王 涵,李天成,陳 碩,曾心怡,楊 寬,鄒淑娟,段沛沛

錯牙合畸形被世衛(wèi)組織列為口腔三大疾病之一,在我國,因錯牙合畸形而正在接受正畸治療的患者逐年增加[1]。正畸治療中,對牙齒施加輕力,牙槽骨發(fā)生吸收改建的同時,牙根表面發(fā)生的吸收陷窩將再礦化并修復(fù);若對牙齒施加過大的矯治力,牙槽骨發(fā)生潛行性吸收的同時,牙根將產(chǎn)生大量吸收陷窩,這種不可逆性吸收會使牙根變短,也即發(fā)生正畸源性牙根吸收[2]。正畸源性牙根吸收(orthodontically induced root resorption,OIRR)是正畸治療中最常見的并發(fā)癥,其發(fā)病率大于90%,其中>4 mm的重癥牙根吸收所占比例仍在逐年增加[3-4]。輕、中度OIRR直接導(dǎo)致牙根支持組織面積減小而影響牙齒的健康,重度OIRR增加了牙齒松動脫落的風(fēng)險,極大危害了正畸患者的口腔及身心健康[4]。同時,OIRR的發(fā)生常導(dǎo)致治療中斷、治療效果欠佳或治療時間延長,進(jìn)而可能誘發(fā)醫(yī)患關(guān)系緊張及信任危機(jī)。OIRR不僅影響了患者對健康及美的追求,也極大阻礙了正畸學(xué)科的發(fā)展與進(jìn)步[5]。因此,應(yīng)力刺激下牙根再礦化并修復(fù)吸收陷窩的能力對防治OIRR至關(guān)重要,掌握該過程中潛在的分子機(jī)制及關(guān)鍵靶點是目前正畸研究領(lǐng)域的熱點和難點。

牙骨質(zhì)是覆蓋在牙根表面的礦化結(jié)締組織,通過牙周韌帶將牙齒固定在牙槽骨上[6]。牙骨質(zhì)作為牙根的保護(hù)屏障,能在感染、創(chuàng)傷或正畸應(yīng)力等外界刺激下維持牙根礦化組織的穩(wěn)態(tài)平衡,使牙根再礦化并修復(fù)吸收陷窩[7]。因此,牙骨質(zhì)的生理活性與牙根的再礦化及自我修復(fù)息息相關(guān)。牙骨質(zhì)細(xì)胞是組成牙骨質(zhì)的唯一細(xì)胞,其細(xì)胞功能及生物學(xué)行為變化調(diào)控著牙骨質(zhì)的再礦化及穩(wěn)態(tài)平衡,是揭示牙根吸收潛在機(jī)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。然而,由于解剖位置特殊及含量較少,牙骨質(zhì)細(xì)胞分離難度極大,且周圍組織連接緊密,細(xì)胞種類繁雜,分離后難以鑒定,因此一直以來缺乏穩(wěn)定有效的體外細(xì)胞研究模型[6,8]。本課題組成員所在的美國Bonewald實驗室于2016年成功建立了全球范圍內(nèi)首株新型小鼠永生化牙骨質(zhì)細(xì)胞系IDG-CM6細(xì)胞,突破了牙骨質(zhì)體外研究的技術(shù)壁壘,并進(jìn)而對其生化特性展開了初步探究[6,9]。課題組前期研究表明,牙骨質(zhì)細(xì)胞是牙骨質(zhì)感受應(yīng)力及應(yīng)力轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵細(xì)胞,牙骨質(zhì)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號通路的表達(dá)對牙骨質(zhì)穩(wěn)態(tài)有調(diào)控作用[1,9]。組織病理學(xué)切片觀察到,牙根吸收后,吸收凹陷區(qū)域形成繼發(fā)性牙骨質(zhì),牙骨質(zhì)細(xì)胞在牙骨質(zhì)修復(fù)的過程中是否發(fā)揮了作用?上述生物學(xué)反應(yīng)的潛在分子機(jī)制尚不清楚,亟待相關(guān)細(xì)胞實驗進(jìn)行深入探究。

