張逸飛,楊 琪,李 程,李 璐

牙周炎可引起牙齦炎癥、附著喪失、牙周袋形成、牙槽骨吸收甚至牙齒脫落[1],菌群失調(diào)是牙周炎的重要原因[2]。2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)是牙周炎流行率和嚴(yán)重程度增加的風(fēng)險(xiǎn)因素[3]。流行病學(xué)研究表明,T2DM患者牙周炎的發(fā)病率、流行率和易感性增加[4],牙周炎也會反過來增加身體的整體炎癥負(fù)擔(dān),使患有牙周炎的個(gè)體更有可能發(fā)展為T2DM。目前伴T2DM牙周炎患者牙周治療的關(guān)鍵仍是進(jìn)行徹底清創(chuàng),減輕牙周炎癥的同時(shí)也有利于血糖的控制。

近年來隨著光纖的發(fā)展,激光也被應(yīng)用在牙周炎治療中。釔鋁石榴石晶體(neodymium-doped yttrium aluminium garnet,Nd:YAG)激光屬于近紅外激光,由光導(dǎo)纖維傳輸,可激發(fā)脈沖激光或連續(xù)式激光,發(fā)射激光為紅外線,波長1 064 nm。研究表明,Nd:YAG激光可以通過特定頻率產(chǎn)生激光熱能效應(yīng),改變齦下菌群的構(gòu)成,減少牙周致病菌的數(shù)量[5]。

本研究擬采用Nd:YAG激光聯(lián)合齦下刮治和根面平整(scaling and root planning,SRP)對伴T2DM的牙周炎患者進(jìn)行牙周治療,評價(jià)Nd:YAG激光治療對伴T2DM的牙周炎患者牙周炎和血糖控制的臨床療效以及齦下菌斑微生態(tài)的影響,為口腔疾病和糖尿病的聯(lián)合防治提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院機(jī)構(gòu)倫理委員會(No.(2022)622)批準(zhǔn),所有受試者均獲得書面知情同意。選取2021年8月至2022年1月在南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙周病科就診患者。

納入標(biāo)準(zhǔn):①年齡18～80歲;②根據(jù)2018年牙周病國際分類系統(tǒng)的診斷標(biāo)準(zhǔn),診斷為牙周炎Ⅲ期B級或C級患者,至少有6個(gè)位點(diǎn)探診深度(probing depth,PD)≥5 mm;③根據(jù)1999年WHO糖尿病專家委員會共識診斷為T2DM 1年以上,病情穩(wěn)定,無嚴(yán)重糖尿病并發(fā)癥,且研究期間糖尿病用藥無變化;④一般狀況良好,無其他全身性疾病。

排除標(biāo)準(zhǔn):①過去3個(gè)月內(nèi)曾使用抗生素、非甾體類抗炎藥和免疫抑制劑;②在過去6個(gè)月內(nèi)曾接受牙周治療;③患有其他口腔黏膜疾病;④在研究期間妊娠、哺乳或計(jì)劃妊娠的婦女;⑤無法或不愿簽署知情同意書。

1.2 樣本量估算

以PD減少量為主要效應(yīng)指標(biāo),PD預(yù)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)差為1.2 mm,預(yù)設(shè)有差異的激光處理聯(lián)合SRP治療與單純SRP治療的PD差距為2 mm。使用G*Power軟件對樣本量進(jìn)行估算,選擇獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),輸入α=0.05顯著性水平和β=0.2把握度,軟件輸出最小樣本量為每組7例,考慮到10%的失訪率,最終共納入16例患者進(jìn)行分析。

