李文靜 郝翠翠 楊超

(聊城市第二人民醫(yī)院內(nèi)分泌科,山東 聊城 252600)

糖尿病是以高血糖為特征的全身代謝性疾病,胰島β細(xì)胞功能受損、胰島素分泌不足,導(dǎo)致血糖升高,是糖尿病發(fā)病的重要病理生理基礎(chǔ),而長(zhǎng)期高血糖將對(duì)胰島β細(xì)胞功能造成不可逆轉(zhuǎn)的損傷〔1～3〕。因此保護(hù)胰島β細(xì)胞功能和數(shù)量對(duì)控制機(jī)體血糖穩(wěn)定至關(guān)重要。丹參酮ⅡA是丹參干燥根莖的脂溶性活性成分,已有研究表明,丹參酮ⅡA對(duì)糖尿病及其并發(fā)癥具有顯著療效〔4,5〕。然而,目前丹參酮ⅡA對(duì)高糖狀態(tài)下胰島β細(xì)胞功能損傷的影響尚不清楚。本研究觀察不同濃度丹參酮ⅡA對(duì)高糖狀態(tài)下胰島β細(xì)胞存活、凋亡和胰島素分泌的影響及其潛在分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 胰島β細(xì)胞株INS-1(中科院上海細(xì)胞庫(kù));丹參酮ⅡA(美國(guó)Sigma公司);DMEM正常糖培養(yǎng)基和高糖培養(yǎng)基(美國(guó)Invitrogen公司);胎牛血清(北京索萊寶生物公司);Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑〔賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司〕;CCK8試劑盒(北京沃比森科技有限公司);膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin Ⅴ-FITC/PI)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(上海貝博生物公司);胰島素酶聯(lián)免疫分析試劑盒(北京索萊寶生物公司);Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司);RIPA裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將冷凍的INS-1細(xì)胞放入37 ℃水浴鍋中融化,完全融化后在無菌超凈工作臺(tái)中吸出細(xì)胞懸液至新的無菌離心管中,加入適量含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,吸打混勻后,離心,棄上清,重懸,將細(xì)胞懸液接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中,置于37 ℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)至細(xì)胞匯合達(dá)90%左右,棄去培養(yǎng)液,加入0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞,進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的INS-1細(xì)胞,參照Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑說明書,分別將慢病毒過表達(dá)空載體(Lv-NC)、慢病毒circ_0056891過表達(dá)載體(Lv-circ_0056891)、小干擾RNA(siRNA)陰性對(duì)照(si-NC)、siRNA circ_0056891(si-circ_0056891)轉(zhuǎn)染至細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后48 h用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3細(xì)胞分組處理 將INS-1細(xì)胞以5×104個(gè)/孔接種于96孔板中,并隨機(jī)分組,正常糖組:培養(yǎng)液中葡萄糖濃度為5.5 mmol/L;高糖組:培養(yǎng)液中葡萄糖濃度為30 mmol/L;高糖+丹參酮ⅡA組:培養(yǎng)液中含有葡萄糖終濃度30 mmol/L和丹參酮ⅡA終濃度10、20、40 μmol/ml;高糖+Lv-NC組:轉(zhuǎn)染Lv-NC的細(xì)胞在葡萄糖濃度為30 mmol/L的培養(yǎng)液培養(yǎng);高糖+Lv-circ_0056891組:轉(zhuǎn)染Lv-circ_0056891的細(xì)胞在葡萄糖濃度為30 mmol/L的培養(yǎng)液培養(yǎng);高糖+丹參酮ⅡA+si-NC:轉(zhuǎn)染si-NC的細(xì)胞在葡萄糖濃度為30 mmol/L和丹參酮ⅡA濃度為40 μmol/ml的培養(yǎng)液培養(yǎng);高糖組+丹參酮ⅡA +si-circ_0056891:轉(zhuǎn)染si-circ_0056891的細(xì)胞在葡萄糖濃度為30 mmol/L和丹參酮ⅡA濃度為40 μmol/ml的培養(yǎng)液中培養(yǎng)。

1.4CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞存活 將INS-1細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種于96孔板中,常規(guī)培養(yǎng)24 h后,更換無血清的培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)24 h,然后按上述分組,更換相應(yīng)培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h。每孔加入CCK8溶液10 μl,孵育2h后,酶標(biāo)儀測(cè)定每孔450 nm處吸光度值(A值)。細(xì)胞存活率(%)=(藥物組A值-空白組A值)/(對(duì)照組A值-空白組A值)。

