潘世杰 蔣俊玲 趙俊峰 周磊 王交托

(1河南中醫(yī)藥大學(xué),河南 鄭州 450000;2河南省中醫(yī)院泌尿外科)

腎癌是腎實(shí)質(zhì)內(nèi)小管上皮惡變,研究指出2021年新增約7.6萬(wàn)例腎癌,因其死亡者約1.4萬(wàn)〔1〕;國(guó)內(nèi)學(xué)者研究預(yù)測(cè)2025年腎癌死亡率將較2019年增加7.74%〔2〕。半數(shù)以上無(wú)癥狀腎癌(偶發(fā)性腎癌)確診時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移,根治性腎切除術(shù)(RN)及輔助療法效果欠佳,其5年生存率無(wú)法超越10%〔3〕。白屈菜是白屈菜屬(隸屬于罌粟科植物)干燥全草的總稱,經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)其有效成分白屈菜堿可抑制許多癌細(xì)胞增殖,如乳腺癌(MCF-7細(xì)胞)、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤及人口腔上皮樣癌(KB細(xì)胞)等,且有研究證實(shí),該中藥單體也有助于逆轉(zhuǎn)多重耐藥(MDR)的乳癌細(xì)胞作用〔4～7〕。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1/Smad信號(hào)通路對(duì)腎癌進(jìn)展有不可估量的作用,但白屈菜堿基于TGF-β1/Smad通路對(duì)腎癌的影響機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)旨在探究中藥白屈菜堿調(diào)控TGF-β1/Smad信號(hào)通路干預(yù)腎癌荷瘤小鼠的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及動(dòng)物 小鼠腎癌細(xì)胞,購(gòu)于BNCC公司;SPF級(jí)BALB/c雄性4～8周齡小鼠,體質(zhì)量18～20 g,購(gòu)自鄭州市惠濟(jì)區(qū)華興實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng),許可證號(hào):SCXK(豫)2019-0002。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑 白屈菜堿購(gòu)于MedChemExpress公司;培養(yǎng)基(RPMI1640)、0.25%胰酶-乙二胺四乙酸(EDTA)、胎牛血清(FBS)和磷酸鹽緩沖液(PBS)等購(gòu)自以色列BI公司;二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒,購(gòu)自碧云天(Beyotime)生物技術(shù)有限公司;青-鏈霉素混合液(PS)、二甲基亞砜(DMSO)和RIPA裂解液及ECL顯影液購(gòu)自索萊寶公司;Smad3蛋白購(gòu)自美國(guó)CST公司;Smad7蛋白購(gòu)自Thermo Fisher公司;Bcl-2、Bax、Caspase-3及二抗均購(gòu)自Rockland公司;內(nèi)參蛋白GAPDH購(gòu)自武漢三鷹有限公司。

1.3培養(yǎng)Renca細(xì)胞 取腎癌Renca細(xì)胞進(jìn)行解凍及復(fù)蘇,后放于完全培養(yǎng)基中恒溫培養(yǎng),達(dá)80%～90%飽和度時(shí)用胰蛋白酶消化離心,配制1×107個(gè)/ml Renca細(xì)胞懸液,置于盛有冰塊的泡沫箱備用。

1.4構(gòu)建腎癌荷瘤小鼠 待新購(gòu)買的小鼠在IVC籠盒系統(tǒng)適應(yīng)性生存1 w后,在每只小鼠右前肢腋窩處皮下注射0.15 ml充分混勻的腎癌Renca細(xì)胞懸液。

1.5分組及給藥 種植癌細(xì)胞后,隨機(jī)分為對(duì)照組(模型組)和實(shí)驗(yàn)組(白屈菜堿組),每組8只,觀察瘤塊的生長(zhǎng)情況,種植癌細(xì)胞約2 w,觀察造模成功。實(shí)驗(yàn)組給20 mg/kg白屈菜堿溶液灌胃;對(duì)照組按照相同劑量給生理鹽水進(jìn)行灌胃;給藥 14 d,藥物干預(yù)期間每間隔2 d用游標(biāo)卡尺測(cè)量腎癌荷瘤小鼠瘤塊長(zhǎng)徑和短徑,電子天平測(cè)量腎癌荷瘤小鼠體質(zhì)量。藥物干預(yù)結(jié)束后麻醉小鼠,仔細(xì)剝離腎癌荷瘤小鼠皮下的種植瘤塊,將各瘤塊分兩半,分別用液氮冷凍保存和4%多聚甲醛固定。抑瘤率=〔(對(duì)照組瘤塊重量-實(shí)驗(yàn)組瘤塊重量)/對(duì)照組瘤塊重量〕×100%。

1.6蘇木素-伊紅(HE)染色觀察各組腎癌荷瘤小鼠瘤塊組織病理改變 (1)將腎癌荷瘤小鼠腫瘤切成合適大小放于組織包埋盒中標(biāo)記;(2)將瘤塊脫水→浸蠟→石蠟包埋→瘤塊組織病理切片→切片攤片→烘烤組織切片→脫蠟水化、蘇木素染色→分色→伊紅染色→脫水透明→封片及圖像采集。

