吳航軍，韓 琴，肖桂鳳，林趙肖楠，戎 葉

（1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，杭州 310058；2.杭州師范大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，杭州 311121）

0 引 言

1931 年，德國科學(xué)家Max Knoll 和Ernst Ruska 發(fā)明了世界上第一臺透射電子顯微鏡，使人們可以觀察到超顯微細(xì)胞結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)了各種重要的細(xì)胞器。然而，利用傳統(tǒng)電子顯微鏡觀察生物樣本存在明顯的技術(shù)瓶頸：①電鏡的高真空環(huán)境難以維持生物樣本的水環(huán)境；②高能電子輻射會損傷生物樣本；③生物樣本需要進(jìn)行重金屬染色后成像，難以獲得高分辨結(jié)構(gòu)圖像。為了解決這些瓶頸問題，以瑞士洛桑大學(xué)的Jacques Dubochet教授、美國哥倫比亞大學(xué)的Joachim Frank 教授和英國劍橋MRC 分子生物學(xué)實(shí)驗室的Richard Henderson教授為代表的科學(xué)家在樣本制備方法、圖像三維重構(gòu)技術(shù)和數(shù)據(jù)收集相機(jī)等方面做出開創(chuàng)性工作，為實(shí)現(xiàn)冷凍電鏡技術(shù)（cryo-electron microscopy，Cryo-EM）奠定了堅實(shí)基礎(chǔ)，讓冷凍電鏡成為解析生物大分子結(jié)構(gòu)的利器，他們3 人因此共同獲得了2017 年諾貝爾化學(xué)獎。經(jīng)過多年的發(fā)展，冷凍電鏡技術(shù)已與X 射線晶體學(xué)（X-ray crystallography）、核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）成為結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究的三大主流技術(shù)。相比其他技術(shù)，冷凍電鏡技術(shù)優(yōu)勢顯著：無須結(jié)晶、樣本接近天然狀態(tài)、所需樣本量極少、適用廣泛。近十多年來，冷凍電鏡技術(shù)已成功解析了眾多其他技術(shù)手段難以解析的重要生物大分子復(fù)合物，包括剪切體［1-3］、離子通道［4-11］、線粒體呼吸鏈超復(fù)合體［12］、光系統(tǒng)超復(fù)合體［13-15］、藻膽體［16］、G 蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）［17-22］和新冠病毒相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)［23-30］等。

中國生物電鏡技術(shù)研究起始于20 世紀(jì)80 年代，隨后在90 年代開啟了國內(nèi)冷凍電鏡技術(shù)研究新篇章。2008 年，清華大學(xué)購置了亞洲第1 臺300 kV 冷凍電鏡Titan Krios，建立了國內(nèi)第一個冷凍電鏡平臺，隨后中國科學(xué)院生物物理所和國家蛋白質(zhì)中心（上海）也分別組建了冷凍電鏡平臺。浙江大學(xué)歷時4 年于2017 年5 月成功建立了國內(nèi)第4 個、浙江省第1 個冷凍電鏡平臺。

以2017 年諾貝爾化學(xué)獎的授予和冷凍電鏡技術(shù)在多個領(lǐng)域的應(yīng)用發(fā)展為契機(jī)，國內(nèi)各大高校、科研院所掀起了冷凍電鏡平臺建設(shè)的熱潮。截至2022 年5月，國內(nèi)已有15 個省市34 家單位建成冷凍電鏡平臺，已安裝或購置的300 kV 冷凍電鏡共有69 臺（見圖1），近半數(shù)分布在北京和上海，全球范圍內(nèi)300 kV 冷凍電鏡的數(shù)量已經(jīng)超過400 臺。自2014 年起，國內(nèi)不斷涌現(xiàn)出利用冷凍電鏡技術(shù)獲得的突破性成果，截至2022 年5 月，累計發(fā)表在Cell、Nature、Science 期刊上的高水平論文近150 篇。自2019 年以來國內(nèi)大部分冷凍電鏡平臺均已成熟穩(wěn)定運(yùn)行，每年支撐的高水平論文約占全球20%（見圖2），居世界前列水平，這得益于近些年我國在冷凍電鏡平臺設(shè)施建設(shè)的大力投入以及我國科研工作者研究水平的大幅提升。浙江大學(xué)冷凍電鏡中心配備了1 臺300 kV 冷凍電鏡，2019 年至今，累計支撐發(fā)表了13 篇Cell、Nature、Science 期刊論文，充分體現(xiàn)了中心支撐高水平科研成果的高效性。