Wnt/β-catenin通路在牙骨質(zhì)再生領(lǐng)域中研究廣泛[10]。β-catenin是Wnt/β-catenin通路中的重要因子,它的活性和濃度水平對該通路調(diào)控牙骨質(zhì)再生至關(guān)重要[10-11]。有研究表明,β-catenin能夠上調(diào)成牙骨質(zhì)細(xì)胞中Osterix的表達(dá)水平從而促進(jìn)牙骨質(zhì)再生[10];另有研究證實β-catenin是Gli1+祖細(xì)胞分化為成牙骨質(zhì)細(xì)胞并進(jìn)行牙骨質(zhì)再生的關(guān)鍵調(diào)控因子[11]。此外,Han等[12]研究表明,Wnt/β-catenin通路的激活可誘導(dǎo)牙周炎大鼠的成牙骨質(zhì)細(xì)胞活化及牙骨質(zhì)再生。綜上研究說明,Wnt/β-catenin通路在成牙骨質(zhì)細(xì)胞激活、牙骨質(zhì)修復(fù)過程中扮演了重要角色。

然而,成牙骨質(zhì)細(xì)胞包埋入牙骨質(zhì)基質(zhì)并分化為牙骨質(zhì)細(xì)胞后的進(jìn)一步礦化才是牙骨質(zhì)發(fā)揮牙根屏障作用的關(guān)鍵[6-8],而該領(lǐng)域由于此前缺乏有效的牙骨質(zhì)細(xì)胞體外模型,故相關(guān)研究較為匱乏。本課題組前期利用IDG-CM6牙骨質(zhì)細(xì)胞系對其礦化特性進(jìn)行了初步探究,證明該細(xì)胞系能夠模擬體內(nèi)牙骨質(zhì)細(xì)胞的礦化及生物學(xué)特性[13];同時,本課題組最新研究發(fā)現(xiàn),IDG-CM6細(xì)胞內(nèi)β-catenin能夠響應(yīng)機(jī)械刺激產(chǎn)生表達(dá)變化[9]。綜上推測,輕力刺激可能通過調(diào)控Wnt/β-catenin通路活性進(jìn)而影響牙骨質(zhì)再礦化及穩(wěn)態(tài)平衡。

本研究通過構(gòu)建體外牙骨質(zhì)細(xì)胞的壓應(yīng)力模型,探究應(yīng)力下Wnt/β-catenin通路在牙骨質(zhì)穩(wěn)態(tài)及再礦化中的調(diào)控作用,并揭示輕力牙移動時牙根吸收修復(fù)中再礦化發(fā)生的潛在分子機(jī)制,為臨床中防控OIRR提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

IDG-CM6細(xì)胞由美國Bonewald實驗室惠贈;Ⅰ型鼠尾膠原(Sigma公司,美國);胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS,Gibco公司,美國);α-MEM培養(yǎng)基(Hyclone公司,美國);抗壞血酸(ascorbic acid,AA)、β-甘油磷酸鈉、茜素紅(Sigma公司,美國);γ干擾素(interferon-γ,IFN-γ,Gibco公司,美國);Lipofectamine 2000(上海漢恒生物科技有限公司,中國);si-NC、si-β-catenin(上海漢恒生物科技有限公司,中國);RIPA蛋白裂解液、二辛可寧酸(bicinchoninic acid,BCA)試劑盒(上海研謹(jǐn)生物科技有限公司,中國);Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光PCR定量試劑盒(Takara 公司,日本);小規(guī)格不銹鋼珠(0.25 g/顆,成都寶科生物公司,中國);DAPI(Sigma公司,美國);Cy3、鬼筆環(huán)肽、0.5% Triton X-100(上海碧云天生物技術(shù)公司,中國)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及礦化誘導(dǎo) 在33 ℃孵箱內(nèi)擴(kuò)增細(xì)胞(培養(yǎng)瓶:帶有Ⅰ型膠原表面的培養(yǎng)瓶;培養(yǎng)基:10%FBS、100 U/mL青霉素G、100 mg/mL鏈霉素、α-MEM;增殖誘導(dǎo)劑:IFN-γ),在37 ℃孵箱內(nèi)誘導(dǎo)礦化(接種密度:4×104個/cm2;礦化誘導(dǎo)液:AA及β-甘油磷酸鈉),礦化誘導(dǎo)至21 d收集細(xì)胞以備分析(此時最接近體內(nèi)牙骨質(zhì)細(xì)胞生理學(xué)特點,圖1)[9]。

