鄭宏 ，王蕾 ，鄒海艷

1.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)藥信息研究所，北京 100700；2.首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點實驗室，北京 100069

神經(jīng)炎癥是影響神經(jīng)退行性疾病進(jìn)展的重要因素，其主要表現(xiàn)有小膠質(zhì)細(xì)胞激活和腦微環(huán)境中神經(jīng)炎癥介質(zhì)大量產(chǎn)生。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）的先天固有免疫細(xì)胞，占腦細(xì)胞總數(shù)的10%～15%，與外周巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞作用類似，能夠作為腦的免疫屏障抵抗疾病和外界刺激。小膠質(zhì)細(xì)胞可以分為促炎型M1型和抑炎型M2型。M1型主要分泌促炎介質(zhì)，如白細(xì)胞介素（IL）-1、腫瘤壞死因子（TNF）-α，一氧化氮（NO）等，M2型能分泌IL-4、IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β等抗炎因子[1]。正常狀態(tài)下，M1/M2處于動態(tài)平衡，從而維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[2]。在腦缺血、神經(jīng)退行性疾病、感染等病理條件下，小膠質(zhì)細(xì)胞迅速活化，轉(zhuǎn)化為M1型，導(dǎo)致M1/M2比例失衡，產(chǎn)生大量促炎介質(zhì)，破壞血腦屏障并直接損傷神經(jīng)元或引起其他繼發(fā)性損傷[3-4]。因此，抑制其過度活化引起的炎癥反應(yīng)可作為治療和緩解神經(jīng)退行性疾病和腦損傷的重要途徑[5-7]。

自噬是存在于真核細(xì)胞內(nèi)的保守的降解機制，通過溶酶體機制降解受損或不必要的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物。自噬在許多生理和病理過程中起重要作用，如抑制細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和細(xì)胞產(chǎn)物再循環(huán)[8-10]。研究表明，神經(jīng)退行性疾病與自噬失調(diào)有關(guān)[11]，此類疾病多伴有蛋白質(zhì)聚集和炎癥反應(yīng)，增強自噬可以減少蛋白質(zhì)蓄積[12]。因此，上調(diào)自噬成為治療神經(jīng)退行性疾病的潛在靶點，同時可以抑制炎癥反應(yīng)發(fā)生，對于抑制細(xì)胞凋亡、延緩神經(jīng)元變性有重要意義。

竹節(jié)參為五加科人參屬植物竹節(jié)參Panax japonicusC. A. Mey.的干燥根莖，具有散瘀止血、消腫止痛、祛痰止咳、補虛強壯功效，民間常用于治療跌打損傷、骨關(guān)節(jié)疾病、病后虛弱。其主要成分竹節(jié)參總皂苷（TSPJ）對中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥[13-14]及風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[15-16]等具有較好的抗炎活性。其抗炎作用主要表現(xiàn)在抑制炎癥因子釋放、降低腫脹程度和毛細(xì)血管通透性[17]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，TSPJ對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用，能降低小鼠神經(jīng)功能評分，改善腦和脊髓炎性浸潤[18]。本研究通過脂多糖誘導(dǎo)小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞BV2體外炎癥模型，進(jìn)一步揭示TSPJ抗炎的作用機制。

1 實驗材料

1.1 細(xì)胞

小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞BV2購于國家生物醫(yī)學(xué)細(xì)胞資源庫，編號1101MOU-PUMC000063。

1.2 藥物及制備

竹節(jié)參藥材購于湖北省恩施土家族苗族自治州，經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院中藥資源教研室李佳副教授鑒定，符合2020年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定。取竹節(jié)參藥材8 kg，加入80%乙醇浸泡24 h，回流提取2次，第1次加8倍量溶劑提取2 h，第2次加6倍量溶劑提取2 h，過濾，合并濾液，55 ℃減壓回收至無醇味，得糖漿狀提取物。將提取物加適量水分散，用等量石油醚反復(fù)萃取至石油醚層近無色；水層繼續(xù)用等量水飽和正丁醇反復(fù)萃取至正丁醇層近無色，分取正丁醇提取液，減壓回收至黏稠狀，加80%乙醇溶解，加5倍體積丙酮，攪勻，放置過夜，4 000 r/min離心10 min，分離沉淀，用少量丙酮洗滌，放于真空干燥箱內(nèi)干燥。得到TSTJ提取物1 455 g，提取率為18.2%。