圖1 國內(nèi)300 kV冷凍電鏡分布

圖2 自2010年以來利用冷凍電鏡發(fā)表CNS文章國內(nèi)外分布情況

1 冷凍電鏡平臺的建設(shè)

2013 年，我校開始籌建冷凍電鏡中心，相關(guān)人員先后赴清華大學(xué)、中科院生物物理所和國家蛋白質(zhì)中心（上海）等地調(diào)研學(xué)習(xí)冷凍電鏡平臺建設(shè)和運(yùn)行的經(jīng)驗，經(jīng)過近4 年的籌措組建，配備了300 kV 冷凍電鏡的冷凍電鏡中心于2017 年5 月正式運(yùn)行。冷凍電鏡中心（以下簡稱中心）旨在建成基于冷凍電鏡技術(shù)、常規(guī)生物電鏡技術(shù)、三維大尺度掃描電鏡技術(shù)和光電關(guān)聯(lián)顯微鏡技術(shù)的跨尺度高端生物電鏡中心，為結(jié)構(gòu)生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)和材料學(xué)等學(xué)科研究提供技術(shù)服務(wù)，具體儀器架構(gòu)如圖3 所示。中心組建了學(xué)術(shù)委員會、教授管理委員會和技術(shù)團(tuán)隊：學(xué)術(shù)委員會由國內(nèi)電鏡領(lǐng)域知名專家組成，對中心的中、長期發(fā)展規(guī)劃提出咨詢和審議意見；教授管理委員會由校內(nèi)多個學(xué)院電鏡相關(guān)的專家或用戶組成，對中心日常運(yùn)行的重大事項進(jìn)行審議決策；技術(shù)團(tuán)隊由浙江大學(xué)求是特聘教授和浙江大學(xué)求是講座教授領(lǐng)銜、13 名技術(shù)人員組成（博士4 名、碩士9 名，其中事業(yè)編制6 人，項目聘用6 人，退休返聘1 人），分別負(fù)責(zé)冷凍電鏡技術(shù)、細(xì)胞／組織結(jié)構(gòu)分析技術(shù)（常規(guī)及免疫電鏡、電子斷層成像、光電關(guān)聯(lián)）、臨床輔助診斷技術(shù)和儀器維護(hù)與技術(shù)開發(fā)。

圖3 冷凍電鏡中心儀器架構(gòu)

2 探索3＋X創(chuàng)新運(yùn)行模式

冷凍電鏡中心的建設(shè)和運(yùn)行需有充足的經(jīng)費(fèi)持續(xù)性支撐，一個完備的冷凍電鏡中心初期建設(shè)經(jīng)費(fèi)需近1 億元，規(guī)模較大的則超過2 億元，日常運(yùn)行、設(shè)備的耗材更換以及后期維保費(fèi)用，是冷凍電鏡中心運(yùn)行的主要支出，如若沒有源源不斷的經(jīng)費(fèi)注入，將會給中心運(yùn)行帶來巨大的壓力，這也是國內(nèi)外冷凍電鏡平臺面臨的最主要問題之一。中心自建成運(yùn)行以來，積極探索創(chuàng)新運(yùn)行模式，在確保提供高質(zhì)量技術(shù)服務(wù)的前提下，大力擴(kuò)展業(yè)務(wù)，力求實(shí)現(xiàn)收支平衡。

2.1 3＋X技術(shù)支撐體系

中心成立后，力求以夯實(shí)冷凍電鏡、常規(guī)電鏡和大尺度掃描電鏡三大技術(shù)作為對外服務(wù)的根基，積極探索開發(fā)并完善各項技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域，逐步形成3＋X的技術(shù)服務(wù)體系。

