韓栩珂 ，周冬祺 ，王佳藝 ，朱嬋 ，邱現(xiàn)良 ，陳一丁 ，陳秋

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712046； 2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川 成都 610072；3.泰康西南醫(yī)學(xué)中心，四川 成都 610213； 4.四川大學(xué)華西第二醫(yī)院，四川 成都 610021

糖尿病神經(jīng)源性膀胱（diabetic neurogenic bladder，DNB）是糖尿病常見的慢性神經(jīng)病變之一，主要表現(xiàn)為膀胱儲(chǔ)排尿功能異常，通常被描述為膀胱感覺下降、順應(yīng)性和容量增加、逼尿肌收縮力受損的三聯(lián)征[1-2]。糖尿病患者DNB發(fā)病率為40%～80%，血糖控制理想的情況下仍為25%，在糖尿病進(jìn)展10年后出現(xiàn)DNB癥狀的概率高達(dá)50%[3-5]。垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽（PACAP）在膀胱平滑肌收縮舒張過(guò)程中發(fā)揮重要作用[6]，可能是治療DNB的關(guān)鍵靶點(diǎn)[7]。PACAP對(duì)膀胱平滑肌的調(diào)控依賴于環(huán)磷酸腺苷（cAMP），此外，作為cAMP關(guān)鍵底物的蛋白激酶A（PKA）也是影響平滑肌功能的重要分子[8]。膀胱平滑肌收縮活動(dòng)受肌球蛋白系統(tǒng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平變化引起的磷酸化、去磷酸化影響[9]。肌球蛋白系統(tǒng)相關(guān)收縮元件，如肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）和肌球蛋白輕鏈（MLC）在調(diào)控膀胱儲(chǔ)尿排尿過(guò)程中起關(guān)鍵作用[10-13]。

針刺被廣泛用于治療膀胱功能障礙和改善神經(jīng)功能[14-15]。研究報(bào)道，電針能有效抑制大鼠膀胱過(guò)度活動(dòng)，改善膀胱順應(yīng)性，減少膀胱組織病理?yè)p傷，從而改善膀胱功能[16-17]。但其治療DNB的效應(yīng)機(jī)制尚不明確。因此，本研究通過(guò)建立DNB大鼠模型，觀察電針對(duì)膀胱肌球蛋白系統(tǒng)PACAP/cAMP/PKA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響，探討針刺治療DNB的效應(yīng)機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

50只SPF級(jí)健康SD大鼠，雌性，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，動(dòng)物許可證號(hào)SYXK（川）2019-189。飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室，溫度（22±2）℃，相對(duì)濕度50%～60%，12 h明暗交替，自由攝食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后實(shí)驗(yàn)。本研究經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批（2020SL012）。

1.2 主要試劑及儀器

鏈脲佐菌素（STZ，貨號(hào)S0130，Sigma公司），檸檬酸緩沖液（貨號(hào)C2488，Sigma公司），戊巴比妥鈉（貨號(hào)11715，Sigma公司），PACAP38、cAMP、PKA ELISA 試劑盒（貨號(hào)分別為ZC-54700、ZC-36711、ZC-36517，上海茁彩生物科技有限公司），BCA蛋白定量試劑盒（貨號(hào)P0009，上海碧云天生物），蛋白提取試劑盒（貨號(hào)P0033，上海碧云天生物），β-actin（貨號(hào)AC026，Abclonal公司），p-MLCK抗體（貨號(hào)ab200809，Abcam），p-MLC 抗體（貨號(hào)ab2480，Abcam）。一次性無(wú)菌不銹鋼針灸針（規(guī)格0.25 mm×25 mm，可孚醫(yī)療科技有限公司）。

SDZ-V電針儀（華佗醫(yī)療科技有限公司），Ⅰ型710血糖儀及血糖試紙（江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司），PHD22/2000微量灌注泵（Harvard儀器），TGL-16G臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭儀器廠），GBS002尿動(dòng)力學(xué)分析儀（Laborie公司），MyLabTMSix智能型超聲診斷儀（Esaote公司），PowerPacTM-1645070轉(zhuǎn)印電泳儀（Bio-Rad公司），ChemiDocTMTouch ECL發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司），JEM-1400PLUS透射電子顯微鏡（JEOL有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組、造模及干預(yù)

50只大鼠隨機(jī)分為正常組（10只）和造模組（40只），正常組常規(guī)飼料喂養(yǎng)，造模組在前期造模方法[18]基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)4周后，單次腹腔注射1%STZ溶液35 mg/kg，3 d后尾靜脈采血檢測(cè)空腹血糖，≥16.7 mmol/L為糖尿病大鼠，繼續(xù)高脂高糖飼料喂養(yǎng)8 周，以飼養(yǎng)籠內(nèi)墊料呈常態(tài)性潮濕為DNB模型造模成功。