1.3 主要試劑與儀器

胎牛血清（FBS），美國Corning，貨號35-076-CV；DMEM高糖培養(yǎng)基，美國Hyclone，貨號SH30022.01B；100×青鏈霉素，美國Corning，貨號15140-122；脂多糖（LPS），美國Sigma，貨號PB10443；MTT，上海碧云天生物，貨號ST316；DAPI，美國SouthernBiotech，貨號0100-20；Griess 試劑盒，上海碧云天，貨號S0023；TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-10 ELISA 試劑盒，北京聯(lián)科生物，貨號分別為EK282、EK201B、EK204、EK210，自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA），上海阿拉丁，貨號M 129496；Akt 抑制劑GSK690693，美國TargetMol，貨號T6285；RIPA裂解液，北京索萊寶，貨 號 R0010-100； Arginase-1、 CD86、 Beclin1、mTOR、p-mTOR 抗體，英國Abcam，貨號分別為ab91279、ab119857、ab207612、ab32028、ab 109268；LC3抗體，美國Invitrogen，貨號PA 116931；Akt抗體，美國CST，貨號C67E7；p-Akt抗體，美國CST，貨號S473；β-actin抗體，美國Proteintech，貨號66099-1。

ESCD AC2-4S1超凈生物安全柜（美國Thermo公司），371型二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（美國Thermo公司），XDTD-8222恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司），LWD300-38LTI倒置顯微鏡（上海測維光電有限公司），SpectraMax Plus 384 全波長酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司），ETS-D5磁力攪拌器（德國IKA公司），Mini-PROTEAN?Tetra電泳槽（美國Bio-Rad公司），小型Trans-Blot?轉(zhuǎn)印槽（美國Bio-Rad公司），PowerPacTM電泳儀電源（美國Bio-Rad 公司），Heros B10 微量臺式離心機（德國Sartorius Sigma 公司），恒溫金屬?。ū本╆恢Z斯公司），F(xiàn)X6 XT化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（法國Vilber Fusion公司）。

2 實驗方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

從-80 ℃冰箱取出細(xì)胞，迅速置于37 ℃水浴中解凍2 min，1 000 r/min離心5 min，沉淀加入完全培養(yǎng)基（含20%FBS、青霉素100 U/mL和鏈霉素100 μg/mL）1 mL吹打成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液接種至培養(yǎng)瓶中，補充完全培養(yǎng)基至5 mL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d傳代1次。

2.2 藥物濃度篩選

精密稱取TSPJ粉末8 mg，加入PBS定容至2 mL，超聲使其完全溶解，配制成4 mg/mL貯備液，臨用前用DMEM高糖培養(yǎng)基將TSPJ貯備液稀釋成濃度分別為5、10、25、50、100 μg/mL溶液，0.22 μm濾膜過濾，即得。用DMEM培養(yǎng)基將LPS稀釋至10 μg/mL，用0.22 μm濾膜過濾，即得。

取對數(shù)生長期BV2細(xì)胞，調(diào)整密度為2×105個/mL，按每孔100 μL接種至96孔板，將細(xì)胞分為正常組和模型組，每組6個復(fù)孔，另設(shè)空白組調(diào)零。培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，吸去原培養(yǎng)基，加入濃度分別為0、5、10、25、50、100 μg/mL的TSPJ溶液（無血清培養(yǎng)基配制）孵育2 h。模型組加入終濃度為1 μg/mL的LPS溶液，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每孔加入5 mg/mL MTT溶液10 μL，混勻，培養(yǎng)箱孵育4 h。吸去培養(yǎng)基，加入DMSO 100 μL，混勻，酶標(biāo)儀波長490 nm測定吸光度（OD值），計算細(xì)胞存活率。存活率（%）=（實驗組OD值-空白組OD值）÷（正常組OD值-空白組OD值）×100%。

2.3 Griess法檢測一氧化氮含量

取對數(shù)生長期BV2細(xì)胞，調(diào)整密度為2×105個/mL，按每孔500 μL接種于24孔板，將細(xì)胞分為正常組、模型組和TSPJ低、中、高濃度組，每組4個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h 后，加入濃度分別為5、10、25 μg/mL的TSPJ溶液孵育2 h，正常組及模型組替換成無血清培養(yǎng)基。除正常組外，各組加入一定量LPS 溶液使其終濃度為1 μg/ mL，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取50 μL 上清液至新的96 孔板內(nèi)，分別加入50 μL Griess試劑Ⅰ和試劑Ⅱ，混勻，酶標(biāo)儀波長540 nm檢測各孔OD值，根據(jù)標(biāo)曲線計算上清液NO含量。

2.4 ELISA檢測

細(xì)胞按“2.3”項下方法處理后，采用ELISA檢測上清液TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-10含量，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