1.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 按1.3中描述的方法處理INS-1細(xì)胞,并收集各組細(xì)胞,預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次,參照Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒,使用1×結(jié)合繪沖液重懸細(xì)胞,將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至流式管中,分別加入5 μl Annexin V-FITc和5 μl PI輕輕混勻,避光孵育10 min,流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)胰島素分泌 使用胰島素酶聯(lián)免疫分析試劑盒檢測(cè)處理后INS-1細(xì)胞胰島素分泌。

1.7實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)circ_0056891的表達(dá) 采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA,紫外分光光度法檢測(cè)RNA樣品OD260/OD280比值為1.8～2.0,1.5%瓊脂糖凝膠檢測(cè)RNA樣品沒有降解,可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA樣品轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR,反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃、5 s,60 ℃、30 s,40個(gè)循環(huán)。結(jié)果以GAPDH為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計(jì)算circ_0056891及p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.8Western印跡檢測(cè)p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá) 采用RIPA裂解法提取細(xì)胞總蛋白,二喹啉甲酸(BCA)法檢測(cè)蛋白樣品濃度,取蛋白樣品放入100 ℃沸水中變性10 min,然后用于十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離目的蛋白。轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,將膜放入封閉液中封閉2 h,Tris鹽酸緩沖液吐溫(TBST)沖洗,加入稀釋后的一抗中,4 ℃孵育過夜,TBST沖洗后,加入稀釋后的二抗中,室溫孵育2 h,TBST沖洗。將膜放入發(fā)光液中顯色,凝膠成像系統(tǒng)下曝光、拍照。使用ImageJ軟件分析目的蛋白灰度值。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1丹參酮ⅡA對(duì)高糖誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞存活、凋亡和胰島素分泌的影響 與正常糖組比較,高糖組細(xì)胞存活率明顯降低,細(xì)胞凋亡率及胰島素分泌明顯升高(P<0.05);與高糖組比較,高糖+丹參酮ⅡA各劑量組細(xì)胞存活率及胰島素分泌明顯升高,細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。見圖1、表1。

表1 各組細(xì)胞存活、凋亡和胰島素分泌和circ_0056891相對(duì)表達(dá)量比較

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡

2.2丹參酮ⅡA對(duì)高糖誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞中circ_0056891表達(dá)的影響 與正常糖組比較,高糖組細(xì)胞中circ_0056891相對(duì)表達(dá)水平明顯降低(P<0.05);與高糖組比較,高糖+丹參酮ⅡA各劑量組細(xì)胞中circ_0056891相對(duì)表達(dá)水平明顯升高(P<0.05),且丹參酮ⅡA濃度越高,circ_0056891相對(duì)表達(dá)水平越高。見表1。

2.3過表達(dá)circ_0056891對(duì)高糖誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞存活、凋亡和胰島素分泌的影響 與正常糖組比較,高糖組細(xì)胞存活率明顯降低,細(xì)胞凋亡率及胰島素分泌明顯升高(P<0.05);與高糖+Lv-NC組比較,高糖+Lv-circ_0056891細(xì)胞存活率及胰島素分泌明顯升高,細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 過表達(dá)circ_0056891對(duì)高糖誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞增殖、凋亡和胰島素分泌的影響

2.4丹參酮ⅡA調(diào)控circ_0056891對(duì)INS-1細(xì)胞中PI3K/AKT信號(hào)通路的影響 與正常糖組比較,高糖組細(xì)胞中p-PI3K和p-AKT mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)均明顯降低(P<0.05);與高糖組比較,高糖+丹參酮ⅡA組細(xì)胞中p-PI3K和p-AKT mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)均明顯升高(P<0.05);與高糖+丹參酮ⅡA+si-NC組比較,高糖組+丹參酮ⅡA +si-circ_0056891組細(xì)胞中p-PI3K和p-AKT mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)均明顯降低(P<0.05)。見圖2、表3。