將30只DNB大鼠隨機(jī)分為模型組、電針組和假電針組，每組10只，電針組參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[19]取穴，雙側(cè)“腎俞”“膀胱俞”“中髎”斜刺約5 mm，雙側(cè)“三陰交”直刺約3 mm。得氣后，單側(cè)“腎俞”（正極）、“膀胱俞”（負(fù)極）為一組，“中髎”（正極）、“三陰交”（負(fù)極）為一組，2 組腧穴同時(shí)電刺激（疏波10 Hz、密波50 Hz），以大鼠肢體輕微抖動(dòng)、不嘶叫為度，次日換為對(duì)側(cè)組穴。每次30 min，每日1次，每周連續(xù)5次，連續(xù)8周。假電針組僅將針身固定于相同體表位置，但不刺入穴位，其余操作與電針組相同，但電針儀電源關(guān)閉。干預(yù)期間繼續(xù)高脂高糖飼料喂養(yǎng)。正常組和模型組僅固定，不干預(yù)。

2.2 一般狀況觀察

觀察造模前后大鼠精神狀態(tài)、皮毛光澤度及活動(dòng)度，分別于造模第0、4、8周記錄大鼠體質(zhì)量和空腹血糖。第8周將大鼠移入代謝籠，檢測(cè)24 h尿量。

2.3 糖耐量檢測(cè)

電針干預(yù)結(jié)束后，大鼠禁食12 h，尾靜脈采血檢測(cè)空腹血糖后，腹腔注射50%葡萄糖2 g/kg，于注射后15、30、60、120 min尾靜脈采血檢測(cè)大鼠血糖。

2.4 尿流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)

腹腔注射戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉大鼠，仰臥位固定，將導(dǎo)尿管經(jīng)尿道緩慢插入膀胱，并通過(guò)三通管連接至尿動(dòng)力儀和微量灌注泵，待壓力曲線穩(wěn)定后記錄膀胱壓力。以生理鹽水灌注膀胱（0.3 mL/min），檢測(cè)大鼠尿流動(dòng)力學(xué)參數(shù)（膀胱最大容量、膀胱基礎(chǔ)壓、漏尿點(diǎn)壓和膀胱順應(yīng)性），每只大鼠重復(fù)檢測(cè)3次，取平均值。

2.5 取材

尿流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)結(jié)束后，迅速切取完整膀胱，用預(yù)冷生理鹽水洗凈，濾紙吸干水分，稱量膀胱質(zhì)量。將部分膀胱組織投入液氮，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.6 透射電鏡觀察

切取1 mm×3 mm膀胱組織樣品，用4%戊二醛和1%四氧化鋨固定2 h，丙酮（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%）梯度脫水，包埋，將樣品切成50 nm超薄切片，醋酸鈾室溫染色15 min，檸檬酸鉛染色2 min，透射電鏡下觀察并拍攝圖像。

2.7 ELISA檢測(cè)

取適量膀胱組織，加9倍量生理鹽水制成10%組織勻漿，平衡至室溫后，根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)膀胱組織PACAP38、cAMP和PKA含量。

2.8 Western blot檢測(cè)

使用蛋白提取試劑盒提取膀胱組織總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。按照30 μg/孔上樣，電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，用5%BSA室溫封閉1 h，滴加p-MLCK、p-MLC一抗（1∶1 000）和β-actin一抗（1∶100 000），4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，每次10 min，滴加二抗，室溫孵育3 h，采用ECL法進(jìn)行顯影分析。以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 造模前后一般狀況

造模過(guò)程中，正常組大鼠體質(zhì)量逐漸增加，血糖平穩(wěn)，精神狀態(tài)、活動(dòng)正常，反應(yīng)靈敏，皮毛光澤，飼養(yǎng)籠內(nèi)墊料干燥；造模組大鼠尿量增多，反應(yīng)遲緩，皮毛晦黯無(wú)光，飼養(yǎng)籠內(nèi)處于持續(xù)性潮濕狀態(tài)。與正常組比較，造模組大鼠第4 周體質(zhì)量明顯增加（P＜0.05），空腹血糖明顯升高（P＜0.05）；第8周體質(zhì)量明顯降低（P＜0.05），空腹血糖明顯升高（P＜0.05），24 h尿量增多（P＜0.05）。見表1。