（1）免疫電鏡技術(shù)的完善和應(yīng)用。免疫電鏡技術(shù)是透射電鏡技術(shù)重要的補(bǔ)充，可對蛋白質(zhì)實(shí)現(xiàn)精確定位，是生物電鏡技術(shù)中難度較大的一類，其難度在于保持抗原活性同時還需保證良好的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，中心經(jīng)過多年的探索和完善，現(xiàn)該技術(shù)已成熟應(yīng)用在生命科學(xué)領(lǐng)域多個學(xué)科的蛋白定位。

（2）光電關(guān)聯(lián)技術(shù)的建立。光電關(guān)聯(lián)是一種光學(xué)顯微鏡結(jié)合電子顯微鏡開展研究的技術(shù)體系，電子顯微成像技術(shù)在成像特點(diǎn)、分辨率及應(yīng)用范圍等方面與光學(xué)顯微成像技術(shù)存在很大的互補(bǔ)性。通過技術(shù)關(guān)聯(lián)彌補(bǔ)各自短板、突破單一技術(shù)的限制，獲得更多的樣本信息［31］。因此，在同一樣本的分析中結(jié)合兩種或多種成像技術(shù)的模式使用越來越普遍。針對不同樣品或?qū)嶒灄l件，中心不斷孵化新型光電關(guān)聯(lián)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞、組織和冷凍等條件下實(shí)施關(guān)聯(lián)技術(shù)，現(xiàn)已初步建成光電關(guān)聯(lián)技術(shù)體系。

（3）發(fā)展電鏡臨床輔助診斷技術(shù)。相比常規(guī)病理科診斷所用的熒光顯微鏡，電鏡在分辨率上有極大的優(yōu)勢，為充分發(fā)揮醫(yī)院醫(yī)療資源優(yōu)勢和冷凍電鏡中心設(shè)備與技術(shù)資源優(yōu)勢，2018 年浙大冷凍電鏡中心聯(lián)合浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院簽署合作框架協(xié)議，設(shè)立“電鏡診斷研究中心”，在臨床科研和臨床診斷等方面開展全面的合作，同年與浙江省人民醫(yī)院生殖科簽訂合作協(xié)議，共同探索電鏡技術(shù)在生殖健康研究和臨床輔助診斷方面的應(yīng)用。此外，冷凍電鏡中心也與多家醫(yī)院達(dá)成合作，將電鏡技術(shù)應(yīng)用在腎病、口腔疾病、血液病及神經(jīng)系統(tǒng)疾病等領(lǐng)域的臨床輔助診斷，擴(kuò)展電鏡技術(shù)應(yīng)用的同時，也更好地將高校儀器設(shè)備服務(wù)于社會。

（4）冷凍電鏡技術(shù)應(yīng)用的拓展。冷凍電鏡技術(shù)能瞬間將樣品固定在接近天然的狀態(tài)下，是研究樣品天然狀態(tài)的最佳技術(shù)之一，除了應(yīng)用在生命科學(xué)領(lǐng)域的結(jié)構(gòu)與功能研究，在藥物結(jié)構(gòu)、新能源材料、生物高分子等輻射敏感材料的高分辨成像也能受益于冷凍電鏡技術(shù)的應(yīng)用。

2.2 開放服務(wù)模式

為了確保中心有序運(yùn)行，向用戶提供最優(yōu)質(zhì)高效的技術(shù)服務(wù)，中心嘗試完善對外開放模式，并不斷探索新的運(yùn)行模式。

（1）信息化平臺搭建用戶與中心的橋梁。以中心網(wǎng)站和公眾號為主體，實(shí)現(xiàn)信息化管理，集合信息發(fā)布、培訓(xùn)講座、儀器預(yù)約與管理、數(shù)據(jù)傳輸、門禁關(guān)聯(lián)和監(jiān)控等功能，提升用戶與中心的交互性，實(shí)現(xiàn)中心管理集約化、運(yùn)行高效能。