1.3 臨床分組

16例患者抽簽隨機(jī)分為兩組,每組8例。SRP組:齦上潔治后,僅接受SRP治療;Nd:YAG組:齦上潔治后,接受SRP治療與Nd:YAG激光治療。

1.4 臨床檢查與治療

收集符合納入標(biāo)準(zhǔn)患者的年齡、性別、余留牙數(shù)、糖尿病病程、刷牙習(xí)慣等基本信息。全部牙周檢查及治療均由同一名經(jīng)過培訓(xùn)的牙周醫(yī)師完成,在首次就診及治療后3個(gè)月采樣前檢查患者取樣位點(diǎn)的PD、臨床附著喪失(clinical attachment loss,CAL)以及探診出血(bleeding on probing,BOP)陽性率。根據(jù)牙周治療計(jì)劃對患者進(jìn)行詳細(xì)的口腔衛(wèi)生指導(dǎo)和超聲齦上潔治。選擇PD≥5 mm的部位定義為病變部位,1周后,每位患者選擇6個(gè)病變部位進(jìn)行齦下菌斑的采樣,所有受試者在采樣前48 h不得使用任何漱口水,在抽樣訪問前24 h不得采取任何化學(xué)或機(jī)械口腔衛(wèi)生措施。SRP組患者進(jìn)行全口SRP,Nd:YAG組患者還需在SRP治療后進(jìn)行輔助Nd:YAG激光治療,醫(yī)生和患者在激光使用期間均佩戴專用防護(hù)眼鏡。激光處理采用Nd:YAG激光(航天世都,中國),使用照射模式,不激活光纖,能量50 mJ,脈沖頻率為10 Hz,無水無氣,光纖探頭進(jìn)入牙周袋內(nèi),沿牙周袋壁進(jìn)入袋底,再移動至齦緣進(jìn)行提拉式激光照射,照射時(shí)間每個(gè)位點(diǎn)不超過1 min。術(shù)后生理鹽水沖洗,袋內(nèi)涂碘甘油后30 min不進(jìn)食、飲水和漱口。兩組患者治療后采用視覺模擬評分法(visual analogue scale,VAS)記錄術(shù)后疼痛程度,使用一條長約10 cm的線,“0”表示無痛,“10”代表難以忍受的最劇烈疼痛,讓患者在線上進(jìn)行標(biāo)記,并記錄數(shù)據(jù)。治療3個(gè)月后預(yù)約患者復(fù)診,對上述位點(diǎn)進(jìn)行第二次齦下菌斑采樣。

檢查基線以及治療3個(gè)月后患者空腹血糖(fasting plasma glucose,FPG)、糖化血紅蛋白(glycsylated hemoglobin,HbA1c)水平并收集身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)。受試者從納入到數(shù)據(jù)分析過程見圖1。

圖1 治療流程圖Fig.1 Treatment flow chart

1.5 齦下菌斑樣本收集及生物信息學(xué)分析

在每次采集齦下菌斑樣本前,指導(dǎo)患者漱口。用棉卷隔離取樣部位,干燥牙齒表面后,用無菌Gracey刮匙(hu-friedy?,美國)收集齦下菌斑樣本,立即放入Eppendorf管中并置-80 ℃冰箱儲存。

使用PowerSoil?DNA分離試劑盒(安必勝科技有限公司,中國)從齦下菌斑樣本提取總DNA。提取后,根據(jù)保守區(qū)27F-1492R設(shè)計(jì)16S全長引物,用于靶區(qū)PCR擴(kuò)增(10 μL體系,Solexa PCR)。合成的特異性引物(27F-1492R)設(shè)計(jì)如下,27F:AGRGTTTGATYNTGGCTCAG(5′-3′),1492R:TASGGHTACCTTGTTASGACTT(5′-3′)。

隨后對形成的測序庫進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn),并對獲得的高質(zhì)量循環(huán)一致性測序(circular consensus sequencing,CCS)序列進(jìn)行條形碼識別等處理。使用USEARCH軟件(Edgar,RC,美國)對生成的優(yōu)化CCS在97%相似度的水平上進(jìn)行聚類,并根據(jù)操作分類單元(operational taxonomic units,OTUs)的序列組成進(jìn)行物種分類?；贠TUs分析結(jié)果,對樣品在各個(gè)分類水平上進(jìn)行分類學(xué)分析,獲得各樣品在門分類學(xué)水平上的物種分布柱狀圖。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 26.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,具有正態(tài)分布的連續(xù)變量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,不符合正態(tài)分布的連續(xù)變量以中位數(shù)(四分間距差)表示。采用配對樣本t檢驗(yàn)、威爾科克森符號秩檢驗(yàn)或卡方檢驗(yàn)評估組內(nèi)治療前后差異,采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、曼-惠特尼U檢驗(yàn)或卡方檢驗(yàn)評估治療前后的組間差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用線性判別分析效應(yīng)量(line discriminant analysis(LDA)effect size,LEfSe)方法來估算每個(gè)物種豐度對差異效果影響的大小,以LDA score>4.0表示具有顯著差異的物種。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料比較

在隨訪期間無受試者失訪,Nd:YAG組患者男性5例,女性3例,平均年齡(52.4±11.5)歲;SRP組患者男性6例,女性2例,平均年齡(53.5±12.7)歲。兩組受試者余留牙數(shù)、糖尿病病程、刷牙頻率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