2.5 免疫熒光染色

將滅菌的圓形玻片放入24孔板內(nèi)，加入0.1 μg/mL多聚賴氨酸包被，37 ℃放置30 min，ddH2O沖洗2次，無菌條件下晾干備用。取對數(shù)生長期BV2細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整為2×105個/mL，每孔500 μL接種于24孔板，將細(xì)胞分為正常組、模型組和TSPJ組（25 μg/mL），每組3個復(fù)孔，其余步驟同“2.3”項下操作。棄去培養(yǎng)基，預(yù)冷PBS清洗3次，4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS洗3次，0.3%Triton X-100通透10 min，PBS清洗，5%BSA封閉30 min，滴加Arginase-1一抗（1∶200）、CD86 一抗（1∶100）、LC3 一抗（1∶200），濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜。PBS洗3次，滴加山羊抗兔Alexa Fluor 594（1∶400）和兔抗大鼠Alexa Fluor 488（1∶200），常溫避光孵育30 min，滴加DAPI染細(xì)胞核15 min，抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察，用Image J 1.8.0軟件統(tǒng)計熒光強度，以各組熒光強度與正常組熒光強度百分比作為最終結(jié)果。

2.6 Western blot檢測

取對數(shù)生長期BV2細(xì)胞，調(diào)整密度為2×105個/mL，以2.5 mL/孔接種至6孔板，將細(xì)胞分為：①正常組、模型組、TSPJ 組（25 μg/mL）、3-MA 組（1 mmol/L）和TSPJ+3-MA 組（25 μg/mL TSPJ+1 mmol/L 3-MA）；②正常組、模型組、TSPJ 組（25 μg/mL）、GSK 組（10 nmol/L）和TSPJ+GSK組（25 μg/mL TSPJ+10 nmol/L GSK690693），每組4個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后將培養(yǎng)基吸出，正常組和模型組加入DMEM培養(yǎng)基，其余組分別加入相應(yīng)溶液孵育2 h。除正常組外，各組加入LPS使其終濃度為1 μg/mL，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

使用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度為3 μg/μL，加入Loading Buffer，95 ℃金屬浴3～5 min使蛋白變性。制膠，上樣，電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。①組滴加LC3一抗（1∶500）、Beclin1一抗（1∶2 000）、p62 一抗（1∶10 000）和β-actin 一抗（1∶20 000），②組滴加p-Akt一抗（1∶1 000）、Akt一抗（1∶1 000）、p-mTOR一抗（1∶5 000）、mTOR一抗（1∶5 000）和β-actin 一抗（1∶20 000），4 ℃孵育過夜。TBST 洗膜3次，每次5 min，加HRP標(biāo)記山羊抗兔或山羊抗小鼠IgG（1∶20 000），室溫孵育1 h，TBST洗膜4次，每次5 min。按1∶1配制ECL發(fā)光液，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像，Image J 1.8.0軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值比值表示各蛋白相對表達(dá)量。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 竹節(jié)參總皂苷對細(xì)胞存活率的影響

在設(shè)定的TSPJ濃度范圍內(nèi)，LPS刺激后細(xì)胞存活率無明顯變化，當(dāng)TSPJ濃度超過50 μg/mL時，細(xì)胞存活率明顯降低（P＜0.01），表明該濃度對細(xì)胞有毒性作用，因此選擇TSPJ濃度分別為5、10、25 μg/mL進(jìn)行后續(xù)實驗。見圖1。

注：與相應(yīng)TSPJ濃度為0比較，##P＜0.01圖1 不同濃度TSPJ對BV2細(xì)胞存活率的影響（±s，n=6）

4.2 竹節(jié)參總皂苷對細(xì)胞上清液一氧化氮含量的影響

與正常組比較，模型組細(xì)胞上清液NO含量明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，TSPJ中、高濃度組細(xì)胞上清液NO含量明顯減少（P＜0.05，P＜0.01）。見表1。

表1 各組BV2細(xì)胞上清液NO含量比較（±s，μmol/L）

表1 各組BV2細(xì)胞上清液NO含量比較（±s，μmol/L）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

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4.3 竹節(jié)參總皂苷對細(xì)胞上清液炎癥因子含量的影響

與正常組比較，模型組細(xì)胞上清液促炎因子TNF-α、IL-1β含量明顯增加，抗炎因子IL-4、IL-10含量明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，TSPJ高濃度組細(xì)胞上清液TNF-α、IL-1β含量明顯減少，IL-4、IL-10 含量明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。見表2。

表2 各組BV2細(xì)胞上清液TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-10含量比較（±s，pg/mL）

表2 各組BV2細(xì)胞上清液TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-10含量比較（±s，pg/mL）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