（2）加強(qiáng)教學(xué)培訓(xùn)實(shí)行分類管理。教學(xué)方面，為研究生開設(shè)《研究生科研技能》課程，通過理論和上機(jī)實(shí)操講授電子顯微鏡技術(shù)、冷凍電鏡技術(shù)和科研圖片的獲取與處理等課程及上機(jī)實(shí)操，穩(wěn)固研究生的實(shí)驗技術(shù)基礎(chǔ)；培訓(xùn)方面，針對各類儀器，定期開展小班培訓(xùn)，提高學(xué)生的儀器操作能力，經(jīng)過初級培訓(xùn)的用戶可以獲得普通資格，能預(yù)約工作時間段的儀器；對于已熟練掌握儀器理論知識及儀器操作能力的學(xué)生，經(jīng)考核通過后獲得資深資格，可預(yù)約任意時間段，不受非工作時間限制，且儀器使用費(fèi)大幅優(yōu)惠。通過預(yù)約權(quán)限導(dǎo)向和收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)導(dǎo)向，對用戶進(jìn)行適度分流，避免工作時間段的擁擠，并有效提升儀器非工作時間利用率，實(shí)現(xiàn)儀器開放最大化。自運(yùn)行以來，累計受益學(xué)生超1 200人次。

（3）技術(shù)傳承與技術(shù)人才培養(yǎng)。中心每年為校內(nèi)勤工儉學(xué)的學(xué)生設(shè)立多個助管崗位，為學(xué)生減輕經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，也讓學(xué)生在實(shí)踐中得到歷練、獲得實(shí)驗技能，為后續(xù)深造或工作提供幫助；中心與河南化工技師學(xué)院建立長期合作關(guān)系，作為實(shí)習(xí)基地，對口培養(yǎng)電子顯微鏡技術(shù)專業(yè)的學(xué)生，為中心和國內(nèi)其他兄弟單位輸送電鏡技術(shù)人才；中心也為國內(nèi)兄弟院校的技術(shù)人員提供了技術(shù)培訓(xùn)服務(wù)。擁有熟練實(shí)驗技能的助管或?qū)嵙?xí)生，均可作為中心技術(shù)隊伍的一部分，為用戶提供優(yōu)質(zhì)的技術(shù)服務(wù)。

（4）適度保障應(yīng)急需求。部分使用率較高的儀器無法在工作時間滿足測試需求，對于只有普通資格且有緊急使用需求（如文章修回補(bǔ)實(shí)驗等）的用戶，中心不斷摸索新的工作模式，鼓勵工作人員在非工作時間加急完成測試服務(wù)，并為其提供調(diào)休或加班津貼，該模式仍在摸索階段，將在實(shí)踐中不斷完善。

3 運(yùn)行成效

3.1 創(chuàng)新模式下運(yùn)行效率大幅提升

在“3＋X”運(yùn)行模式下，中心對外服務(wù)量及機(jī)時逐年增長，服務(wù)范圍涵蓋校內(nèi)外科研、臨床診斷、制藥等領(lǐng)域。截至2021 年12 月，已經(jīng)為校內(nèi)500 多個課題組和250 多個校外單位提供了高水平的科研技術(shù)服務(wù)，對外服務(wù)機(jī)時累計424 623 h，用戶服務(wù)評測滿意率超95%。中心的業(yè)務(wù)不斷拓展，范圍覆蓋校內(nèi)、國內(nèi)高校和科研院所、醫(yī)院、企業(yè)，用戶來自生命、醫(yī)藥、農(nóng)學(xué)、材料、化學(xué)、能源、環(huán)境、臨床等學(xué)科。2018～2021 年，中心儀器平均校外機(jī)時占25.6%，校外測試收入占37.4%。此外，通過業(yè)務(wù)拓展和優(yōu)化管理，一部分使用率低的老舊設(shè)備使用效率得到了極大提升，2000 年購置的100 kV透射電子顯微鏡，在2017 年納入中心管理后，拓展電鏡臨床輔助診斷技術(shù)應(yīng)用，擴(kuò)大對外服務(wù)，運(yùn)行效率大幅提升，服務(wù)機(jī)時數(shù)和樣本量攀升了3 倍。測試收入大幅提升，為中心的運(yùn)行提供了有力的保障（見圖4）。中心運(yùn)行收入主要來自對外測試服務(wù)（占76.3%）、學(xué)校補(bǔ)貼（占13.2%）和共建單位支持（占10.4%），主要支出包括設(shè)備維保與維修（55.1%）、人員費(fèi)（占29.9%）和試劑耗材及辦公（占15.0%）等，至2021 年，中心已經(jīng)基本實(shí)現(xiàn)收支平衡，實(shí)現(xiàn)良性循環(huán)。

