張澤家，楊小琴，高慶和，陳豪特，丁家森，劉劍剛，高瞻

中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，北京 100091

Ⅲ型前列腺炎是一種以長期、反復(fù)骨盆區(qū)域疼痛不適，可伴有不同程度排尿癥狀及性功能障礙為主要臨床表現(xiàn)的疾病，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1]。研究顯示，免疫因素在Ⅲ型前列腺炎的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[2]。中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院高瞻教授基于“內(nèi)癰”理論及臨床經(jīng)驗(yàn)擬定的益氣活血托毒方能顯著緩解Ⅲ型前列腺炎患者臨床癥狀，降低慢性前列腺炎癥狀評(píng)分，減少患者前列腺液中炎癥因子表達(dá)[3]，但其作用機(jī)制尚未完全明確。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，益氣活血托毒方與Ⅲ型前列腺炎的交集靶點(diǎn)主要富集在核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）通路上，故預(yù)測益氣活血托毒方可能通過降低前列腺組織炎癥因子水平，阻止其下游NF-κB抑制物激酶（IKKs）磷酸化及NF-κB抑制蛋白α（IκBα）與NF-κB二聚體解離，從而抑制NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)催化炎癥因子產(chǎn)生和激活免疫反應(yīng)。目前認(rèn)為，Ⅲ型前列腺炎發(fā)病與自身免疫關(guān)系密切，自身免疫性前列腺炎（experimental autoimmune prostatitis，EAP）小鼠模型是研究Ⅲ型前列腺炎的標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物模型之一[4]?；诖?，本研究應(yīng)用前列腺蛋白提純液聯(lián)合弗氏完全佐劑建立EAP小鼠模型，觀察益氣活血托毒方對(duì)EAP小鼠前列腺組織病理變化、炎癥反應(yīng)及免疫功能等方面的影響，探討其治療Ⅲ型前列腺炎的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)8 周齡C57BL/6 雄性小鼠60 只，體質(zhì)量（23±2）g，8 周齡雄性SD 大鼠10 只，體質(zhì)量（180±20）g，斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2019-0030，合格證號(hào)110324211104281256。飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院SPF級(jí)動(dòng)物房，溫度（24±2）℃、濕度50%～70%環(huán)境，動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（京）2018-0018。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院倫理委員會(huì)審批（2021XLC043-2）。

1.2 藥物及制備

益氣活血托毒方由黃芪30 g、黨參15 g、丹參15 g、川芎10 g、白術(shù)10 g、茯苓10 g、熟大黃6 g組成，由中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院制劑室制成浸膏，每克浸膏含原藥材2.5 g。鹽酸坦索羅辛緩釋膠囊，0.2 mg/粒，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，臨用前取膠囊內(nèi)容物，用蒸餾水配制成0.65 μg/mL溶液。

1.3 主要試劑與儀器

弗氏完全佐劑（美國Sigma，批號(hào)SLCB9716），0.5%Triton X-100（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)120320210616），BCA蛋白試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)122120210520），小鼠免疫球蛋白IgG/A/M試劑盒（北京華英生物技術(shù)研究所，批號(hào)20220105BH），血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）試劑盒（北京欣博盛生物，批號(hào)分別為20220105X、20220106X），p-NF-κB p65、IL-1β抗體（英國Abcam 公司，批號(hào)分別為ab86299、ab283818），p-IKK-β、TNF-α抗體（美國GeneTex公司，批號(hào)分別為GTX52310、GTX110520）。

MultiSkan3 型酶標(biāo)儀，美國Thermo 公司；EG1150型病理包埋機(jī)，德國Leica公司；7160型全自動(dòng)生化儀，日本Hitachi公司；DR-200BS型全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀，無錫華衛(wèi)德朗儀器有限公司；Mini P-4型電泳槽、濕轉(zhuǎn)電泳槽，北京凱元信瑞儀器有限公司；PowerPac型電泳儀，美國Bio-Rad公司。

1.4 前列腺蛋白提純液制備

取10只大鼠，常規(guī)飼養(yǎng)7 d，3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉，取前列腺，放入冰生理鹽水中，去除脂肪、膀胱等組織，清洗3～5次，剪碎，加入含0.5% Triton X-100的生理鹽水，冰浴勻漿，4 ℃、15 000 r/min離心30 min[4]，去除上層脂肪組織，取上清液，即得前列腺蛋白提純液，放入凍存管，-20 ℃保存?zhèn)溆?。臨用前用BCA法測定蛋白濃度，根據(jù)蛋白濃度用0.01 mmol/L PBS將蛋白提純液稀釋至15 mg/mL。