圖1 IDG-CM6細(xì)胞礦化誘導(dǎo)至21 d培養(yǎng)鏡下形態(tài)Fig.1 Microscopic morphology of IDG-CM6 cells subjected to osteogenic-induced medium for 21 days

1.2.2 體外細(xì)胞靜壓力系統(tǒng)的建立 加力方法參考文獻(xiàn)[14]。取礦化誘導(dǎo)21 d后的IDG-CM6(IDG-CM621 d,下同)細(xì)胞置于孔板,將事先備好的磁珠稱重,根據(jù)實際孔板的底面積進(jìn)行計算,以保證最終壓應(yīng)力大小為0.5 g/cm2;精確計重后的磁珠置于離心管蓋并輕輕放入孔板,施加6 h壓應(yīng)力后[15]收樣以進(jìn)行后續(xù)實驗(壓應(yīng)力施加超過6 h后 IDG-CM621 d細(xì)胞會出現(xiàn)大面積脫落、死亡)。

1.2.3 高通量測序(RNA-seq) 選取6個樣品(對照組及應(yīng)力組各3個)寄往北京諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行基因測序;測序流程大致為樣品檢測、rRNA 去除、雙鏈cDNA 合成、加測序接頭、降解cDNA 第二鏈、富集及文庫質(zhì)檢、測序。

1.2.4 差異表達(dá)mRNA篩選 使用Illumina Hiseq 2500平臺進(jìn)行RNA測序分析。使用Trinity軟件完成轉(zhuǎn)錄組組裝。用RSEM軟件將每個待測樣品數(shù)據(jù)與對照序列進(jìn)行對標(biāo)。采用Corset軟件富集轉(zhuǎn)錄組。用DESeq軟件對基因表達(dá)水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。當(dāng)P<0.05時,認(rèn)為該基因表達(dá)具有統(tǒng)計學(xué)差異(DEGs)。DEG熱圖采用k-means聚類,用Java TreeView軟件進(jìn)行觀察。

1.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組 取IDG-CM621 d細(xì)胞,實驗設(shè)置對照組(IDG-CM621 d細(xì)胞)、應(yīng)力組(加載0.5 g/cm2靜壓力的IDG-CM621 d細(xì)胞)、si-NC組(轉(zhuǎn)染si-NC的IDG-CM621 d細(xì)胞)以及si-β-catenin組(轉(zhuǎn)染si-β-catenin的IDG-CM621 d細(xì)胞)。轉(zhuǎn)染組均按照Lipofectamine 2000 試劑盒說明進(jìn)行。

1.2.6 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-timequantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR) 提取IDG-CM621 d的細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,按試劑盒說明進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR),檢測各組Ctnnb1(β-catenin)水平以驗證轉(zhuǎn)染效果;同時檢測成骨因子Runx2及Sp7的mRNA表達(dá)水平。引物由上海生工生物工程公司合成。

