再生的作用[3-4]，通過消除或減少上述抑制因子，能達到促進神經(jīng)再生及腦缺血后中樞神經(jīng)修復的作用[5-6]。本研究基于Nogo-A/NgR1信號通路觀察電針心包經(jīng)穴對大腦中動脈栓塞（MCAO）模型大鼠不同時點腦組織Nogo-A及NgR1蛋白表達的影響，探討電針對腦缺血損傷后神經(jīng)修復的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF 級雄性SD大鼠150只，體質量220～250 g，3～4月齡，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，動物許可證號SCXK（湘）2016-0002。飼養(yǎng)于溫度22 ℃、濕度55%～70%環(huán)境。實驗過程遵守實驗動物管理和使用規(guī)定。

1.2 主要試劑與儀器

Nogo-A抗體（美國Proteintech公司，貨號10740-1-Ap），NgR1 抗體（博奧森公司，貨號bs-0129R），β-actin抗體（美國Proteintech公司，貨號66009-1-Ig），二抗鼠抗體（美國Proteintech公司，貨號SA00001-1），二抗兔抗體（美國Proteintech公司，貨號SA00001-2），RIPA裂解液（上海碧云天公司，貨號P0013B）。

0.30 mm×15 mm華佗牌毫針、SDZ-Ⅱ華佗電針治療儀（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司），DYY-6C 電泳儀（北京六一儀器廠），YD-315切片機（浙江金華益迪試驗器材），DYCZ-40D轉膜儀（北京六一儀器廠）。

1.3 分組與造模

將150只SD大鼠隨機分為正常組、假手術組、模型組、心包經(jīng)組和肺經(jīng)組，每組30只，各組再分為3、7、14、21、28 d 5個時間點，每個時間點各6只。

造模前禁食1 d，參照Longa[7]和Koizumi[8]造模方法，以頸外動脈插入線栓法制備MCAO大鼠模型。正常組不做任何處理，假手術組僅暴露血管。造模后次日，采用Longa 5級4分制評分法[7]評分：無神經(jīng)功能缺損計0分，缺血對側伸直障礙、前爪內收計1分，行走向偏癱側轉圈計2分，行走向偏癱側傾倒計3分，完全喪失意識、不能行走計4分。選取評分1～3分大鼠納入實驗。

1.4 干預

造模成功次日開始電針干預，參照《實驗針灸學》[9]動物穴位圖譜取穴。心包經(jīng)組選取“天泉”“曲澤”“內關”“大陵”，肺經(jīng)組選取“天府”“尺澤”“列缺”“太淵”，用毫針刺入缺血對側穴位3～4 mm，接通電針治療儀，心包經(jīng)組“天泉”“曲澤”相連、“內關”“大陵”相連，肺經(jīng)組“天府”“尺澤”相連、“列缺”“太淵”相連，選用連續(xù)波，電壓2～4 V，電流4～6 mA，強度以局部組織輕顫為度。每次30 min，每日1次，連續(xù)6 d，休息1 d，繼續(xù)干預至28 d。

1.5 HE染色

分別于電針3、7、14、21、28 d取相應大鼠，頸椎脫臼處死，斷頭取腦，參照《大鼠腦立體定位圖譜》[10]，模型組、心包經(jīng)組和肺經(jīng)組切取左側視交叉至腦橋屬大腦中動脈供血區(qū)域，正常組和假手術組參照上述部位取材。脫水、包埋、切片后，60 ℃烤片1～2 h，切片置于二甲苯中10 min×2 次。100%、100%、95%、85%、75%乙醇依次放置5 min，蒸餾水洗5 min，蘇木素染色5～10 min，蒸餾水沖洗，PBS返藍，伊紅染3～5 min，蒸餾水沖洗，梯度乙醇脫水，置于二甲苯中10 min×2次，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.6 免疫組化染色

取大鼠缺血側腦組織，用4%多聚甲醛固定，常規(guī)制作石蠟切片，切片脫蠟至水，浸入檸檬酸鹽緩沖液，微波爐加熱至沸騰，連續(xù)煮25 min，冷卻至室溫，PBS洗滌3 min×3次進行熱修復抗原，滅活內源性酶后，滴加Nogo-A、NgR1 一抗（1∶200），4 ℃孵育過夜。PBS沖洗5 min×3次，加二抗，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗5 min×3次，DAB顯色，蘇木素復染5～10 min，蒸餾水沖洗，PBS返藍后顯微鏡下觀察，隨機選擇5個不重疊視野采集圖像，Image-Pro Plus 6.0軟件分析每個視野陽性表達的平均光密度（陽性染色為棕黃色）。