表1 研究人群特征Tab.1 Characteristics of the study population

2.2 治療前后兩組牙周臨床指標(biāo)的改變狀況

基線時(shí),Nd:YAG組和SRP組PD、CAL、BOP陽性率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),牙周炎嚴(yán)重程度基本一致。治療后3個(gè)月,兩組PD水平均較基線時(shí)明顯下降(P<0.05),且Nd:YAG組較SRP組改善更明顯(P<0.05);CAL水平在治療前后無明顯改變(P>0.05);治療后3個(gè)月,兩組BOP陽性率均較基線時(shí)顯著下降(P<0.05),但組間差異不明顯(P>0.05)(表2)。

表2 牙周臨床指標(biāo)的改變狀況Tab.2 Changes in periodontal clinical indicators

2.3 治療后兩組血糖相關(guān)指標(biāo)的改變狀況

基線時(shí),Nd:YAG組和SRP組血糖相關(guān)指標(biāo)(FPG、HbA1c、BMI)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療后3個(gè)月,兩組FPG、HbA1c、BMI較基線均略有降低,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且兩組間無明顯差異(P>0.05)(表3)。

表3 血糖相關(guān)指標(biāo)的改變狀況Tab.3 Changes in blood glucose-related indicators

2.4 治療后兩組VAS評分

Nd:YAG組患者VAS評分為5.0±1.5;SRP組患者VAS評分為7.1±1.5,術(shù)后疼痛程度明顯高于Nd:YAG組(P=0.01)。

2.5 治療前后齦下菌斑菌群結(jié)構(gòu)變化

基線時(shí),Nd:YAG組和SRP組齦下菌群的核心微生物組成相似。兩組齦下菌斑菌群在門水平上相對豐度靠前的為擬桿菌門(Bacteroidota)、厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteriota)、彎曲菌門(Campylobacterota)、髕骨細(xì)菌門(Patescibacteria)、螺旋體門(Spirochaetota)、放線菌門(Actinobacteriota)、脫硫桿菌門(Desulfobacterota)和互養(yǎng)菌門(Synergistota)。

治療3個(gè)月后,兩組齦下菌斑的優(yōu)勢菌群均產(chǎn)生了一定變化。其中相對豐度最大的擬桿菌門在Nd:YAG組中呈下降趨勢,梭桿菌門相對豐度上升;而在SRP組的齦下菌斑中,擬桿菌門呈上升趨勢,梭桿菌門相對豐度下降。兩組齦下菌斑中變形菌門、髕骨細(xì)菌門在治療后相對豐度下降(圖2)。

A:Nd:YAG組;B:SRP組圖2 兩組治療前后齦下菌斑在門水平的相對豐度變化Fig.2 Relative abundance of subgingival plaque at phylum level before and after treatment in two groups

2.6 治療前后齦下菌群的差異性分析

基線時(shí),兩組樣本齦下菌群的相對豐度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與基線相比,治療后3個(gè)月Nd:YAG組齦下菌中纖毛菌科、纖毛菌屬為顯著優(yōu)勢菌(P<0.05);SRP組的齦下菌群中擬桿菌門、擬桿菌綱相對豐度顯著上升(P<0.05)。

A:Nd:YAG組;B:SRP組圖3 兩組治療前后差異微生物L(fēng)EfSe分析圖Fig.3 LEfSe analysis of different microorganisms before and after treatment in two groups