圖4 單臺透射電子顯微鏡運(yùn)行效率大幅提升

3.2 服務(wù)成效顯著

冷凍電鏡中心的運(yùn)行，為學(xué)校的發(fā)展提供了重要的支撐作用：吸引了包括海外優(yōu)青、浙江省千人、浙大百人等19 人加盟；2017 年成立以來支撐發(fā)表高水平論文超過50 篇，其中Science、Nature 和Cell 論文13篇，支撐獲得多個獎項，包括2019 年全國十大科學(xué)進(jìn)展1 項、2021 年中國科技十大突破1 項，浙江大學(xué)2021 年度突出學(xué)術(shù)貢獻(xiàn)獎1 項、浙江大學(xué)2021 年度十大科學(xué)進(jìn)展2 項；成立以結(jié)構(gòu)生物學(xué)為重點(diǎn)的生物物理學(xué)系，與臨床醫(yī)學(xué)、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、農(nóng)學(xué)等學(xué)科展開廣泛的交叉合作。

3.3 助力獲得突破性成果

中心技術(shù)團(tuán)隊不斷發(fā)展新技術(shù)、改進(jìn)現(xiàn)有技術(shù)條件，突破技術(shù)瓶頸、解決技術(shù)難題、提升設(shè)備效率，提高技術(shù)支撐水平，通過中心的技術(shù)支持，在醫(yī)學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、植物學(xué)等多個領(lǐng)域取得了突破性進(jìn)展，包括人源甲狀旁腺激素受體結(jié)構(gòu)與動力學(xué)研究［32］、抗癲癇、高血壓藥物靶點(diǎn)解析［33］、瑞德西韋抗新型冠狀病毒基礎(chǔ)藥理研究［34］、古老綠硫細(xì)菌光合作用反應(yīng)中心解析［14］、GPCR 激活以及配體識別的結(jié)構(gòu)解析［35］、細(xì)菌鞭毛馬達(dá)結(jié)構(gòu)、組裝與扭矩傳輸機(jī)制研究［36］、大麥葉綠體光系統(tǒng)超大復(fù)合物三維結(jié)構(gòu)解析［15］、昆蟲納米分辨率完整三維結(jié)構(gòu)重建［37］等。

4 面臨的問題

（1）儀器和技術(shù)的更新。結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域研究競爭激烈，很大程度上依賴于冷凍電鏡的性能和前沿的冷凍電鏡技術(shù)。隨著冷凍電鏡技術(shù)的發(fā)展，電鏡光源、直接電子探測器、能量過濾器等硬件性能的提升，冷凍電鏡技術(shù)得到了進(jìn)一步突破，可以實(shí)現(xiàn)接約0.1 nm（1 ?）的近原子分辨率［38］，新的冷凍電鏡將會助力解決更多生命科學(xué)及其他領(lǐng)域的問題；隨著冷凍電子斷層掃描技術(shù)（cryo-electron tomography，Cry-ET）的成熟，基于原位結(jié)構(gòu)解析的冷凍電鏡技術(shù)將在生命科學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮更重要的作用；電鏡領(lǐng)域大部分儀器設(shè)備國產(chǎn)率低，特別是冷凍電鏡主體、直接電子探測器和數(shù)據(jù)收集及分析軟件均依賴進(jìn)口，主要由美國的Thermo Fisher和Gatan公司壟斷。電鏡樣品制備相關(guān)的部分設(shè)備已經(jīng)實(shí)現(xiàn)國產(chǎn)化或者在研制中，相信在未來，國產(chǎn)化的比例將會越來越高。