表3 各組細(xì)胞存活、凋亡和胰島素分泌和p-PI3K、p-AKT mRNA蛋白相對(duì)表達(dá)比較

1～5:正常糖組、高糖組、高糖+丹參酮ⅡA組、高糖+丹參酮ⅡA+si-NC組、高糖組+丹參酮ⅡA+si-circ_0056891組

2.5敲減circ_0056891逆轉(zhuǎn)丹參酮ⅡA對(duì)高糖下INS-1細(xì)胞存活、凋亡和胰島素分泌的影響 與高糖組比較,高糖+丹參酮ⅡA組細(xì)胞存活率及胰島素分泌明顯升高,細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05);與高糖+丹參酮ⅡA +si-NC組比較,高糖組+丹參酮ⅡA +si-circ_0056891組細(xì)胞存活率及胰島素分泌明顯降低,細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)。見表3。

3 討 論

丹參酮ⅡA是丹參中最活躍的一類脂溶性成分,具有抗炎、抗氧化等多種生物活性〔6〕。研究表明,丹參酮ⅡA能夠減輕糖尿病大鼠腎組織病理?yè)p傷,保護(hù)腎組織;減輕糖尿病大鼠冠狀動(dòng)脈組織病變,抑制血管炎癥;還可以顯著降低糖尿病大鼠周圍神經(jīng)細(xì)胞凋亡,抑制周圍神經(jīng)病變〔7～10〕。胰島β細(xì)胞的主要作用是分泌胰島素,調(diào)節(jié)機(jī)體血糖含量,但隨著糖尿病的發(fā)展,胰島β細(xì)胞失代償可導(dǎo)致血糖持續(xù)升高,進(jìn)而刺激胰島β細(xì)胞發(fā)生不可逆的損傷乃至衰竭〔11,12,3〕。本研究結(jié)果提示,丹參酮ⅡA能夠有效促進(jìn)高糖刺激下INS-1細(xì)胞的存活,抑制高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,有效促進(jìn)高糖狀態(tài)下INS-1細(xì)胞的胰島素分泌。

環(huán)狀RNA(circRNA)是一種內(nèi)源性非編碼RNA,研究表明,circRNA廣泛參與細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控,與神經(jīng)性疾病、動(dòng)脈粥樣硬化性疾病、癌癥、炎癥等多種疾病的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)〔13,14〕。研究表明〔15～17〕,circRNA在糖尿病發(fā)病、進(jìn)展、疾病診斷及治療等方面均具有重要作用,可參與糖尿病下β細(xì)胞功能障礙的調(diào)節(jié)。circ_0056891是一種糖尿病相關(guān)的circRNA,在2型糖尿病中低表達(dá),可增加糖尿病的患病風(fēng)險(xiǎn),且對(duì)糖尿病具有一定診斷價(jià)值〔18〕。但circ_0056891在胰島β細(xì)胞中的表達(dá)和作用尚不可知。本研究結(jié)果表明,高糖刺激下INS-1細(xì)胞中circ_0056891表達(dá)降低,而丹參酮ⅡA處理可以上調(diào)高糖狀態(tài)下INS-1細(xì)胞中circ_0056891的表達(dá),抑制circ_0056891后逆轉(zhuǎn)了丹參酮ⅡA對(duì)高糖下INS-1細(xì)胞功能的保護(hù)作用。提示丹參酮ⅡA可能通過上調(diào)circ_0056891減輕高糖對(duì)INS-1細(xì)胞的損傷。

PI3K/AKT信號(hào)通路參與細(xì)胞增殖、凋亡、分化和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)〔19〕。研究表明,PI3K/AKT信號(hào)通路是胰島素效應(yīng)組織調(diào)節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵通路之一,激活PI3K/AKT信號(hào)通路可以拮抗脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡和胰島素分泌障礙,還可保護(hù)2型糖尿病胰島β細(xì)胞,是改善糖尿病胰島素抵抗的有效途徑〔20～22〕。本研究結(jié)果提示,上調(diào)circ_0056891/PI3K/AKT信號(hào)通路可能是丹參酮ⅡA保護(hù)INS-1細(xì)胞免受高糖刺激損傷的潛在分子機(jī)制。

綜上,丹參酮ⅡA能夠促進(jìn)高糖狀態(tài)下INS-1細(xì)胞的存活,抑制細(xì)胞凋亡,并促進(jìn)細(xì)胞胰島素分泌,其作用機(jī)制是上調(diào)circ_0056891的表達(dá),進(jìn)而激活PI3K/AKT信號(hào)通路。