姜越，趙霞，嚴(yán)花

南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇省兒童呼吸疾?。ㄖ嗅t(yī)藥）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210029

支氣管哮喘是一類由多種炎癥細(xì)胞參與的慢性呼吸道炎癥性疾病，表現(xiàn)為可逆的呼氣性氣流受限，進(jìn)一步發(fā)展可出現(xiàn)不可逆性氣道狹窄和氣道重塑[1]。近年來，哮喘發(fā)病率與病死率呈逐年增長趨勢(shì)[2]。盡管大部分哮喘患者對(duì)西醫(yī)常規(guī)治療反應(yīng)較好，但仍存在一部分對(duì)類固醇治療反應(yīng)欠佳的患者，有效防治哮喘的手段有待補(bǔ)充。中醫(yī)學(xué)注重病證結(jié)合，兼顧疾病所處階段及證型，采用更具針對(duì)性的治療方法，在哮喘防治中有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[3]。

固本防哮飲是中醫(yī)兒科專家江育仁教授的經(jīng)驗(yàn)方，具有補(bǔ)肺固表、健脾化痰功效。臨床研究顯示，該方治療兒童哮喘緩解期安全有效[4]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，固本防哮飲防治哮喘可能與調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、減輕慢性氣道炎癥有關(guān)[5]。細(xì)胞異常凋亡會(huì)誘發(fā)和加重哮喘，其中線粒體損傷誘發(fā)的細(xì)胞凋亡是不可逆的，也是細(xì)胞凋亡效應(yīng)產(chǎn)生的“導(dǎo)火索”[6-7]。本實(shí)驗(yàn)觀察固本防哮飲對(duì)哮喘緩解期小鼠肺組織線粒體凋亡相關(guān)啟動(dòng)因子細(xì)胞色素C（CytC）、B細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）及半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）表達(dá)的影響，探討其防治哮喘氣道重塑的潛在作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)Balb/c小鼠36只，體質(zhì)量16～18 g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（滬）2017-0005。飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度20～22 ℃，濕度50%～70%，12 h光暗循環(huán)，自由進(jìn)食飲水。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批（202012A054）。

1.2 藥物

固本防哮飲由炙黃芪 15 g、黨參10 g、白術(shù)10 g、茯苓10 g、煅牡蠣15 g、蟬蛻10 g、陳皮6 g、防風(fēng)6 g、辛夷6 g、五味子6 g、甘草3 g組成。飲片購于南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，經(jīng)常規(guī)煎煮、濃縮后，制成含原藥材3.6 g/mL溶液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。孟魯司特鈉片，10 mg/片，杭州默沙東藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)K004567。將藥片粉碎，用蒸餾水溶解，配制成0.26 mg/mL溶液。

1.3 主要試劑及儀器

呼吸道合胞病毒（RSV）long株病毒，凍存于江蘇省兒童呼吸疾?。ㄖ嗅t(yī)藥）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冰箱備用；卵蛋白（OVA，批號(hào)326A058），美國Sigma 公司；小鼠白細(xì)胞介素（IL）-17A ELISA試劑盒（批號(hào)E-EL-M0047c）、神經(jīng)生長因子（NGF）ELISA試劑盒（批號(hào)E-EL-M0815c），武漢伊萊瑞特；兔抗小鼠Bcl-2抗體（批號(hào)26593-1-AP）、兔抗小鼠Caspase-3 抗體（批號(hào)19677-1-AP），美國Proteintech公司；山羊抗兔多克隆二抗（批號(hào)ab6721），英國Abcam公司；β-actin抗體（批號(hào)YM1206）、BCA 蛋白定量試劑盒（批號(hào)23227）、DEPC水（批號(hào)R0021）、總RNA提取試劑盒（批號(hào)9109）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)RR306A）、qPCR定量試劑盒（批號(hào)RR820A），加拿大ABM公司?；瘜W(xué)發(fā)光成像儀（型號(hào)Chemi-Doc），美國Bio-Rad 公司；Western blot電泳儀（型號(hào)BioPhotometer），美國Bio-Rad公司；Semi-dry transfer半干轉(zhuǎn)膜儀（型號(hào)TE77），美國GE 公司； 蛋白核酸分析儀（ 型號(hào)BioPhotometer）、PCR 自動(dòng)化系列化分析儀（型號(hào)AG22332），德國Eppendorf 公司；熒光定量PCR 儀（型號(hào)QuantStudio7 Flex），美國Life technologies公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組、造模及給藥