表1 qRT-PCR檢測中所需引物序列Tab.1 Sequences of primers used in qRT-PCR

1.2.7 蛋白印跡(Western blot)法檢測蛋白表達(dá) 提取各組細(xì)胞總蛋白,用BCA試劑盒進(jìn)行定量。各組蛋白上樣量為60 μg,隨后進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE),然后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF),用5%牛血清BSA室溫封閉,完成后用TBST(Tris-HCl緩沖鹽+Tween溶液)洗滌3次,加入一抗4 ℃孵育過夜,TBST洗滌3次,加入二抗室溫孵育1 h,TBST洗滌3次,暗室中曝光顯影,定影,用Image J軟件檢測各組蛋白條帶灰度值,以目的條帶和GAPDH條帶的比值作為蛋白表達(dá)水平。

1.2.8 茜素紅染色 細(xì)胞在4%多聚甲醛緩沖液中固定10 min,然后用濃度為2%的茜素紅染色10 min,隨后吸凈染液,用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)沖洗3次,以去除未結(jié)合染料,并收集圖像。為了定量分析鈣沉積量,每次再加入1 mL 10%氯化十六烷基溶液直到去除所有染料。取200 μL溶液至96孔板中,使用紫外分光光度計在570 nm處測量,用10%氯化十六烷基溶液作為空白對照。

1.2.9 免疫熒光染色 對于免疫熒光染色,首先在室溫下用4% PFA固定IDG-CM621 d細(xì)胞15 min,隨后用PBS洗滌2次。固定后,用0.5% Triton X-100進(jìn)行細(xì)胞打孔10 min后用5% BSA封閉1 h。隨后PBS洗滌3次,在培養(yǎng)皿中加入一抗,4 ℃孵育過夜。隨后用結(jié)合Cy3的二抗孵育樣品2 h。DAPI和鬼筆環(huán)肽分別用于細(xì)胞核和細(xì)胞骨架的染色。最后用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對所有實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,計量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示且所有資料均符合正態(tài)分布,兩組間比較采用獨立樣本t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,P<0.05即認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 壓應(yīng)力刺激對牙骨質(zhì)細(xì)胞的礦化及成骨相關(guān)因子表達(dá)水平的影響

與對照組比較,應(yīng)力組IDG-CM621 d細(xì)胞茜素紅著色的礦化結(jié)節(jié)顯著增多,表明IDG-CM621 d細(xì)胞礦化活躍(圖2A);同時,成骨礦化相關(guān)因子Runx2及Osterix的mRNA及蛋白表達(dá)水平均較對照組顯著升高(圖2B、C)。此外,免疫熒光染色結(jié)果顯示,應(yīng)力刺激下Runx2熒光信號較對照組顯著上調(diào),且在亞細(xì)胞定位層面,應(yīng)力組Runx2受激活發(fā)生顯著的核內(nèi)轉(zhuǎn)移(圖2D)。

A:茜素紅染色及半定量分析檢測應(yīng)力刺激對IDG-CM621 d細(xì)胞礦化程度的影響;B:qRT-PCR檢測應(yīng)力刺激對IDG-CM621 d細(xì)胞內(nèi)Runx2、Sp7的mRNA表達(dá)水平的影響;C:Western blot檢測應(yīng)力刺激對IDG-CM621 d細(xì)胞內(nèi)Runx2、Osterix蛋白表達(dá)的影響;D:免疫熒光檢測應(yīng)力刺激對IDG-CM621 d細(xì)胞內(nèi)Runx2表達(dá)的影響;*:P<0.05圖2 應(yīng)力刺激對IDG-CM621 d細(xì)胞礦化相關(guān)因子Runx2、Osterix的影響Fig.2 The effects of mechanical stress on the mineralization and osteogenic factors, Runx2 and Osterix of IDG-CM6 cells subjected to osteogenic-induced medium for 21 days

2.2 壓應(yīng)力刺激下IDG-CM621 d細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)變化