1.5 造模

取50只小鼠，肌肉注射氯胺酮（4～6 mg/kg）麻醉，在小鼠雙側(cè)腳掌、雙側(cè)腹股溝及頸部共5處皮下注射0.1 mL前列腺蛋白提純液與0.1 mL弗氏完全佐劑的混合液[4-5]。造模0、15、30 d 各注射1 次。造模15、22、30 d各隨機(jī)選取2只小鼠，取前列腺組織進(jìn)行病理檢測，觀察炎癥進(jìn)展情況。造模45 d隨機(jī)選取4只小鼠，取前列腺組織進(jìn)行病理檢測，若見黏膜皺襞消失，腺上皮破壞，間質(zhì)明顯腫脹、模糊，有大量炎癥細(xì)胞浸潤，表明模型制備成功[4]。

1.6 分組及給藥

將造模成功的40只小鼠隨機(jī)分為模型組、西藥組和中藥低、高劑量組，每組10只。另取10只小鼠作為空白組。造模成功次日開始給藥，中藥低劑量組按人與小鼠等效劑量換算[6]，益氣活血托毒方浸膏4.8 g/kg，高劑量組劑為9.6 g/kg，西藥組予0.65 μg/mL鹽酸坦索羅辛溶液灌胃，灌胃體積0.4 mL/只，模型組和空白組予等體積飲用水灌胃，每日1次，連續(xù)4周。

1.7 指標(biāo)檢測

1.7.1 小鼠一般狀況

造模及給藥期間，觀察小鼠生活狀態(tài)及體征，造模期間每15 d記錄1次體質(zhì)量，給藥期間每2周記錄1次體質(zhì)量。

1.7.2 血清炎癥因子和免疫因子檢測

給藥結(jié)束后，肌肉注射氯胺酮麻醉，眼球取血，4 ℃、2 500 r/min離心10 min，取血清，根據(jù)ELISA試劑盒說明書操作，酶標(biāo)儀檢測吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清TNF-α、IL-1β、IgA、IgG、IgM含量。

1.7.3 前列腺組織病理觀察

末次給藥后24 h脫頸處死小鼠，分離前列腺組織，于10%福爾馬林溶液固定72 h后石蠟包埋，組織切片，37 ℃烤片12 h，脫蠟復(fù)水，HE染色后封片，光鏡下觀察前列腺組織病理變化。

1.7.4 Weston blot檢測蛋白表達(dá)

取前列腺組織，以組織質(zhì)量∶裂解液體積=1∶9比例加入RIPA裂解液，15 000 r/min勻漿，每次10 s，間隔10 s，重復(fù)3次。冰孵20 min，4 ℃、13 000 r/min離心20 min，取上清液，BCA法測定蛋白濃度，以RIPA裂解液調(diào)整蛋白濃度，加入5×上樣緩沖液，使蛋白終濃度為4 mg/mL，煮沸變性5 min。5%濃縮膠電泳，恒壓90 V、20 min，12%分離膠，恒壓160 V，通過預(yù)染蛋白marker確定電泳停止時(shí)間。300 mA轉(zhuǎn)至NC膜。3%BSA 封閉，加入p-NF-κB p65 一抗（1∶1 000）、p-IKK-β一抗（1∶1 000）、TNF-α一抗（1∶2 000）、IL-1β一抗（1∶1 000），4 ℃孵育過夜。TBST 洗膜，加入HRP-山羊抗兔IgG（1∶10 000）孵育1 h，洗膜，ECL顯影。以β-actin為內(nèi)參，Total Lab Quant 11.5讀取積分光密度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8.3.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。計(jì)量資料用xˉ±s表示，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊用方差分析，不滿足正態(tài)分布或方差不齊用非參數(shù)檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 益氣活血托毒方對(duì)模型小鼠一般狀況的影響