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、孟魯司特鈉組及固本防哮飲低、中、高劑量組，每組6只。參照課題組前期方法[8]制備哮喘緩解期小鼠模型：第1、8 日予0.2 mL 致敏液（OVA 100 μg、氫氧化鋁1 mg溶于生理鹽水）腹腔注射致敏，第15 日開始霧化吸入2.5%OVA 霧化劑激發(fā)30 min，1 次/d，連續(xù)14 d；第32～54日將霧化頻次改為3 d激發(fā)1 次，每次30 min，共8 次。第29、42、55 日予RSV 50 μL/只滴鼻誘導(dǎo)激發(fā)。以小鼠肺組織有炎癥浸潤及氣道膠原沉積表現(xiàn)認(rèn)定造模成功。

第56日起，孟魯司特鈉組按2.6 mg/kg灌胃孟魯司特鈉溶液，固本防哮飲低、中、高劑量組分別按12、24、36 g/kg灌胃固本防哮飲溶液，正常組和模型組灌胃等體積蒸餾水，連續(xù)30 d。末次給藥后24 h，麻醉小鼠，脫頸處死，取肺組織放于液氮中，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 Masson染色觀察肺組織氣道膠原纖維沉積

肺組織經(jīng)多聚甲醛固定后，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋，切片，切片常規(guī)脫蠟至水，滴加Masson復(fù)合染色液染色5 min，蒸餾水沖洗，滴加磷鉬酸染色5 min，甩干，滴加苯胺藍(lán)染色液染色5 min，蒸餾水沖洗3 s，分化液分化30～60 s，重復(fù)2次，無水乙醇脫水3次，每次2 min，二甲苯透明3次，每次1～2 min，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察。

2.3 qPCR檢測(cè)

按照總RNA提取試劑盒步驟提取肺組織RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)說明書進(jìn)行PCR，采用SYBR Green Master Mix選取20 μL反應(yīng)體系。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、30～34 s，共40 個(gè)循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

2.4 免疫組化染色

石蠟切片脫蠟水化，抗原修復(fù)，使用3%H2O2室溫孵育10 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS洗滌后封閉，室溫孵育1 h，蒸餾水洗滌，滴加CytC一抗（1∶2 000），4 ℃孵育過夜，滴加二抗，室溫孵育1 h，洗滌后DAB顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，脫水，封片，顯微鏡下觀察，陽性表達(dá)呈黃色或棕色顆粒。隨機(jī)選擇3個(gè)不同視野，Image J軟件統(tǒng)計(jì)陽性染色面積。

2.5 Western blot檢測(cè)

稱取10～15 mg肺組織，分別加入裂解液300 μL，研磨使充分裂解，4 ℃、13 000 r/min離心30 min，取上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度，將上樣蛋白濃度定為2 μg/μL。用10%分離膠電泳，轉(zhuǎn)膜后置于5%脫脂奶粉中封閉1 h，加入CytC一抗（1∶200）、Bcl-2（1∶1 000）、Caspase-3 一抗（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，加二抗，室溫孵育1 h，ECL發(fā)光液曝光成像。用Image J軟件進(jìn)行灰度分析，以目的蛋白灰度值與內(nèi)參灰度值比值計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2.6 ELISA檢測(cè)肺組織白細(xì)胞介素-17A、神經(jīng)生長因子含量

稱取10～15 mg 肺組織，按1∶9（W/V）加入PBS，使用研磨儀充分研磨，4 ℃、15 000×g離心10 min，取上清液，BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，將濃度定為3 μg/μL，按照ELISA試劑盒說明書步驟檢測(cè)肺組織勻漿IL-17A、NGF含量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 固本防哮飲對(duì)模型小鼠肺組織氣道膠原沉積的影響

Masson染色中膠原纖維呈藍(lán)色。與正常組比較，模型組小鼠肺組織氣道中大量膠原纖維沉積，附著于氣道壁周圍，氣道壁增厚；固本防哮飲各劑量組及孟魯司特鈉組小鼠肺組織氣道中膠原纖維沉積較模型組減少，氣道壁變薄，炎性浸潤減輕。見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織形態(tài)（Masson染色，×400）