表1 大鼠造模前后一般狀況比較（±s）

表1 大鼠造模前后一般狀況比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05

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4.2 電針對(duì)模型大鼠糖耐量的影響

與正常組比較，模型組大鼠空腹血糖明顯升高（P＜0.05），注射葡萄糖后15、30、60、120 min血糖明顯升高；與模型組比較，電針組和假電針組大鼠注射葡萄糖后血糖差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠糖耐量比較（±s，mmol/L）

表2 各組大鼠糖耐量比較（±s，mmol/L）

注：與正常組比較，*P＜0.05

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4.3 電針對(duì)模型大鼠尿流動(dòng)力學(xué)的影響

與正常組比較，模型組大鼠膀胱最大容量、膀胱順應(yīng)性明顯升高（P＜0.05），漏尿點(diǎn)壓明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，電針組大鼠膀胱最大容量和膀胱順應(yīng)性明顯降低（P＜0.05），漏尿點(diǎn)壓明顯升高（P＜0.05），假電針組各指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠尿流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較（±s）

表3 各組大鼠尿流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

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4.4 電針對(duì)模型大鼠膀胱質(zhì)量的影響

與正常組比較，模型組大鼠膀胱質(zhì)量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，電針組大鼠膀胱質(zhì)量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表4 各組大鼠膀胱質(zhì)量比較（±s，mg）

表4 各組大鼠膀胱質(zhì)量比較（±s，mg）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

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4.5 電針對(duì)模型大鼠膀胱組織超微結(jié)構(gòu)的影響

正常組大鼠膀胱組織結(jié)構(gòu)無(wú)異常；模型組大鼠逼尿肌細(xì)胞可見多數(shù)線粒體腫脹，線粒體嵴斷裂，甚至溶解消失，出現(xiàn)少量自噬體；電針組大鼠逼尿肌細(xì)胞可見部分線粒體輕度腫脹；假電針組大鼠逼尿肌細(xì)胞部分線粒體腫脹，線粒體嵴斷裂、溶解甚至消失，少量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張。見圖1。

圖1 各組大鼠膀胱組織超微結(jié)構(gòu)（×12 000）

4.6 電針對(duì)模型大鼠膀胱組織垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽38、環(huán)磷酸腺苷和蛋白激酶A含量的影響

與正常組比較，模型組大鼠膀胱組織PACAP38、cAMP 和PKA 含量明顯減少（P＜0.01）；與模型組比較，電針組大鼠膀胱組織PACAP38、cAMP和PKA含量明顯增加（P＜0.01），假電針組膀胱組織PACAP38、cAMP 和PKA 含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表5。

表5 各組大鼠膀胱組織PACAP38、cAMP和PKA含量比較（±s，pg/mL）

表5 各組大鼠膀胱組織PACAP38、cAMP和PKA含量比較（±s，pg/mL）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01

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4.7 電針對(duì)模型大鼠膀胱組織磷酸化肌球蛋白輕鏈激酶和磷酸化肌球蛋白輕鏈蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠膀胱組織p-MLCK蛋白表達(dá)明顯降低，p-MLC蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，電針組大鼠膀胱組織p-MLCK 蛋白表達(dá)明顯升高，p-MLC 蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。假電針組p-MLCK和p-MLC差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2、表6。

圖2 各組大鼠膀胱組織p-MLCK和p-MLC蛋白免疫印跡

表6 各組大鼠膀胱組織p-MLCK和p-MLC蛋白表達(dá)比較（±s）

表6 各組大鼠膀胱組織p-MLCK和p-MLC蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05

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5 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，DNB病位在膀胱，涉及多個(gè)臟腑。脾氣受損，腎陽(yáng)虧虛是其內(nèi)因。腎陽(yáng)不足，脾氣虛弱，命門火衰，氣化失司，膀胱失約是其主要病機(jī)?！夺樉拇蟪伞酚小爸畜s、下髎主大小便不利”，《證治準(zhǔn)繩》有“小便不通，先艾灸三陰交”。中髎、三陰交是治療膀胱功能障礙相關(guān)疾病常用腧穴[20-21]。“經(jīng)脈所過(guò)，主治所及”，中髎深處有S3 神經(jīng)根前支，三陰交下有L4～S3神經(jīng)根的脛神經(jīng)，深層有L5及S1神經(jīng)節(jié)段，針刺可激活神經(jīng)沖動(dòng)傳導(dǎo)至腰骶部排尿中樞，協(xié)調(diào)逼尿肌和膀胱括約肌節(jié)律性收縮，以調(diào)控膀胱功能[22-23]。腎與膀胱相表里，腎俞與膀胱俞配伍可激發(fā)足太陽(yáng)膀胱經(jīng)氣血，達(dá)增強(qiáng)氣化、通調(diào)氣機(jī)之效。