模型組小鼠第1次皮下注射前列腺蛋白提純液+弗氏完全佐劑后活力明顯減弱，可見皮丘逐漸吸收。至注射后第14日，活力基本恢復(fù)，煩躁情緒明顯，尿量明顯增加，部分小鼠有未吸收皮丘。第2次皮下注射后活力較前明顯減弱，尿量稍有減少，可見明顯未吸收皮丘。西藥組及中藥高、低劑量組小鼠一般狀況均較模型組有所改善。

與空白組比較，模型組小鼠造模15 d體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），造模30、45 d小鼠體質(zhì)量明顯減少（P＜0.01）。與模型組比較，中藥低、高劑量組及西藥組小鼠給藥14 d體質(zhì)量明顯增加（P＜0.05，P＜0.01），中藥高劑量組小鼠給藥28 d體質(zhì)量高于西藥組和中藥低劑量組。見圖1。

圖1 各組小鼠造模和給藥期間體質(zhì)量變化（±s，每組10只）

2.2 益氣活血托毒方對(duì)模型小鼠血清炎癥因子和免疫因子含量的影響

與空白組比較，模型組小鼠血清TNF-α、IL-1β、IgA、IgG、IgM含量明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，中藥低、高劑量組和西藥組小鼠血清TNF-α、IL-1β含量明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），中藥高劑量組小鼠血清IgA、IgG、IgM含量明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。見圖2、圖3。

圖2 各組小鼠血清TNF-α、IL-1β含量比較（±s，每組10只）

圖3 各組小鼠血清IgA、IgG、IgM含量比較（±s，每組10只）

2.3 益氣活血托毒方對(duì)模型小鼠前列腺組織形態(tài)的影響

與空白組比較，模型組小鼠前列腺腺體周圍可見散在炎癥細(xì)胞，腺體顯著擴(kuò)張、增大，腺腔內(nèi)大量粉紅色分泌物，腺上皮呈扁平狀，間質(zhì)水腫明顯；西藥組小鼠腺體周圍間質(zhì)散在炎癥細(xì)胞浸潤，腺腔中等、大小不一，腔內(nèi)有分泌物，腺上皮厚薄不一、呈扁平狀，黏膜皺襞結(jié)構(gòu)正常，間質(zhì)可見水腫；中藥低劑量組小鼠腺體周圍間質(zhì)未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤，或極少量炎癥細(xì)胞浸潤，腺腔偏小、大小不一，腔內(nèi)有少量分泌物，腺上皮偏厚，多數(shù)黏膜皺襞結(jié)構(gòu)正常；中藥高劑量組小鼠腺體周圍間質(zhì)未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤，或極少量炎癥細(xì)胞浸潤，腺腔大小均勻，腺上皮較厚，黏膜皺襞結(jié)構(gòu)正常。見圖4。

圖4 各組小鼠前列腺組織形態(tài)（HE染色，×10）

2.4 益氣活血托毒方對(duì)模型小鼠前列腺組織蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組小鼠前列腺組織p-NF-κB p65、p-IKK-β、TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.01，P＜0.05）；與模型組比較，中藥高劑量組小鼠前列腺組織p-NF-κB p65、p-IKK-β、TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01，P＜0.05）。見圖5、圖6。

圖5 各組小鼠前列腺組織p-NF-κB p65、p-IKK-β、TNF-α、IL-1β蛋白免疫印跡

圖6 各組小鼠前列腺組織p-NF-κB p65、p-IKK-β、TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)比較（±s，每組10只）

3 討論

Ⅲ型前列腺炎屬中醫(yī)學(xué)“精濁”“尿頻”等范疇[7]，其病因主要與外感六淫、飲食不節(jié)、房勞過度、久立久坐等相關(guān)[8]。濕、熱、瘀、虛貫穿本病始終，臨床證型以復(fù)合型為主[9]。課題組前期觀察發(fā)現(xiàn)，本病患者存在氣虛血瘀的病機(jī)基礎(chǔ)，應(yīng)用益氣活血托毒方益氣活血、托毒外出，臨床療效顯著[3，10]。益氣活血托毒方在四君子湯基礎(chǔ)上，以黨參易人參，補(bǔ)脾益氣；黃芪為“補(bǔ)氣圣藥”，與黨參協(xié)同，益氣健脾，共為君藥，同時(shí)黃芪可托毒排膿，發(fā)揮“補(bǔ)托”之功。丹參活血化瘀生新，川芎活血行氣，二者一寒一溫，調(diào)和藥性，共為臣藥。白術(shù)、茯苓補(bǔ)氣健脾、燥濕利水，改善排尿癥狀，共為佐藥。熟大黃逐瘀通經(jīng)、涼血解毒、引藥入經(jīng)，為使藥。全方配伍契合Ⅲ型前列腺炎病機(jī)特點(diǎn)，扶正祛邪，從而起到改善和逆轉(zhuǎn)前列腺炎炎性改變的作用。