3 討 論

SRP是目前治療伴糖尿病牙周炎患者的主要方法,可有效解決牙周炎癥、減少牙周袋深度和增加臨床附著[6]。但由于牙根表面凹陷、根分叉病變、微生物在深牙周袋的再定植等情況,SRP存在一定局限性[7],有時(shí)還需要輔助治療。研究表明,Nd:YAG激光能夠減少齦下牙周致病菌[8],并在止血方面有積極作用[9]。一項(xiàng)評估Nd:YAG激光的研究顯示,在治療中重度牙周炎患者時(shí)SRP具有額外的臨床和微生物益處[10],但Nd:YAG激光輔助SRP對牙周炎癥和血糖狀態(tài)的療效并不統(tǒng)一。一項(xiàng)薈萃分析表明,與單獨(dú)使用SRP相比,Nd:YAG激光輔助SRP治療在降低PD中作用顯著[11]。本研究結(jié)果顯示,治療后3個(gè)月Nd:YAG組和SRP組PD較基線時(shí)明顯下降,且Nd:YAG組較SRP組改善更加顯著,與以往研究一致,可能原因是激光治療后牙根表面生物相容性改善,促使牙根表面形成新附著。但在CAL方面,Sgolastra等[12]發(fā)現(xiàn)Nd:YAG激光輔助SRP后較治療前CAL無明顯差異,本研究也未見明顯變化,可能與Nd:YAG激光對牙周組織的熱效應(yīng)有關(guān)。Nd:YAG激光可引起組織溫度升高而促進(jìn)止血,本研究結(jié)果顯示,Nd:YAG組和SRP組在治療后BOP陽性率都發(fā)生了明顯下降,兩組治療后組間比較無顯著差異,可能是樣本量較小,臨床證據(jù)不足。但Slot[13]等在比較Nd:YAG激光輔助SRP治療與單純SRP治療中,未發(fā)現(xiàn)輔助激光治療對改善牙周炎癥有明顯優(yōu)勢,與本研究結(jié)果不一致,可能是由于激光參數(shù)設(shè)置不同,造成牙周治療結(jié)果不同。

本研究未觀察到治療前后血糖相關(guān)參數(shù)有明顯改善,但在一些研究中,Nd:YAG激光聯(lián)合SRP治療后患者HbA1c水平較僅接受SRP治療明顯降低[14-15],這種結(jié)果差異可能與本研究的小樣本量以及隨訪時(shí)間較短有關(guān),需要進(jìn)一步的長期隨機(jī)對照試驗(yàn),重點(diǎn)使用更多的患者群體。

韓笑等[16]證實(shí),Nd:YAG激光在牙周炎治療中可降低患者的術(shù)后疼痛敏感度。本研究中,Nd:YAG組患者術(shù)后疼痛程度也明顯低于僅進(jìn)行SRP治療患者,可能是由于激光的熱能破壞神經(jīng)末梢感受器,治療區(qū)域的神經(jīng)末梢被熱凝固,使患者術(shù)后疼痛減輕[17]。

菌群分析顯示,Nd:YAG組在治療后齦下菌群中擬桿菌門呈下降趨勢,而在SRP組中,擬桿菌門呈上升趨勢。有研究表明擬桿菌為牙周炎的標(biāo)志病原體之一[18],擬桿菌相對豐度的下降可能是Nd:YAG組牙周炎癥改善的原因。梭桿菌門在Nd:YAG組治療后的齦下菌群中呈上升趨勢,在SRP組中呈下降趨勢,可能提示梭桿菌門中的某些細(xì)菌與牙周健康狀態(tài)相關(guān)。有研究結(jié)果顯示,纖毛菌屬是牙周健康相關(guān)菌屬[19],可抑制牙周炎癥,隨著牙周炎癥狀加重,其數(shù)量減少[20]。Demmer等[21]發(fā)現(xiàn),與健康對照組相比,糖尿病患者中纖毛菌屬豐度更低。本研究菌群分析結(jié)果顯示,Nd:YAG組治療3個(gè)月后,齦下菌斑中纖毛菌科、纖毛菌屬豐度顯著上升。Lu等研究[22]與本試驗(yàn)結(jié)果一致,可能與牙周狀況的改善有關(guān)。SRP組患者治療后齦下菌群中擬桿菌門為顯著優(yōu)勢菌。擬桿菌為牙周致病菌,宋文靜等[23]研究表明,伴T2DM的牙周炎患者接受SRP治療后唾液中的擬桿菌門在治療后1.5個(gè)月時(shí)相對豐度下降,3個(gè)月時(shí)豐度上升,可能是由于單純SRP治療較Nd:YAG激光輔助SRP治療降低牙周致病菌數(shù)量的效應(yīng)無法得到維持。

本研究樣本量較小,隨訪周期較短,未來仍需要更多大規(guī)模的研究來探索牙周炎與T2DM發(fā)病相關(guān)機(jī)制,為牙周和糖尿病的聯(lián)合防控提供更多依據(jù)和新的思路。

4 結(jié) 論

Nd:YAG激光聯(lián)合SRP治療伴T2DM的牙周炎患者可明顯改善臨床牙周參數(shù)(PD、BOP),減輕患者的疼痛,但在糖代謝水平上沒有顯著優(yōu)勢。在短期內(nèi)觀察到激光治療后齦下菌斑的主要菌群的組成發(fā)生了變化,抑制牙周炎癥的相關(guān)菌屬明顯增加。