4.2 固本防哮飲對(duì)模型小鼠肺組織細(xì)胞色素C、B細(xì)胞淋巴瘤-2、半胱氨酸蛋白酶-3 mRNA表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組小鼠肺組織CytC mRNA表達(dá)顯著升高（P＜0.01），Bcl-2 mRNA表達(dá)顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，固本防哮飲各劑量組及孟魯司特鈉組CytC mRNA表達(dá)顯著降低（P＜0.01），固本防哮飲各劑量組Bcl-2 mRNA 表達(dá)顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），固本防哮飲高劑量組Caspase3 mRNA表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；孟魯司特鈉組和固本防哮飲各劑量組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組小鼠肺組織CytC、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表達(dá)比較（±s）

表2 各組小鼠肺組織CytC、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表達(dá)比較（±s）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

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4.3 固本防哮飲對(duì)模型小鼠肺組細(xì)胞色素C 表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組小鼠肺組織CytC表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，固本防哮飲各劑量組及孟魯司特鈉組CytC表達(dá)不同程度降低，以固本防哮飲低、中劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。見圖2、表3。

圖2 各組小鼠肺組織CytC陽性表達(dá)（免疫組化染色，×200）

表3 各組小鼠肺組織CytC陽性表達(dá)比較（±s，陽性染色面積）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

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4.4 固本防哮飲對(duì)模型小鼠肺組織細(xì)胞色素C、B細(xì)胞淋巴瘤-2、半胱氨酸蛋白酶-3蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組小鼠肺組織CytC 和Caspase-3蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，固本防哮飲低劑量組CytC蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），固本防哮飲各劑量組Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05），固本防哮飲低、中劑量組和孟魯司特鈉組Caspase-3蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.01）；孟魯司特鈉組和固本防哮飲各劑量組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3、表4。

圖3 各組小鼠肺組織CytC、Bcl-2、Caspase-3蛋白免疫印跡

表4 肺組織CytC、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)比較（±s）

表4 肺組織CytC、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

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4.5 固本防哮飲對(duì)模型小鼠肺組織白細(xì)胞介素-17A、神經(jīng)生長因子含量的影響

與正常組比較，模型組小鼠肺組織IL-17A、NGF含量顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，固本防哮飲低劑量組IL-17A含量顯著減少（P＜0.05），固本防哮飲各劑量組和孟魯司特鈉組NGF含量顯著減少（P＜0.05，P＜0.01）；孟魯司特鈉組和固本防哮飲各劑量組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表5。

表5 各組小鼠肺組織IL-17A、NGF含量比較（±s）

表5 各組小鼠肺組織IL-17A、NGF含量比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

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5 討論

支氣管哮喘屬中醫(yī)學(xué)“哮病”“喘證”范疇，病位在肺，關(guān)聯(lián)脾腎兩臟，甚則累及于心。其反復(fù)發(fā)作，遷延不愈，致肺陰耗傷、脾陽受損、腎之陰陽虧虛，進(jìn)一步加重肺、脾、腎三臟損耗。支氣管哮喘緩解期主要病機(jī)為虛、痰、瘀，痰飲內(nèi)伏于肺，肺虛行氣無力，脾虛運(yùn)化失常，聚濕成痰，痰瘀互結(jié)，治療當(dāng)以補(bǔ)益臟腑之氣，兼舒暢氣機(jī)為主[9]。固本防哮飲以扶正固本思想為依據(jù)，方中炙黃芪為君藥，益肺固表止汗；陳皮、黨參、白術(shù)、茯苓為臣，助黃芪培土生金，益氣健脾、燥濕化痰；防風(fēng)、蟬蛻、辛夷為佐，疏風(fēng)解表、宣通鼻竅，五味子同為佐藥，斂肺止咳，助黃芪固表斂汗；煅牡蠣、甘草為使，調(diào)和方中諸藥，協(xié)助黃芪斂陰潛陽、固澀止汗。全方藥性平和，疏補(bǔ)適宜，散收有度，攻補(bǔ)兼施，共奏補(bǔ)肺固表、健脾化痰之功。臨床及基礎(chǔ)研究顯示，固本防哮飲可有效減少哮喘緩解期慢性氣道炎癥和氣道膠原沉積，緩解氣道重塑[10-13]。