1.7 Western blot檢測

取缺血側腦組織，每100 mg組織加入RIPA裂解液1 mL研磨，冰上裂解10 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，吸取上清液，BCA法測定蛋白濃度。加入上樣緩沖液加熱變性后，電泳，轉移至NC膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉60 min，分別加入Nogo-A一抗（1∶800）、NgR1一抗（1∶1 500）、β-actin一抗（1∶5 000），4 ℃孵育過夜，加入相應二抗（1∶5 000），室溫孵育90 min。使用ECL化學發(fā)光液顯影，用Quantity One軟件分析蛋白條帶灰度值。以β-actin為內參，計算目的蛋白相對表達量（目的蛋白灰度值/β-actin灰度值）。

1.8 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 電針對模型大鼠缺血側腦組織病理變化的影響

正常組、假手術組大鼠各時點腦組織結構完整、清晰致密，神經(jīng)元細胞胞質豐富，可見較大清晰核仁；模型組大鼠各時點腦組織可見大片梗死灶，神經(jīng)細胞消失或皺縮，細胞核固縮，核邊集嚴重，細胞間距增大，間質染色稀疏；心包經(jīng)組和肺經(jīng)組大鼠各時點缺血腦組織細胞排列相對規(guī)則，較模型組結構緊密。心包經(jīng)組腦組織結構較同時點肺經(jīng)組稍緊密、細胞排列稍規(guī)則。結果見圖1。

圖1 各組大鼠缺血側腦組織形態(tài)（HE染色，×400）

2.2 電針對模型大鼠缺血側腦組織髓鞘相關生長抑制因子A、Nogo受體1表達的影響

免疫組化結果顯示，與正常組、假手術組比較，模型組大鼠各時點腦組織Nogo-A、NgR1表達明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，心包經(jīng)組和肺經(jīng)組大鼠各時點腦組織Nogo-A、NgR1表達明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）；與肺經(jīng)組比較，心包經(jīng)組大鼠7、28 d腦組織Nogo-A表達明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），各時點NgR1表達明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。見圖2、圖3、表1、表2。

表1 各組大鼠缺血側腦組織不同時點Nogo-A表達比較（±s，平均光密度）

注：與正常組、假手術組比較，★★P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與肺經(jīng)組比較，●P＜0.05，●●P＜0.01

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表2 各組大鼠缺血側腦組織不同時點NgR1表達比較（±s，平均光密度）

表2 各組大鼠缺血側腦組織不同時點NgR1表達比較（±s，平均光密度）

注：與正常組、假手術組比較，★★P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與肺經(jīng)組比較，●P＜0.05，●●P＜0.01

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圖2 各組大鼠缺血側腦組織Nogo-A陽性表達（免疫組化染色，×400）

圖3 各組大鼠缺血側腦組織NgR1陽性表達（免疫組化染色，×400）

Western blot結果顯示，與正常組、假手術組比較，模型組大鼠各時點腦組織Nogo-A、NgR1蛋白表達明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，除14 d外，心包經(jīng)組大鼠腦組織Nogo-A蛋白表達明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），各時點NgR1蛋白表達明顯降低（P＜0.01）；與肺經(jīng)組比較，心包經(jīng)組大鼠3、7 d腦組織Nogo-A蛋白表達明顯降低（P＜0.01，P＜0.05），各時點NgR1蛋白表達明顯降低（P＜0.01）。見圖4、表3、表4。

表3 各組大鼠缺血側腦組織不同時點Nogo-A蛋白表達比較（±s，相對表達量）

表3 各組大鼠缺血側腦組織不同時點Nogo-A蛋白表達比較（±s，相對表達量）

注：與正常組、假手術組比較，★★P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與肺經(jīng)組比較，●P＜0.05，●●P＜0.01

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表4 各組大鼠缺血側腦組織不同時點NgR1蛋白表達比較（±s，相對表達量）

表4 各組大鼠缺血側腦組織不同時點NgR1蛋白表達比較（±s，相對表達量）

注：與正常組、假手術組比較，★★P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與肺經(jīng)組比較，●P＜0.05，●●P＜0.01

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圖4 各組大鼠缺血側腦組織Nogo-A、NgR1蛋白免疫印跡

3 討論

腦缺血是危害人類健康的主要疾病之一，且發(fā)病年齡呈現(xiàn)年輕化趨勢[11-12]。研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血后，因腦部缺血、缺氧和系列炎癥反應導致神經(jīng)細胞損傷，使患者出現(xiàn)嚴重的神經(jīng)功能障礙[13]。促進神經(jīng)修復成為腦缺血患者后期康復的重點和難點。電針作為中醫(yī)傳統(tǒng)針刺療法與現(xiàn)代電刺激相結合的治療方式，在腦缺血康復治療中療效顯著，其作用機理是目前研究的熱點。