前列腺組織病理觀察是評(píng)價(jià)EAP模型的主要指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)可見模型組小鼠前列腺腺體周圍散在炎癥細(xì)胞，腺體顯著擴(kuò)張、增大，腺腔內(nèi)大量分泌物，腺上皮呈扁平狀，間質(zhì)水腫明顯，符合模型標(biāo)準(zhǔn)[4]。經(jīng)藥物干預(yù)后，西藥組和中藥低、高劑量組均有不同程度改善，其中中藥高劑量組改善最明顯。與空白組比較，模型組小鼠體質(zhì)量增長受到嚴(yán)重影響，經(jīng)藥物干預(yù)后，小鼠體質(zhì)量增長速度回升，隨給藥時(shí)間延長，中藥高劑量組小鼠體質(zhì)量高于西藥組及中藥低劑量組。提示益氣活血托毒方通過長療程的治療可改善機(jī)體內(nèi)環(huán)境，發(fā)揮整體調(diào)節(jié)作用。與空白組相比，模型組小鼠血清炎癥因子及免疫因子含量均升高。經(jīng)藥物干預(yù)后，西藥組和中藥低、高劑量組炎癥因子及免疫因子含量均有所下降，與課題組前期臨床研究[3]一致。表明單獨(dú)應(yīng)用益氣活血托毒方能降低炎癥因子水平。

NF-κB通路在前列腺炎的發(fā)病機(jī)制及炎癥、免疫反應(yīng)中多有涉及[11-13]。TNF-α、IL-1β是NF-κB通路的重要刺激因子[14]，IKKs在NF-κB通路活化的聯(lián)級(jí)反應(yīng)中起核心作用[15]，其中IKK-β是IKKs的重要組成之一[16]，p-IKK-β是IKK-β的磷酸化產(chǎn)物，可催化IκBα，使IκBα與NF-κB解體[15]，從而使NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)催化炎癥因子產(chǎn)生和激活免疫反應(yīng)[17]，p-IKK-β在多種炎癥反應(yīng)中過表達(dá)[18-19]。NF-κB p65是NF-κB的亞基之一，p-NF-κB p65是其游離狀態(tài)，p-NF-κB p65表達(dá)升高提示解體的NF-κB增多[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)益氣活血托毒方干預(yù)后，模型小鼠前列腺組織p-NF-κB p65、p-IKK-β、TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)降低，表明益氣活血托毒方改善小鼠EAP 可能與降低p-NF-κB p65、p-IKK-β、TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)，抑制NF-κB通路，減少磷酸化IKKs合成有關(guān)。

敦煌古方大瀉腎湯（茯苓、甘草、制大黃、黃芩各10 g，赤芍、干姜各3 g）可降低EAP大鼠前列腺組織NF-κB p65表達(dá)[21]，前列消湯（滑石20 g，金錢草、板藍(lán)根、丹參、蘆根各15 g，黃柏、蒼術(shù)、虎杖、神曲、厚樸各10 g，苦杏仁、甘草各6 g，細(xì)辛3 g）能降低EAP大鼠前列腺組織NF-κB p65和NF-κB p50表達(dá)[22]。2項(xiàng)研究NF-κB p65表達(dá)降低與本研究結(jié)果一致，但其應(yīng)用藥物以清熱解毒為主，而益氣活血托毒方組成以健脾益氣為主，2種中醫(yī)治法指導(dǎo)下均起到影響NF-κB通路、改善前列腺炎病理作用，其共性部分有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，益氣活血托毒方可改善EAP小鼠前列腺炎癥，其機(jī)制與下調(diào)p-NF-κB p65、p-IKK-β、TNF-α、IL-1β表達(dá)，減少磷酸化IKKs的合成相關(guān)。本研究為闡述益氣活血托毒方治療Ⅲ型前列腺炎提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)，今后將繼續(xù)探索該方起效的主要成分及相應(yīng)機(jī)制。