已有研究使用低劑量STZ聯(lián)合高脂飲食建立2型糖尿病模型研究DNB 的病理機(jī)制，并取得了一些成果[24]。研究發(fā)現(xiàn)，STZ聯(lián)合高脂飲食誘導(dǎo)的DNB大鼠典型特征是血糖和膀胱質(zhì)量增加[25]。本實(shí)驗(yàn)中，模型大鼠膀胱質(zhì)量、24 h尿量和血糖升高，體質(zhì)量降低，提示模型大鼠出現(xiàn)膀胱功能障礙及代償性肥大，符合DNB臨床生理特征和發(fā)病機(jī)制。電針干預(yù)后，模型大鼠膀胱質(zhì)量減少，提示電針能緩解模型大鼠膀胱代償性肥大。DNB典型尿流動(dòng)力學(xué)特征包括膀胱最大容量和膀胱順應(yīng)性增加，漏尿點(diǎn)壓降低[26-28]，與本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M結(jié)果一致。隨著DNB進(jìn)展，Na+-K+-ATP酶代謝紊亂，細(xì)胞凋亡，膀胱感覺降低，最大膀胱容量增加。在代償期膀胱過(guò)度活動(dòng)后，逼尿肌收縮力下降，向失代償期進(jìn)展，順應(yīng)性增加[29-30]。經(jīng)電針干預(yù)后，模型大鼠膀胱最大容量和膀胱順應(yīng)性降低，漏尿點(diǎn)壓升高，說(shuō)明電針能改善模型大鼠膀胱高順應(yīng)性狀態(tài)，雙向調(diào)節(jié)膀胱張力。

作為細(xì)胞能量的供應(yīng)樞紐，逼尿肌細(xì)胞線粒體狀態(tài)決定了膀胱的收縮功能。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病模型大鼠膀胱逼尿肌細(xì)胞線粒體內(nèi)膜受損，部分呈空泡狀[31]。此外，DNB模型大鼠逼尿肌細(xì)胞線粒體出現(xiàn)自噬，推測(cè)高血糖引起線粒體氧化磷酸化功能失衡，ATP合成減少，肌肉收縮和神經(jīng)傳導(dǎo)供能不足，出現(xiàn)膀胱功能障礙[32]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DNB模型大鼠膀胱逼尿肌細(xì)胞部分線粒體腫脹、自噬，電針組大鼠僅出現(xiàn)輕度線粒體腫脹。提示電針可通過(guò)修復(fù)逼尿肌細(xì)胞受損的線粒體，改善氧化磷酸化，恢復(fù)能量代謝，提高膀胱功能的穩(wěn)定性。

膀胱逼尿肌收縮是Ca2+-ATP交互影響的過(guò)程，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平升高與鈣調(diào)蛋白結(jié)合后，會(huì)引起MLCK構(gòu)象改變，從而影響MLC磷酸化水平以分解ATP，使化學(xué)能轉(zhuǎn)化為機(jī)械能，觸發(fā)肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白之間的橫橋擺動(dòng)，以調(diào)控逼尿肌活動(dòng)[33-34]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠膀胱組織p-MLCK蛋白表達(dá)降低，p-MLC蛋白表達(dá)升高，與相關(guān)研究結(jié)果[35-37]一致，提示糖尿病進(jìn)展改變了MLCK活性，促使MLC磷酸化、能量代謝失常及膀胱功能紊亂。電針干預(yù)能上調(diào)模型大鼠膀胱組織p-MLCK蛋白表達(dá)，下調(diào)p-MLC蛋白表達(dá)，調(diào)控能量代謝，改善膀胱功能。PACAP38可催化ATP水解形成cAMP，以活化PKA，使其相關(guān)靶蛋白系統(tǒng)磷酸化[38]，PKA能對(duì)下游肌球蛋白系統(tǒng)收縮元件產(chǎn)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，通過(guò)調(diào)控MLCK和MLC磷酸化改變肌球蛋白ATP酶活性，介導(dǎo)平滑肌收縮舒張[39-42]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠膀胱組織PACAP38、cAMP和PKA含量明顯減少，電針干預(yù)后，模型大鼠膀胱組織PACAP38、cAMP和PKA含量明顯增加。提示上調(diào)PACAP38、cAMP和PKA水平可能是電針治療DNB的始動(dòng)環(huán)節(jié)，進(jìn)而使MLCK磷酸化、MLC去磷酸化，影響能量代謝，改善模型大鼠膀胱功能障礙。

綜上所述，電針通過(guò)激活膀胱組織PACAP/cAMP/PKA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)控肌球蛋白系統(tǒng)磷酸化水平，修復(fù)逼尿肌細(xì)胞受損的線粒體，改善能量代謝以治療DNB。