電針能有效調控內環(huán)境中神經(jīng)生長因子和神經(jīng)生長抑制因子含量[14]，改善腦組織血液循環(huán)[15]和能量代謝[16]，抑制細胞凋亡[17-18]和炎癥反應[19]。但目前對于腦缺血的研究大多基于“通督調神”“治痿獨取陽明”等理論開展，電針心包經(jīng)與其他經(jīng)脈對照的研究報道較少。從經(jīng)脈循行來看，心包經(jīng)可通過其絡脈、陰維脈、任脈與腦間接聯(lián)系。且《針灸甲乙經(jīng)》《針灸大成》《外臺秘要》《銅人腧穴針灸圖經(jīng)》等古籍皆記載心包經(jīng)腧穴可治療中風諸癥[20]。臨床研究表明，針刺心包經(jīng)腧穴不僅能有效增加腦缺血患者腦血流量[21]，調節(jié)自主神經(jīng)平衡[22]，還能有效縮短中風患者康復時間，防止肌肉萎縮和痙攣[23-24]。本研究團隊長期從事電針心包經(jīng)穴治療腦缺血損傷相關研究，從抗炎、抗凋亡、促血管新生、神經(jīng)遞質與神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌、促進神經(jīng)元突觸發(fā)生、神經(jīng)修復等多角度驗證電針心包經(jīng)穴對腦缺血損傷的效應機制[25-29]?；谇捌谘芯砍晒?，本研究從神經(jīng)修復角度出發(fā)，觀察電針心包經(jīng)穴對MCAO大鼠腦組織Nogo-A及NgR1蛋白表達的影響，探討其可能的作用機制，為“從心治腦”理論提供實驗依據(jù)。

研究表明，大鼠急性腦缺血后，缺血腦組織Nogo-A和NgR1蛋白表達明顯升高[30-31]，針刺干預在促進大鼠神經(jīng)功能恢復的同時可明顯降低腦組織Nogo-A 與NgR1蛋白表達[32]。而Nogo-A抗體和/或NgR1拮抗劑在降低Nogo-A和/或NgR1表達同時，還能保護缺血后腦組織，在一定程度上促進神經(jīng)修復及軸突再生[33-34]。由此推測，腦缺血損傷后，Nogo-A、NgR1含量增加，二者相互作用，激活下游相關通路，從而抑制軸突再生。

腦缺血發(fā)展是一個復雜動態(tài)變化的過程，其病理損害隨著時間發(fā)展而變化。而神經(jīng)軸突再生需要分化完全的神經(jīng)元重新接受出芽信號，激活分子生長程序，然后成長為軸突。有研究者認為，整個過程需要耗時2個月以上[35-36]。目前研究大多認為Nogo-A和NgR1表達在腦缺血后第7、14或21日達到峰值[37-38]，但尚無定論。故本實驗設置多個時點觀察腦缺血損傷后Nogo-A和NgR1表達變化及電針干預效應。

本研究結果顯示，模型組大鼠各時點缺血側腦組織神經(jīng)細胞大量凋亡，細胞間距增大、組織結構紊亂，腦組織Nogo-A和NgR1蛋白表達升高。電針心包經(jīng)穴能改善大鼠缺血側腦組織神經(jīng)細胞形態(tài)，同時下調不同時點腦組織Nogo-A和NgR1蛋白表達，且在不同程度上優(yōu)于肺經(jīng)組?？紤]可能是電針心包經(jīng)穴能改善腦的血液循環(huán)，促進大腦側支循環(huán)建立，使缺血腦組織Nogo-A和NgR1蛋白表達降低，從而促進神經(jīng)修復、改善組織形態(tài)結構，也有可能隨著大鼠腦缺血時間的延長，內環(huán)境發(fā)生改變，抑制Nogo-A和NgR1蛋白表達，使神經(jīng)自我再生和修復能力增強，進行發(fā)芽重塑形成新的軸突。此外，電針肺經(jīng)穴也能抑制部分時點Nogo-A 和NgR1 蛋白表達，考慮肺“朝百脈，主治節(jié)”，同時有“主一身之氣”的生理功能，能促進血液中濁氣與清氣互換，并將富含清氣的血液輸送到腦及全身各處[39]，具體原因還需進一步擴大實驗樣本量研究。本實驗顯示，不同檢測方法和不同指標所表現(xiàn)的有效時間點不同，通過結果分析，7 d和14 d可能為最優(yōu)干預時間點，但仍需要進一步實驗驗證。

綜上所述，電針心包經(jīng)穴能抑制MCAO模型大鼠不同時點缺血腦組織Nogo-A和NgR1蛋白表達，調節(jié)軸突發(fā)芽和再生微環(huán)境，從而保護受損的神經(jīng)細胞，起到神經(jīng)修復作用。