1.7Western印跡法檢測(cè)瘤塊 TGF-β1/Smad 通路相關(guān)及增殖相關(guān)蛋白表達(dá)情況 (1)在配制好的蛋白裂解液中加入腎癌荷瘤小鼠的瘤塊組織進(jìn)行蛋白提取;(2)采用BCA 法進(jìn)行蛋白定量;(3)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)進(jìn)行蛋白電泳;(4)將目的蛋白采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜;(5)采用濃度5%脫脂奶粉進(jìn)行蛋白封閉;(6)進(jìn)行封閉后的蛋白條帶進(jìn)行目的蛋白條帶片段剪裁,將相應(yīng)目的條帶加入 Smad3、Smad7、Bax、Bcl-2、Caspase-3及GAPDH一抗后進(jìn)行孵育,4 ℃搖床下過(guò)夜;(7)TBST洗滌目的條帶后放置于二抗中進(jìn)行1 h孵育二抗;(8)ECL顯色;(9)采用ImageLab軟件進(jìn)行目的蛋白的定量分析,檢測(cè)條帶灰度值。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS24.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1繪制腎癌荷瘤小鼠時(shí)間-體積曲線圖及計(jì)算白屈菜堿的抑瘤率 建造腎癌荷瘤小鼠模型過(guò)程中,瘤塊種植成功率為93.75%;在藥物干預(yù)模型小鼠期間,腎癌荷瘤小鼠無(wú)死亡,即100.00%存活率,表明中藥白屈菜堿給藥劑量對(duì)腎癌荷瘤小鼠未發(fā)生短期或明顯毒理作用,或在該劑量濃度作用下,小鼠耐受力尚可調(diào)節(jié);白屈菜堿對(duì)腎癌荷瘤小鼠瘤塊的抑瘤率為43.20%,可見(jiàn)中藥白屈菜堿對(duì)腎癌荷瘤小鼠的瘤塊增殖具有一定抑制效果。且根據(jù)白屈菜堿干預(yù)期間,各組腎癌荷瘤小鼠的腫瘤體積長(zhǎng)勢(shì)可見(jiàn),在白屈菜堿對(duì)腎癌荷瘤小鼠干預(yù)第13天后,白屈菜堿組瘤塊體積較對(duì)照組明顯升高(P<0.05),見(jiàn)表1。

表1 藥物不同時(shí)間兩組瘤塊體積比較

2.2HE染色檢測(cè)兩組腎癌荷瘤小鼠腫瘤組織鏡下病理改變 對(duì)照組腫瘤組織周邊可見(jiàn)有一圈腫瘤假性包膜包裹,且可見(jiàn)該種植瘤的瘤塊組織內(nèi)有壞死(干酪樣)區(qū)域、呈無(wú)規(guī)則性片狀分布。兩組腫瘤組織中形成許多新生血管,且腫瘤細(xì)胞呈異型性,細(xì)胞核呈病理性核分裂象,見(jiàn)圖1。

圖1 兩組腫瘤組織切片病理改變(HE染色)

2.3兩組瘤塊中TGF-β1/Smad通路相關(guān)及增殖相關(guān)蛋白表達(dá)比較 干預(yù)2 w,白屈菜堿組Smad3、Bcl-2蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著下調(diào),Smad7、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05),見(jiàn)表2、圖2。

圖2 兩組TGF-β1/Smad通路相關(guān)及增殖相關(guān)蛋白表達(dá)

