李霄,黃海,劉慢*

(1.黃河科技學(xué)院 河南省小分子新藥研發(fā)國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室,河南 鄭州 450063;2.河南邁英諾醫(yī)藥科技有限公司,河南 鄭州 450007)

隨著國(guó)家對(duì)中醫(yī)藥的重視,中成藥也得到了飛速的發(fā)展,以其具有性質(zhì)穩(wěn)定,療效確切以及毒副作用小的優(yōu)點(diǎn),使其在臨床上的應(yīng)用日益增多[1-2]。例如自2019年12月爆發(fā)的新冠肺炎以來(lái),中成藥蓮花清瘟膠囊在抗肺炎中發(fā)揮了獨(dú)特的作用和優(yōu)勢(shì)[3]。中成藥由多種中藥材加工而成,有效成分較多,藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不明確,原料藥材容易受品種,產(chǎn)地,加工方法等因素的影響,使中成藥在質(zhì)量控制方面有一定地阻礙。該選題主要以通心絡(luò)膠囊為例,在其目前質(zhì)量控制檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上,用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)檢測(cè)多種化學(xué)成分作為其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

通心絡(luò)膠囊收載于《中國(guó)藥典》2020 年版一部,主要由蟬蛻、水蛭、赤芍、全蝎、土鱉蟲、檀香、乳香、冰片、酸棗仁、蜈蚣、降香與人參制成,具有益氣活血、疏絡(luò)止痛的作用,對(duì)于治療冠心病心絞痛疾病有著明顯的療效,且無(wú)不良反應(yīng),副作用小,是近些年廣泛應(yīng)用于治療腦血管疾病的中成藥制劑[4-8]。通心絡(luò)膠囊現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是以高效液相色譜(HPLC)測(cè)定赤芍中芍藥苷的含量(每粒不得少于0.30 mg)作為質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn),該檢測(cè)方法靈敏度低,分離度低,色譜干擾性比較大,且檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)[9-12]。目前超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)(UPLC-MS/MS)對(duì)復(fù)雜多組分的樣品測(cè)定具有很大的技術(shù)優(yōu)勢(shì),已經(jīng)成為中藥質(zhì)量控制的重要發(fā)展方向[13-17]。因此,該實(shí)驗(yàn)主要使用UPLC-MS/MS儀器,建立同時(shí)測(cè)通心絡(luò)膠囊中3種成分(芍藥苷、斯皮諾素、人參皂苷Rg1)的含量的實(shí)驗(yàn)方法,作為該藥物的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。該分析檢測(cè)方法樣品處理簡(jiǎn)單,專一性比較強(qiáng),靈敏度高,分析檢測(cè)時(shí)間短,在通心絡(luò)膠囊的質(zhì)量控制方面具有一定的應(yīng)用價(jià)值。芍藥苷、斯皮諾素和人參皂苷Rg1的結(jié)構(gòu)式分別如下圖1所示。

圖1 芍藥苷(a)、斯皮諾素(b) 和 人參皂苷 Rg1(c)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

Agilent1290/6420 超高液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀,色譜柱(Agilent Poroshell Plus C182.1 mm×50 mm,1.9 μm),移液槍(美國(guó)瑞寧),十萬(wàn)分之一電子分析天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器);KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

超純水(湖南科爾頓水務(wù)有限公司);乙腈(質(zhì)譜純,賽默飛世爾科技有限公司);甲醇(質(zhì)譜純,賽默飛世爾科技有限公司);甲酸(上海瀚思化工有限公司);標(biāo)準(zhǔn)品:人參皂苷Rg1 (批號(hào):B21055)和芍藥苷(批號(hào):B21148)和斯皮諾素(批號(hào):B21200)均購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司,所購(gòu)得標(biāo)準(zhǔn)品的純度>98%。不同批次的通心絡(luò)膠囊樣品購(gòu)于鄭州各藥店,樣品批號(hào)分別為:A2003009,A2005045,B2012020。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分析條件

色譜條件:Agilent Eclipes Plus C18(2.1 mm×50 mm,1.9 μm)色譜柱,流動(dòng)相A:0.05%(體積分?jǐn)?shù))的甲酸水溶液,B:0.05%(體積分?jǐn)?shù))的甲酸-乙腈,流速:0.3 mL/min,進(jìn)樣量:10 μL,柱溫箱:40 ℃,梯度洗脫程序:0～0.2 min,(90%A～10%B),0.2～5 min,(60%A～40%B),5～6 min,(0%A～100%B),6～8 min,(90%A～10%B)。