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4.4 竹節(jié)參總皂苷對細(xì)胞Arginase-1、CD86、LC3 蛋白表達(dá)的影響

CD86 蛋白與M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞表型相關(guān)，Arginase-1蛋白與M2型小膠質(zhì)細(xì)胞表型相關(guān)。免疫熒光染色顯示，與正常組比較，模型組BV2細(xì)胞CD86表達(dá)明顯升高，Arginase-1表達(dá)明顯降低（P＜0.01），M1/M2平衡破壞；與模型組比較，TSPJ組BV2細(xì)胞CD86表達(dá)明顯降低，Arginase-1 表達(dá)明顯升高（P＜0.01），M1/M2平衡有所恢復(fù)。見圖2、表3。

表3 各組BV2細(xì)胞CD86、Arginase-1表達(dá)比較（±s，%）

表3 各組BV2細(xì)胞CD86、Arginase-1表達(dá)比較（±s，%）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

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圖2 各組BV2細(xì)胞CD86、Arginase-1表達(dá)（免疫熒光染色，×400）

與正常組比較，模型組細(xì)胞LC3 表達(dá)明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，TSPJ組細(xì)胞LC3表達(dá)明顯升高（P＜0.01）。見圖3、表4。

表4 各組BV2細(xì)胞LC3表達(dá)比較（±s，%）

表4 各組BV2細(xì)胞LC3表達(dá)比較（±s，%）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

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圖3 各組BV2細(xì)胞LC3陽性表達(dá)（免疫熒光染色，×400）

4.5 竹節(jié)參總皂苷對細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組細(xì)胞Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01），p62蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，TSPJ組細(xì)胞Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.01），p62蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01），3-MA組細(xì)胞Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01），p62 蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.01）；與TSPJ組比較，TSPJ+3-MA組細(xì)胞Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01），p62蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.01）；與3-MA組比較，TSPJ+3-MA組細(xì)胞Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.01），p62蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01）。見圖4、表5。

表5 各組BV2細(xì)胞Beclin1、LC3Ⅱ、p62蛋白表達(dá)比較（±s）

表5 各組BV2細(xì)胞Beclin1、LC3Ⅱ、p62蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與TSPJ組比較，△△P＜0.01；與3-MA組比較，▲▲P＜0.01

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注：A.正常組；B.模型組；C. 3-MA組；D. TSPJ組；E. TSPJ+3-MA組圖4 各組BV2細(xì)胞Beclin1、LC3、p62蛋白免疫印跡

4.6 竹節(jié)參總皂苷對細(xì)胞Akt/mTOR 通路蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組細(xì)胞p-Akt、p-mTOR蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，TSPJ組、GSK組和TSPJ+GSK組細(xì)胞p-Akt、p-mTOR蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01，P＜0.05）；與TSPJ組比較，TSPJ+GSK組細(xì)胞p-Akt、p-mTOR蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01）；與GSK組比較，TSPJ+GSK組細(xì)胞p-Akt、p-mTOR蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。各組Akt、mTOR表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖5、表6。

表6 各組BV2細(xì)胞p-Akt、p-mTOR蛋白表達(dá)比較（±s）

表6 各組BV2細(xì)胞p-Akt、p-mTOR蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與TSPJ組比較，△△P＜0.01；與GSK組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

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圖5 各組BV2細(xì)胞p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR蛋白免疫印跡

5 討論

CNS損傷時，可刺激小膠質(zhì)細(xì)胞極化，引起細(xì)胞形態(tài)、免疫學(xué)表型及功能的改變。目前已知的小膠質(zhì)細(xì)胞極化有2種狀態(tài)，即經(jīng)典極化態(tài)（M1型）和選擇性極化態(tài)（M2型）。誘導(dǎo)M1型的信號分子較多，其中最經(jīng)典的途徑是LPS激活[19]，外周血液中的活性成分如補體、免疫球蛋白等亦可誘導(dǎo)。該過程需要多條信號通路參與，其中以核因子-κB（NF-κB）信號通路最為主要。極化后M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞高表達(dá)CD86、MHC-Ⅱ、CD11b、CD16等，并釋放一系列炎癥因子、趨化因子、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶、NO等參與機體炎癥反應(yīng)[20-21]。M2型小膠質(zhì)細(xì)胞高表達(dá)YM1、Arginase-1、CD206、血紅素氧合酶-1和胰島素樣生長因子-1等，其中Arginase-1與修復(fù)再生能力有關(guān)，是M2型小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物[22]。M2型小膠質(zhì)細(xì)胞主要分泌抗炎因子（IL-10、IL-13、TGF-β）及神經(jīng)營養(yǎng)因子如胰島素樣生長因子、血管內(nèi)皮生長因子等減輕炎癥反應(yīng)，鈍化促炎態(tài)細(xì)胞，促進(jìn)損傷修復(fù)，保護(hù)神經(jīng)元，從而維持中樞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[23]。