表2 兩組瘤塊蛋白表達(dá)比較

3 討 論

腎癌的隱匿性發(fā)病導(dǎo)致其無(wú)法早診斷、早治療,臨床及實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)可知RN對(duì)于晚期腎癌已無(wú)濟(jì)于事,靶向及免疫治療等現(xiàn)代醫(yī)療手段均存在免疫耐受等缺陷,約80%腎癌患者達(dá)不到治愈水平〔8〕。研究表明,一些中醫(yī)藥可通過(guò)調(diào)控基因或相關(guān)通路蛋白等來(lái)誘導(dǎo)、阻礙癌細(xì)胞的周期進(jìn)展等,從而控制癌癥惡化進(jìn)程。中藥白屈菜歸腎、肺、心經(jīng),性涼、味苦、有小毒,該藥對(duì)于身體疼痛能夠較好緩解、對(duì)抗炎癥反應(yīng)及對(duì)一些癌癥進(jìn)展有一定抑制療效,其主要成分包括生物堿類(白屈菜堿、小檗堿、血根堿、白屈菜紅堿、黃連堿、四氫黃連堿及原阿片堿等)及非生物堿(白屈菜酸及白屈菜醇等)〔9,10〕,有助于加速尿液及水分排出、解全身毒素、止咳及全身鎮(zhèn)痛等,在臨床實(shí)踐中,醫(yī)生可通過(guò)用此藥來(lái)治療腹水及全身或局部水腫患者、緩解胃部疼痛感、胃潰瘍及腹痛等癥狀。白屈菜堿是一種異喹啉生物堿,具有抗腫瘤、抗炎癥等特性。Jang等〔11〕研究發(fā)現(xiàn),白屈菜堿可通過(guò)GADD45a-p53誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞的凋亡程序;Xie等〔12〕發(fā)現(xiàn),白屈菜堿可調(diào)控EGFR-AMPK 通路的選擇性,在一定程度上阻礙那些因?yàn)榉眉翘婺?Gefitinib)治療而產(chǎn)生耐藥的非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者的癌細(xì)胞惡化;也有研究表明白屈菜堿可增強(qiáng)樂(lè)伐替尼對(duì)肝癌細(xì)胞的抗腫瘤作用〔13〕。由于腎癌發(fā)病機(jī)制目前尚不明確,有很多病因病機(jī)假說(shuō),其中,TGF-β1/Smad通路在腎癌發(fā)展中發(fā)揮多重效應(yīng),在多種癌癥及炎癥研究中均有對(duì)TGF-β1/Smad信號(hào)通路的探討,該通路在癌癥早期抑制癌細(xì)胞增殖侵襲,癌癥后期反而促進(jìn)癌細(xì)胞進(jìn)一步惡化。Zhu等〔14〕發(fā)現(xiàn),CD82/KAI1(一種轉(zhuǎn)移抑制因子)能夠通過(guò)抑制TGF-β1/Smad信號(hào)調(diào)節(jié),在腎癌的加速惡化進(jìn)程中發(fā)揮不可替代作用;Yu等〔15〕發(fā)現(xiàn)CD151(作為4跨膜超家族的重要成員之一,能夠把整合素接受到的各種生物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞內(nèi),是一種十分重要的細(xì)胞結(jié)構(gòu)基礎(chǔ))通過(guò)激活TGF-β1/Smad信號(hào)促進(jìn)腎癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移;張苗等〔16〕研究發(fā)現(xiàn),通過(guò)下調(diào)一種肽基-脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶能夠抑制腎癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲且可在一定程度影響TGF-β1/Smad通路活化情況,這種被調(diào)節(jié)的物質(zhì)便是FK506結(jié)合蛋白(FKBP)11。

TGF-β1是一種多肽蛋白,研究證實(shí)其具有高度多效性及多種生物學(xué)的功能,且作為啟動(dòng)TGF-β1/Smad信號(hào)通路的一個(gè)初始決定性因子,該因子異常表達(dá)時(shí)與TGF-βⅠ型和Ⅱ型受體結(jié)合并激活后可磷酸化下游受體Smad蛋白(Smad3蛋白為主),將Smad3轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核內(nèi),將上游信號(hào)從胞質(zhì)轉(zhuǎn)入胞核,與細(xì)胞核內(nèi)的相關(guān)目的基因結(jié)合后,有效誘導(dǎo)發(fā)揮促癌效應(yīng),且誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)合成及促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)等,且降低Smad3蛋白表達(dá)水平也可抑制癌細(xì)胞遷移〔17〕。Smad7是TGF-β1/Smad通路中的受體抑制型因子(I-Smad),可與活化后TGF-β Ⅰ型受體結(jié)合以阻斷Smad3磷酸化,達(dá)到負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用;另一方面,Smad7可進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)與Smad3競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合,拮抗 Smad3與TGF-β受體結(jié)合,從而有效阻斷Smad3在TGF-β1/Smad通路中的傳導(dǎo)作用;且Smad泛素化調(diào)節(jié)因子(Smurf)2能選擇性泛素化降解掉Smad7,影響Smad7基因及蛋白表達(dá)水平進(jìn)而調(diào)控癌癥進(jìn)展〔18〕。另有研究發(fā)現(xiàn),磷酸化(p)-Smad3 會(huì)抑制Smad7的轉(zhuǎn)錄,而Smad7與TGF-β Ⅰ型受體結(jié)合又會(huì)抑制p-Smad2和p-Smad3的表達(dá)〔19〕。另外,促凋亡Bax及抗凋亡Bcl-2通過(guò)線粒體途徑調(diào)節(jié)激活下游信號(hào)因子,誘導(dǎo)下游Caspase家族,在一系列效應(yīng)因子共同作用下發(fā)生級(jí)聯(lián)效應(yīng),進(jìn)一步誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡程序發(fā)生。本研究結(jié)果表明白屈菜堿對(duì)腎癌荷瘤小鼠的瘤塊增殖抑制作用可能是通過(guò)調(diào)控Smad3和Smad7蛋白表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)的,但仍需深入研究Smad7對(duì)Smad3抑制作用及Smad3如何調(diào)控其他下游細(xì)胞因子限制腎癌惡變。

綜上,中藥白屈菜堿對(duì)腎癌荷瘤小鼠的瘤塊增殖具有抑制作用,該機(jī)制可能與TGF-β1/Smad信號(hào)通路中因子狀態(tài)相關(guān),Smad3蛋白表達(dá)下調(diào)、Smad7蛋白表達(dá)上調(diào),為白屈菜堿應(yīng)用于臨床以延長(zhǎng)腎癌患者生存率提供研究依據(jù)。