高通量測序結(jié)果顯示,應(yīng)力組相比對照組有16個成骨礦化相關(guān)基因表達(dá)上調(diào),15個成骨礦化相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)(圖3A);將差異表達(dá)基因以熱圖形式呈現(xiàn)(圖3B)并從中篩選出差異表達(dá)最顯著的7條基因進(jìn)行PCR檢測。PCR結(jié)果與熱圖預(yù)測結(jié)果一致,應(yīng)力組較對照組成骨礦化相關(guān)因子表達(dá)水平顯著升高(圖3C)。其中,Ctnnb1(β-catenin)表達(dá)水平變化最為顯著,因此將其作為研究應(yīng)力下牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化增加這一生物學(xué)過程的潛在靶點基因。Western blot、PCR及免疫熒光結(jié)果表明,應(yīng)力下IDG-CM621 d細(xì)胞中β-catenin表達(dá)顯著增加(圖3D、E)。

A:應(yīng)力與對照組相比差異表達(dá)基因的火山圖;B:差異表達(dá)基因的熱圖;C:篩選并采用qRT-PCR檢測礦化相關(guān)因子的mRNA表達(dá)水平;D:Western blot檢測應(yīng)力對β-catenin的蛋白表達(dá)水平的影響;E:免疫熒光檢測應(yīng)力刺激對IDG-CM621 d細(xì)胞內(nèi)β-catenin表達(dá)的影響;*:P<0.05圖3 應(yīng)力刺激下IDG-CM621 d細(xì)胞內(nèi)差異表達(dá)基因的篩選及應(yīng)力對IDG-CM621 d細(xì)胞內(nèi)β-catenin的影響Fig.3 The differentially expressed genes of IDG-CM6 cells under mechanical stress and the effects of mechanical stress on expression of β-catenin in IDG-CM6 cells subjected to osteogenic-induced medium for 21 days

2.3 壓應(yīng)力刺激通過β-catenin調(diào)控牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化的潛在機(jī)制

與對照組相比,si-β-catenin組IDG-CM621 d細(xì)胞內(nèi)β-catenin的基因及蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(圖4)。相較對照組,IDG-CM621 d細(xì)胞內(nèi)礦化程度降低,成骨相關(guān)因子Runx2及Osterix的蛋白及mRNA水平均顯著減少,Runx2熒光信號強(qiáng)度亦減弱(圖5)。當(dāng)施加壓應(yīng)力后,IDG-CM621 d細(xì)胞礦化程度增加,Runx2及Osterix表達(dá)亦顯著上升(圖5)。在壓應(yīng)力刺激下通過si-β-catenin抑制β-catenin表達(dá)后,IDG-CM621 d細(xì)胞礦化受到抑制,Runx2及Osterix表達(dá)水平亦顯著降低(圖5)。

A～B:利用siRNA成功敲除β-catenin的Western blot及qRT-PCR檢測;C:利用siRNA成功敲除β-catenin的免疫熒光檢測;*:P<0.05圖4 利用siRNA技術(shù)成功敲除IDG-CM621 d細(xì)胞內(nèi)的β-catenin表達(dá)水平Fig.4 Successful knockdown of β-catenin in IDG-CM6 cells subjected to osteogenic-induced medium for 21 days using the siRNA technology

A～D:Western blot、qRT-PCR及茜素紅染色檢測下調(diào)β-catenin對應(yīng)力下IDG-CM621 d細(xì)胞礦化以及其內(nèi)Runx2、Osterix蛋白、mRNA表達(dá)的影響;E:免疫熒光檢測下調(diào)β-catenin對應(yīng)力下IDG-CM621 d細(xì)胞內(nèi)Runx2表達(dá)的影響;*:P<0.05圖5 應(yīng)力刺激通過Wnt/β-catenin通路調(diào)控IDG-CM621 d細(xì)胞礦化相關(guān)因子表達(dá)水平的潛在機(jī)制Fig.5 The role of mechanical stress in regulating mineralization and osteogenic factors of IDG-CM6 cells subjected to osteogenic-induced medium for 21 days via Wnt/β-catenin signaling pathway