質(zhì)譜條件:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM),正/負(fù)離子掃描,(ESI)電噴霧離子源,脫溶劑氣體是N2,流速為12 L/ min,離子化溫度為345 ℃,毛細(xì)管電壓為4.0 kV,碰撞氣氮?dú)?。三個(gè)分析物的質(zhì)譜檢測(cè)見表1,提取的分析物的總離子流圖見圖2。

表1 3個(gè)分析物的UPLC-MS/MS檢測(cè)參數(shù)

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品(a), 芍藥苷(b) ,斯皮諾素(c)和人參皂苷Rg1 (d)的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)色譜圖

1.4 溶液的配制

1.4.1 對(duì)照品溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取芍藥苷、斯皮諾素和人參皂苷Rg1標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg于10 mL的容量瓶中,并使用50%(體積分?jǐn)?shù))甲醇溶解后定容,搖勻,即可得0.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。再分別使用移液槍移取600 μL的芍藥苷、40 μL斯皮諾素和40 μL的人參皂苷Rg1到10 mL的容量瓶中,用50%的甲醇定容后分別制成含芍藥苷、斯皮諾素、人參皂苷Rg1 標(biāo)準(zhǔn)品30.0 μg /mL,2.0 μg /mL,2.0 μg /mL的混合對(duì)照品溶液待用。

1.4.2 供試品溶液的配制

精密稱量通心絡(luò)膠囊粉末100.00 mg到10 mL容量瓶中,用50%的甲醇溶解并定容,隨后超聲10 min使其溶解均勻。取其超聲后溶液用0.45 μm的微孔濾膜進(jìn)行過濾,所得濾液即為供試品溶液。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 線性關(guān)系考察以及檢出限和定量限

吸取0.5 mL混合對(duì)照品溶液,在“1.4.1”基礎(chǔ)上,再稀釋一倍,配成芍藥苷、斯皮諾素、人參皂苷Rg1的質(zhì)量濃度分別為10,1,1 μg/mL的混合對(duì)照品。并對(duì)其進(jìn)行逐級(jí)稀釋,使形成濃度梯度。按照“1.3.1”的分析方法測(cè)試,記錄各濃度下芍藥苷、斯皮諾素、人參皂苷Rg1的色譜峰面積,以化合物的濃度為橫坐標(biāo),定量離子的峰面積為縱坐標(biāo),得每個(gè)化合物的線性回歸方程和線性關(guān)系。芍藥苷、斯皮諾素、人參皂苷Rg1的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍分別為:y=22 595x+57 989,r=0.998 1,10.0～10 000.0 ng/mL;y=56 364x+1 429.6,r=0.999 6,1.0～

1 000.0 ng/mL;y=3 591x+64.388,r=0.998 0,10.0～1 000.0 ng/mL。在10 ng/mL的混合對(duì)照品的基礎(chǔ)上,50%的甲醇水稀釋,按照“1.3.1”的分析方法測(cè)試,當(dāng)信噪比S/N是3和10時(shí)得該方法的檢測(cè)限和定量限。其檢測(cè)限分別為:2.0,0.4,3.4 μg /mL;定量限分別為:6.8,1.4,11.5 μg /mL。

2.1.2 精密度試驗(yàn)

取“1.4.1”項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液,按“1.3.1”項(xiàng)下所記錄分析條件連續(xù)進(jìn)樣6次,并進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果顯示:芍藥苷、斯皮諾素、人參皂苷Rg1峰面積的RSD值分別是0.45%,0.64%,2.01%,表明儀器精密度良好。

2.1.3 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取通心絡(luò)膠囊樣品6份,按“1.4.2”項(xiàng)下所記錄方法處理,平行制備6份供試品溶液,按“1.3.1”項(xiàng)下分析方法進(jìn)樣,結(jié)果顯示芍藥苷、斯皮諾素、人參皂苷Rg1峰面積的RSD值分別為1.8%,2.3%,2.2%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按照“1.4.2”項(xiàng)下條件配置供試品溶液,按“1.3.1”項(xiàng)下所記錄分析條件,分別在0,2,4,6,8,24 h進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果表明芍藥苷、斯皮諾素、人參皂苷 Rg1峰面積的RSD值分別為:2.5%,4.2%,3.6%。說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

取同一批次樣品(批號(hào):A2003009),按“1.4.2”項(xiàng)下記所錄方法處理,平行制備6份供試品溶液,按“1.3.1”項(xiàng)下所記錄分析條件,測(cè)出其芍藥苷、斯皮諾素、人參皂苷Rg1的峰面積,并依據(jù)“1.4.3”項(xiàng)下的線性回歸方程,計(jì)算出每組樣品中芍藥苷、斯皮諾素、人參皂苷 Rg1的濃度。再將這6份供試品溶液每份各取200 μL于樣品小瓶中,并各加“1.4.1”項(xiàng)方法下配制的混合對(duì)照品溶液200 μL,得到通心絡(luò)膠囊的樣品加標(biāo)溶液。按“1.3.1”項(xiàng)下所記錄的分析條件進(jìn)行處理,記錄峰面積并計(jì)算其加標(biāo)回收率。計(jì)算結(jié)果見表2。