（2）運(yùn)行和發(fā)展的壓力。冷凍電鏡技術(shù)在國內(nèi)普及已有近5 年時間，隨著冷凍電鏡技術(shù)的發(fā)展，前期配置的冷凍電鏡的硬件性能已落后于主流型號，儀器零部件故障率大幅增加，儀器的維修維護(hù)以及迭代更新，都需要大量、持續(xù)的經(jīng)費(fèi)投入，這對于國內(nèi)大部分冷凍電鏡平臺的運(yùn)行將會有較大的壓力。除了提高自我造血能力、維持收支平衡、確保良性運(yùn)行，新型冷凍電鏡等儀器的購置仍需學(xué)校、社會和國家層面的大力支持。

（3）技術(shù)支撐隊伍的穩(wěn)定與發(fā)展。國內(nèi)已建成超過30 個冷凍電鏡平臺，部分在企業(yè)，然而，因?qū)夹g(shù)人員專業(yè)要求高、培養(yǎng)周期長等因素導(dǎo)致人才一直緊缺。同時受編制、待遇和職業(yè)發(fā)展等因素影響，不少技術(shù)人員仍缺乏歸屬感和穩(wěn)定性，中心培養(yǎng)的技術(shù)人員不斷流失，已有6 人先后離職，這對中心的技術(shù)服務(wù)和長遠(yuǎn)發(fā)展極其不利。

5 結(jié) 語

高校和科研院所冷凍電鏡中心的建成和運(yùn)行，讓多個學(xué)科收益頗豐，在相關(guān)領(lǐng)域的結(jié)構(gòu)和功能研究上取得了一系列具有國際影響力的突破性成果，并將持續(xù)產(chǎn)出。技術(shù)發(fā)展上，冷凍電鏡技術(shù)將向更高分辨率發(fā)起沖擊，實(shí)現(xiàn)接近0.1 nm 超高分辨率結(jié)構(gòu)解析能力，解決諸如藥物設(shè)計、新能源材料、無機(jī)高分子材料和納米光子學(xué)等領(lǐng)域的瓶頸問題，促進(jìn)多學(xué)科交叉會聚，實(shí)現(xiàn)從0～1 的突破；以冷凍電子斷層掃描技術(shù)（Cryo-ET）為主體的原位結(jié)構(gòu)生物技術(shù)將會逐步得到完善和應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞和組織原位解析生物大分子復(fù)合物的高分辨三維結(jié)構(gòu)，揭示物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系。平臺運(yùn)行方面，探索冷凍電鏡平臺收支平衡的運(yùn)行模式至關(guān)重要，建立完善的電鏡技術(shù)體系，實(shí)現(xiàn)自我造血；人才隊伍建設(shè)方面，加強(qiáng)人才隊伍建設(shè)，完善晉升和績效考核機(jī)制，切實(shí)提高技術(shù)人員待遇，提升技術(shù)人員的歸屬感，設(shè)立實(shí)驗技術(shù)研究專項基金，有助于平臺技術(shù)體系的完善和服務(wù)水平的提高；建立一支穩(wěn)定、高水平的技術(shù)隊伍，引育高層次技術(shù)人才，以技術(shù)提升和高水平服務(wù)為導(dǎo)向，實(shí)現(xiàn)從儀器操作到功能開發(fā)的轉(zhuǎn)變，從服務(wù)科研到引領(lǐng)科研的轉(zhuǎn)變，體現(xiàn)技術(shù)人才的價值。此外，冷凍電鏡相關(guān)設(shè)備主要依賴進(jìn)口，需要國內(nèi)相關(guān)專家共同努力，重點(diǎn)研制冷凍電鏡關(guān)鍵部件，早日實(shí)現(xiàn)自主研發(fā)生產(chǎn)，解決這一領(lǐng)域的“卡脖子”問題。