氣道重塑是哮喘反復(fù)發(fā)作、遷延不愈的重要因素。因此在哮喘緩解期除重視減緩氣道慢性炎癥，還應(yīng)加強(qiáng)對(duì)氣道重塑的防治。有學(xué)者認(rèn)為，氣道重塑涉及氣道上皮細(xì)胞、氣道平滑肌細(xì)胞等多種細(xì)胞功能變化[14]，支氣管上皮細(xì)胞是保護(hù)氣道免受致病因子侵襲的物理屏障，其反復(fù)損傷-修復(fù)會(huì)直接誘導(dǎo)哮喘慢性氣道炎癥和氣道重塑發(fā)生[15]。細(xì)胞凋亡是機(jī)體主動(dòng)接受基因調(diào)控，排除自身無用及多余細(xì)胞，適應(yīng)有利生存條件，恢復(fù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的自主性有序死亡，又稱細(xì)胞程序性死亡。細(xì)胞凋亡參與和調(diào)控各類氣道細(xì)胞增殖與分化、誘導(dǎo)炎癥因子及趨化因子釋放等[16-17]，在氣道重塑中發(fā)揮重要作用。哮喘病程中存在支氣管上皮細(xì)胞凋亡表現(xiàn)[18]，線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑是調(diào)控細(xì)胞凋亡的中心環(huán)節(jié)[19-20]，Caspase-3和Bcl-2表達(dá)失衡是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡機(jī)制改變、啟動(dòng)線粒體凋亡通路，誘導(dǎo)哮喘氣道重塑的重要原因之一[21]。Caspase-3為促凋亡基因，能反映支氣管上皮細(xì)胞凋亡情況，是Caspase家族重要的蛋白酶，被激活后產(chǎn)生活性，參與水解和切割多種細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白，完成細(xì)胞凋亡的實(shí)施[22-23]。Bcl-2有抑制凋亡作用，主要通過切斷細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，抑制CytC釋放，阻斷下游Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活途徑，使其丟失引起細(xì)胞凋亡的必要條件[24-25]；Caspase-3能夠切割Bcl-2，將其分解成分子量較小的片段，這些片段具有促凋亡作用[26]。因此，上調(diào)Bcl-2、減少CytC釋放和Caspase-3激活可能是抑制細(xì)胞凋亡，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，預(yù)防細(xì)胞過度增殖，減緩哮喘氣道重塑的重要環(huán)節(jié)。

基底膜增厚是氣道重塑的重要指征，哮喘緩解期基底膜出現(xiàn)增厚[12]。IL-17A 和NGF 具有促進(jìn)氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性，誘發(fā)氣道重塑作用[27-29]。本研究Masson染色發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠肺組織氣道中大量膠原纖維沉積，氣道壁增厚，肺組織IL-17A、NGF含量升高，提示存在氣道結(jié)構(gòu)改變和氣道重塑表現(xiàn)，符合哮喘緩解期特征；同時(shí)肺組織Bcl-2蛋白和mRNA表達(dá)降低，CytC、Caspase-3 蛋白及CytC mRNA 表達(dá)升高，表明模型組小鼠氣道內(nèi)出現(xiàn)細(xì)胞凋亡異常情況，提示哮喘氣道重塑的發(fā)生可能與細(xì)胞過度凋亡相關(guān)。固本防哮飲干預(yù)可改善模型小鼠氣道膠原纖維沉積，抑制IL-17A、NGF 釋放，下調(diào)CytC 和Caspase-3 蛋白及mRNA表達(dá)，上調(diào)Bcl-2蛋白及mRNA表達(dá)，提示固本防哮飲可能通過抑制氣道上皮細(xì)胞凋亡，減輕氣道重塑，防治哮喘。

綜上，固本防哮飲可能通過調(diào)控線粒體凋亡通路，抑制氣道上皮細(xì)胞過度凋亡，修復(fù)受損屏障，減輕氣道重塑，發(fā)揮防治哮喘作用。本實(shí)驗(yàn)未深入研究線粒體凋亡途徑在哮喘生理病理過程中扮演的具體角色，未研究細(xì)胞凋亡與上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等的相互關(guān)系，需后續(xù)研究進(jìn)一步完善。