研究發(fā)現(xiàn)，TSPJ 對LPS 誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 炎癥有保護(hù)作用[24]，能減少NO、IL-1β、TNF-α分泌，降低誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)和NF-κB活化。本研究通過體外實驗發(fā)現(xiàn)，高濃度TSPJ 能減少LPS 誘導(dǎo)的BV2 細(xì)胞促炎因子TNF-α、IL-1β分泌，增加抗炎因子IL-4、IL-10分泌，促進(jìn)BV2細(xì)胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)化，維持M1/M2平衡。因此后續(xù)實驗選擇TSPJ高濃度進(jìn)行機制研究。

自噬是將一些需降解的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器等胞質(zhì)成分包裹，并最終運送至溶酶體降解的過程。正常情況下，細(xì)胞很少發(fā)生自噬，當(dāng)存在誘發(fā)因素，細(xì)胞保持基礎(chǔ)的自噬活性即可維持自身穩(wěn)定。LC3是自噬起始因子，存在LC3Ⅰ和LC3Ⅱ 2種形式，LC3Ⅰ散在分布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，自噬發(fā)生時，LC3Ⅰ可被招募至自噬體膜上，酶解掉一小段多肽轉(zhuǎn)變?yōu)長C3Ⅱ并定位于自噬體內(nèi)膜和外膜，LC3Ⅱ始終穩(wěn)定地保留在自噬體膜上直到與溶酶體融合，因此被作為自噬體的標(biāo)記。LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值越大，表明自噬水平越高[25]。通過免疫熒光檢測LC3 表達(dá)可初步確定TSPJ 能促進(jìn)自噬發(fā)生。Beclin1是自噬相關(guān)基因Atg6的同源基因，定位于高爾基體，通過與PI3K形成復(fù)合物調(diào)控自噬小體的形成，在自噬早期階段發(fā)揮啟動作用，一般用Beclin1作為自噬啟動階段活化的標(biāo)志分子，其表達(dá)升高可看作是自噬增強的標(biāo)志[26]。另外由于自噬體的形成加速了自噬通量，有助于降解p62蛋白，p62是一種泛素結(jié)合蛋白，介導(dǎo)底物與LC3的結(jié)合，從而被選擇性地轉(zhuǎn)移到自噬體中進(jìn)行降解。p62通常被看作自噬降解蛋白質(zhì)底物的標(biāo)志性分子[27]。自噬被誘導(dǎo)時，p62定位在自噬小體并被遞送到自噬溶酶體降解；相反，如果抑制自噬，p62蛋白會積累在自噬小體。本研究Western blot結(jié)果表明，TSPJ能上調(diào)LC3Ⅱ和Beclin1蛋白表達(dá)，下調(diào)p62蛋白表達(dá)，配合自噬抑制劑3-MA，說明TSPJ作用于BV2細(xì)胞能誘導(dǎo)自噬。

Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶，在哺乳動物中包含Akt1、Akt2和Akt3 3種亞型，也是PI3K信號的下游分子。mTOR復(fù)合體（mTORC）2和其他潛在激酶可使Akt磷酸化。Akt的激活和穩(wěn)定性受多層磷酸化的調(diào)控。激活的Akt可使大量底物磷酸化，在生理和病理上均能引起機體細(xì)胞功能改變，包括細(xì)胞存活、生長、代謝、腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移。mTOR是一種非典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是多條信號通路的交匯點，通過對上下游信號的傳導(dǎo)影響細(xì)胞自噬，是調(diào)控自噬的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[28]。Akt/mTOR信號通路在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)過程中起關(guān)鍵作用，是參與細(xì)胞生長和代謝的關(guān)鍵途徑，有助于維持眾多環(huán)境信號的正常運行。本研究結(jié)果顯示，LPS刺激BV2細(xì)胞后，p-Akt、p-mTOR蛋白表達(dá)升高，TSPJ 能抑制p-Akt、p-mTOR 表達(dá)，與Akt通路抑制劑GSK690693合用時抑制效果增強。說明TSPJ可能通過抑制Akt/mTOR通路磷酸化促進(jìn)BV2細(xì)胞自噬。

綜上所述，TSPJ能抑制LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)炎癥因子分泌，其機制與抑制Akt/mTOR信號通路磷酸化，促進(jìn)細(xì)胞自噬有關(guān)。