3 討 論

生理情況下,牙骨質(zhì)較固有牙槽骨具有更強(qiáng)的抗吸收能力,在牙根表面發(fā)生小范圍的病理性吸收時,新生含細(xì)胞牙骨質(zhì)(繼發(fā)性牙骨質(zhì))的產(chǎn)生填補(bǔ)吸收凹陷區(qū),迄今為止,此修復(fù)過程發(fā)生的機(jī)制仍不明確。此領(lǐng)域研究的壁壘之一是缺乏牙骨質(zhì)細(xì)胞的體外研究模型。牙骨質(zhì)細(xì)胞直接參與了牙骨質(zhì)再礦化的生理過程,但因體外分離培養(yǎng)困難,所以目前有關(guān)OIRR牙骨質(zhì)再礦化的細(xì)胞生物學(xué)研究較為缺乏。本課題組于美國Bonewald實驗室參與并成功建立了一種新型小鼠永生化牙骨質(zhì)細(xì)胞系IDG-CM6細(xì)胞。實驗對礦化21 d的牙骨質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行加力。前期研究表明,礦化21 d的牙骨質(zhì)細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)骨硬化蛋白(SOST),這與體內(nèi)牙骨質(zhì)組織中表達(dá)骨硬化蛋白一致,是其可作為牙骨質(zhì)體外研究模型的重要特征之一[9,13]。因此,本實驗在第21天施加壓應(yīng)力,以模擬體內(nèi)牙骨質(zhì)修復(fù)的狀態(tài)。而探究輕力而非重力刺激下的牙骨質(zhì)礦化機(jī)制,直接為臨床中常規(guī)加力后牙根吸收的修復(fù)提供理論依據(jù)。

長期以來,細(xì)胞應(yīng)力轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)制是口腔生物力學(xué)研究領(lǐng)域的焦點[16]。許多應(yīng)力敏感型細(xì)胞如骨細(xì)胞等,均能在感知應(yīng)力刺激后引導(dǎo)其內(nèi)各信號通路活性改變,進(jìn)而產(chǎn)生增殖、分化、遷移、凋亡等細(xì)胞生物學(xué)行為的變化[17-18]。牙骨質(zhì)細(xì)胞與骨細(xì)胞在結(jié)構(gòu)及功能上均具有高度相似性,二者同樣具備復(fù)雜的樹突網(wǎng)絡(luò)及微管腔隙,外界信號如機(jī)械刺激等能通過該結(jié)構(gòu)向細(xì)胞內(nèi)傳遞,并激活應(yīng)力敏感型通路發(fā)生構(gòu)象變化,進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)及穩(wěn)態(tài)平衡[6,8]。本課題組近期研究證實,牙骨質(zhì)細(xì)胞能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)應(yīng)力信號為生化信號,激活下游PGE2及COX2等應(yīng)力轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)因子的表達(dá),而這些因子在骨礦化再生及骨改建過程中亦發(fā)揮重要作用[1,9,19-20]。上述結(jié)論提示,應(yīng)力刺激下,在牙骨質(zhì)細(xì)胞將力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)為生物學(xué)信號后,很可能繼續(xù)參與下游牙骨質(zhì)細(xì)胞的礦化及穩(wěn)態(tài)平衡的調(diào)控,以發(fā)揮牙骨質(zhì)細(xì)胞在OIRR再礦化進(jìn)程中的作用。因此,本實驗采用靜壓力系統(tǒng)對牙骨質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行應(yīng)力加載,該加力方式最能模擬人體內(nèi)實際正畸應(yīng)力微環(huán)境[21],并且方法傳統(tǒng)有效,廣泛應(yīng)用于各種細(xì)胞應(yīng)力轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究中[14,21-22]。本研究結(jié)果表明,應(yīng)力組牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化程度增加,且成骨礦化相關(guān)因子表達(dá)水平亦顯著升高,說明應(yīng)力刺激可能促進(jìn)牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化,增強(qiáng)其合成代謝活動。

