劉志勇 任德啟 郭健 趙彥青 楊明輝 李鋒森 成家宏

(1河南中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院,河南 鄭州 450046;2河南省中醫(yī)院)

心血管系統(tǒng)疾病是世界范圍內(nèi)死亡率極高的一大類(lèi)疾病,動(dòng)脈粥樣硬化是多種心血管系統(tǒng)疾病如心肌梗死、腦卒中等的病理基礎(chǔ),動(dòng)脈粥樣硬化受到基因、飲食習(xí)慣等的影響〔1,2〕。動(dòng)脈粥樣硬化疾病是一種慢性多因性疾病,多與年老體虛有關(guān),本課題認(rèn)為,動(dòng)脈粥樣硬化為本虛標(biāo)實(shí)證,虛、痰、瘀、毒為基本致病因素,氣陰兩虛,痰瘀毒互結(jié)為其基本病機(jī),益氣活血清熱解毒為其基本治法。益氣活血清熱解毒組中藥由制首烏、全蝎、水蛭、天麻、膽南星、蜈蚣、決明子、太子參、桃仁和紅花等組成。既往研究顯示,中風(fēng)防治靈(由制首烏、全蝎、大黃、膽南星、決明子、水蛭、天麻、太子參組成)能夠改善血脂,擴(kuò)張腦血管〔3,4〕?，F(xiàn)階段尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于益氣活血清熱解毒方對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化小鼠的作用研究。本研究探討益氣活血清熱解毒方對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的保護(hù)作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 SPF級(jí)別ApoE-/-小鼠,8周齡,體質(zhì)量18～19 g,購(gòu)自河南省中醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心;Janus酪氨酸蛋白激酶(JAK)1抗體購(gòu)自南京建成生物工程研究所;總膽固醇(TC)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;磷酸化(p)-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)3抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz;三酰甘油(TG)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海信帆生物科技有限公司;低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海信帆生物科研所;p-JAK1抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam;高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自通蔚試劑(上海)有限公司;STAT3抗體購(gòu)自武漢艾美捷科技有限公司;益氣活血清熱解毒方、脂泰寧膠囊、黃連由河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中藥房提供;辛伐他汀片購(gòu)自杭州默沙東制藥有限公司。

1.2動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型構(gòu)建〔5〕和分組處理 SPF級(jí)別ApoE-/-小鼠分成:普通飼料組、模型組、黃連組、脂泰寧組、益氣活血清熱解毒組、辛伐他汀組,普通飼料組給予正常飼料飼喂,其余幾組均給予高脂飼料(0.15%膽固醇、78.85%基礎(chǔ)飼料、21.00%脂肪)飼喂,飼喂12 w后,隨機(jī)選擇2只小鼠處死,蘇木素-伊紅(HE)染色觀(guān)察易損斑形成,視為造模成功。普通飼料組、模型組、黃連組、脂泰寧組、益氣活血清熱解毒組、辛伐他汀組小鼠各10只。從第13周開(kāi)始,黃連組用黃連藥液(黃連6 g溶于70 ml蒸餾水)按照9 ml/(kg·d)劑量灌胃,脂泰寧組用脂泰寧藥液(脂泰寧膠囊,相當(dāng)于制首烏20 g,山楂25 g,澤瀉15 g,決明子12 g,絞股藍(lán)15 g,溶于70 ml蒸餾水中)按照9 ml/(kg·d)劑量灌胃,辛伐他汀組用辛伐他汀藥液(20 mg辛伐他汀溶于70 ml蒸餾水)按照9 ml/(kg·d)劑量灌胃,益氣活血清熱解毒組小鼠用益氣活血清熱解毒藥液(顆粒劑,太子參15 g,制首烏20 g,水蛭8 g,天麻15 g,膽南星8 g,全蝎8 g,決明子20 g,蜈蚣6 g,桃仁10 g,紅花10 g,黃連6 g,溶解在70 ml的蒸餾水中)按照9 ml/(kg·d)劑量灌胃,普通飼料組、模型組以等量的生理鹽水代替。連續(xù)灌胃8 w。

1.3各組小鼠體質(zhì)量測(cè)定 從第12周開(kāi)始,每間隔2 w檢測(cè)小鼠體質(zhì)量,繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.4血脂指標(biāo)TC、TG、LDL-C、HDL-C檢測(cè) 最后一次給藥結(jié)束后12 h,眼眶靜脈叢采血,3 453 r/min離心10 min,分離血清,分別檢測(cè)TC、TG、LDL-C、HDL-C水平,步驟完全按照TC、TG、LDL-C、HDL-C檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積檢測(cè) 采血結(jié)束后,斷椎法將小鼠處死,分離小鼠主動(dòng)脈組織,在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察主動(dòng)脈情況,以計(jì)算機(jī)圖像處理軟件計(jì)算斑塊面積和主動(dòng)脈管腔的面積百分比例。