表2 芍藥苷、斯皮諾素、人參皂苷 Rg1 的加樣回收率結(jié)果(n=6)

2.2 樣品含量測(cè)定

本次測(cè)量選取同一廠家3個(gè)不同批次的樣品,每個(gè)批次按“1.4.2”項(xiàng)下所記錄的方法制配6份樣品,按“1.3.1”項(xiàng)下所記錄分析條件進(jìn)行分析,記錄峰面積并計(jì)算樣品中芍藥苷、斯皮諾素、人參皂苷Rg1的含量的平均值。結(jié)果見表3。

表3 通心絡(luò)膠囊中芍藥苷、斯皮諾素、人參皂苷Rg1含量(n=3) 單位:μg/g

3 討論

3.1 檢測(cè)方法選擇

本實(shí)驗(yàn)初期使用HPLC法檢測(cè),由于人參皂苷Rg1含量低,紫外吸收弱,斯皮諾素與芍藥苷的極性相近,分離度和靈敏度均比較低,且樣品背景干擾比較大,實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性相對(duì)較差,故選擇專一性相對(duì)較強(qiáng),靈敏度相對(duì)較高的LC-MS/MS的MRM(多反應(yīng)監(jiān)測(cè))模式進(jìn)行定量檢測(cè)。

3.2 色譜條件選擇

并對(duì)該檢測(cè)方法的色譜條件的優(yōu)化:考察了不同體系的流動(dòng)相和不同的色譜柱對(duì)樣品分離效果的影響。分別采用中性乙腈和水體系、乙腈(0.02% 甲酸,體積分?jǐn)?shù))和水乙腈(0.02%甲酸,體積分?jǐn)?shù))體系,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在酸性體系下,化合物的峰型對(duì)比較對(duì)稱以及質(zhì)譜信號(hào)較強(qiáng)。由于芍藥苷與斯皮諾素的極性相近,故實(shí)驗(yàn)過程中我們?cè)囼?yàn)了三根色譜柱,化合分別是:Agilent Poroshell 120 Ec-C18(3.0 mm×50 mm,2.7 μm)、Agilent Eclipse Plus C18RRHD(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)、Agilent Poroshell 120 Ec-C18(2.1 mm×50 mm,1.9 μm)。結(jié)果表明:在使用Agilent Poroshell 120 Ec-C18(2.1 mm×50 mm,1.9 μm)柱時(shí)芍藥苷與斯皮諾素的分離度最比較大。同時(shí)該方法采用梯度洗脫,可以有效提高洗脫能力,節(jié)省溶劑,縮短分析時(shí)間。

3.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化

質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化,人參皂苷Rg1、芍藥苷都在負(fù)離子模式下質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng),而斯皮諾素在正離子模式下質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)。通過離子掃描找尋三個(gè)化合物相對(duì)應(yīng)的碎片離子,并優(yōu)化了MRM檢測(cè)模式下每個(gè)化合物的裂解電壓和碰撞能量,以保證被檢測(cè)的化合物都有較高的質(zhì)譜響應(yīng)信號(hào)。

3.4 樣品處理?xiàng)l件的優(yōu)化

在處理樣品時(shí),我們分別從溶劑的種類,比例、超聲的時(shí)長(zhǎng)上進(jìn)行優(yōu)化。首先分別使用75%乙醇,50%、75%的甲醇水溶液和純甲醇溶解樣品(不同比例的溶劑都做三組平行實(shí)驗(yàn)),檢測(cè)結(jié)果表明,使用50%甲醇水溶液作溶劑時(shí)相較于其他比例的溶劑3個(gè)化合物有最大峰面積。再以50%的甲醇水溶液處理樣品,分別設(shè)置超聲時(shí)間為10,20,30,40 min。結(jié)果表明:超聲10 min后3個(gè)化合物的峰面積已經(jīng)達(dá)到最大值。

4 結(jié)論

使用UPLC-MS/MS建立了快速檢測(cè)通心絡(luò)膠囊中芍藥苷、斯皮諾素和人參皂苷Rg1含量的方法,并對(duì)該方法進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證,該方法具有前處理簡(jiǎn)單、靈敏度高、檢測(cè)時(shí)間短、專一性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),為通心絡(luò)膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)以及質(zhì)量控制的完善提供了可靠依據(jù)。