為進(jìn)一步探究正畸應(yīng)力促進(jìn)牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化的潛在分子調(diào)控機(jī)制,本課題組采用新興的高通量測序技術(shù)手段,對應(yīng)力刺激后的牙骨質(zhì)細(xì)胞差異表達(dá)的基因進(jìn)行篩選及預(yù)測。結(jié)果顯示,在應(yīng)力加載下,牙骨質(zhì)細(xì)胞中成骨礦化相關(guān)基因顯著變化。隨后,本課題組進(jìn)一步深入分析,篩選出差異表達(dá)最為顯著的7條基因并進(jìn)行PCR檢測,結(jié)果表明Ctnnb1 (β-catenin)的mRNA水平增加最為顯著,很可能是壓應(yīng)力刺激下牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化增加的關(guān)鍵調(diào)控因子。β-catenin是Wnt/β-catenin通路中的重要因子,其活性及表達(dá)水平影響著該通路在骨代謝平衡中的調(diào)控作用[23-24]。體內(nèi)研究表明,大鼠β-catenin基因敲除后,骨小梁的骨量及密度均顯著減少[25];此外,本課題組新近研究證實,β-catenin在牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用,其正向/逆向調(diào)控作用依賴于自身濃度水平范圍[26]。綜上提示,β-catenin活躍參與了骨及牙骨質(zhì)等礦化組織穩(wěn)態(tài)平衡的調(diào)控過程。本課題組研究結(jié)果顯示β-catenin的蛋白及熒光水平較對照組顯著增加,呈現(xiàn)與mRNA相同的變化趨勢;同時,在亞細(xì)胞定位層面,β-catenin受應(yīng)力刺激后發(fā)生顯著的核內(nèi)轉(zhuǎn)移,核內(nèi)定位的β-catenin表達(dá)較對照組顯著上調(diào)。上述表明,應(yīng)力刺激能夠促進(jìn)牙骨質(zhì)細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)并激活其入核,進(jìn)而可能對下游成骨礦化相關(guān)靶基因發(fā)揮調(diào)控作用。

在此前實驗結(jié)果基礎(chǔ)上,本課題組通過敲降牙骨質(zhì)細(xì)胞系IDG-CM6細(xì)胞內(nèi)的β-catenin,深入探究了β-catenin在應(yīng)力促進(jìn)的牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化過程中所發(fā)揮的調(diào)控功能。結(jié)果表明,應(yīng)力激活的牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化增加能夠被si-β-catenin所逆轉(zhuǎn),結(jié)合此前實驗結(jié)果可得,應(yīng)力刺激可能是通過調(diào)控β-catenin的水平進(jìn)而影響牙骨質(zhì)細(xì)胞的礦化及穩(wěn)態(tài)平衡。這與骨細(xì)胞在應(yīng)力刺激下發(fā)生β-catenin上調(diào)并調(diào)控骨穩(wěn)態(tài)的結(jié)論一致[27]。

綜上所述,應(yīng)力刺激能夠促進(jìn)牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化,成骨相關(guān)因子表達(dá)水平升高;β-catenin在該過程中發(fā)揮了重要調(diào)控作用,應(yīng)力刺激可能是通過上調(diào)牙骨質(zhì)細(xì)胞內(nèi)β-catenin的表達(dá)水平進(jìn)而調(diào)控牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化,并最終調(diào)控牙骨質(zhì)穩(wěn)態(tài)及牙根吸收的再礦化。此研究為正畸臨床OIRR的再礦化修復(fù)提供了新的理論依據(jù),豐富了牙骨質(zhì)修復(fù)機(jī)制的研究。