1.6白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-1β、細(xì)胞間黏附分子(ICAM)-1、血管細(xì)胞黏附分子(VCAM)-1 mRNA表達(dá)檢測(cè) 采血結(jié)束后,斷椎法將小鼠處死,分離小鼠主動(dòng)脈組織,以實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(Realtime PCR)方法檢測(cè) IL-6、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達(dá)差異。在小鼠主動(dòng)脈組織中添加Trizol試劑,反復(fù)吹打混合,在冰上反應(yīng)20 min,常規(guī)方法提取組織中的總RNA,添加50 μl的焦碳酸二乙酯(DEPC)水將RNA溶解,經(jīng)過(guò)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,在1.5 μg的RNA中添加1 μl的Random Hexamers、1 μl的dNTPs,最后添加DEPC水至12.5 μl,在65 ℃孵育5 min,置于冰上孵育5 min,繼續(xù)添加4 μl的5×緩沖液、2 μl的二硫蘇糖醇(DTT)、0.5 μl的反轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)、1 μl的RNaseOUT,置于37 ℃孵育52 min,70 ℃孵育15 min,將合成的cDNA放在-20 ℃保存。以cDNA作為模板,按照SYBR Realtime PCR master mix進(jìn)行PCR,條件如下:0.5 μl的cDNA、10 μl的qPCR master mix、1 μl的上游及下游引物,添加ddH2O至20 μl,PCR程序?yàn)?95 ℃預(yù)變性15 min,95 ℃變性10 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸30 s,設(shè)置40個(gè)循環(huán)。β-actin作為內(nèi)參,根據(jù)得到的Ct值,按照2-△△Ct方法分析目的基因的表達(dá)變化。β-actin上游引物:5′-GGGAAATTCAACGGCACAGT-3',下游:5′-AGATGGTGATGGGCTTCCC-3′,IL-6上游引物:5′-TGAACT-CCTTCTCCACAAGC-3＇,下游:5＇-ATCCAGATTGGAAGCATCCA-3＇,IL-1β上游引物:5＇-CCAAGGAG-ACGGAATACAGG-3′,下游:5′-GTGTTGGTTGTAG-AGGGCAAG-3′,ICAM-1上游引物:5′-TCAGGTATCCATCCATCCCA-3′,下游:5′-CGGTGCCACAGTTCTCAAAG-3′,VCAM-1上游引物:5′-GATAGACAGCCCACTAAACG-3′,下游:5′-TGGAGCCAAACACTTGAC-3′。

1.7p-JAK1、JAK1、p-STAT3、STAT3蛋白表達(dá)檢測(cè) 采血結(jié)束后,斷椎法將小鼠處死,分離小鼠主動(dòng)脈組織,Western印跡檢測(cè)p-JAK1、JAK1、p-STAT3、STAT3蛋白表達(dá)。在小鼠主動(dòng)脈組織中添加RIPA裂解試劑,充分裂解以后,在4 ℃,8 459 r/min離心10 min,吸取上清溶液,按照二喹啉甲酸(BCA)方法檢測(cè)蛋白濃度。在蛋白樣品中添加2×上樣緩沖液,混合后,放在100 ℃煮沸5 min。按照常規(guī)方法配制十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)(10%分離膠,5%濃縮膠),用移液槍分別在每個(gè)上樣孔內(nèi)添加30 μg的蛋白樣品,在濃縮膠內(nèi)以80 V的電壓進(jìn)行電泳,在分離膠中以120 V的電壓進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束以后,將凝膠取出,浸泡在轉(zhuǎn)移緩沖液中備用。把NC膜置于甲醇中浸泡10 s,然后置于轉(zhuǎn)移緩沖液中備用。根據(jù)常規(guī)方法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,轉(zhuǎn)膜操作需要在冰上進(jìn)行。設(shè)置轉(zhuǎn)膜電壓為100 V,轉(zhuǎn)膜時(shí)間為2 h。將NC膜放在含有5%牛血清白蛋白的TBST中,轉(zhuǎn)移到室溫孵育2 h。將NC膜放在含有一抗溶液的平皿內(nèi)(p-JAK1抗體、p-STAT3抗體按照1∶800稀釋,STAT3抗體、JAK1抗體按照1∶1 200稀釋),放在4 ℃結(jié)合過(guò)夜。最后將NC膜放在二抗溶液內(nèi)(二抗按照1∶4 000稀釋),在室溫反應(yīng)2 h。按照ECL顯色試劑盒顯色。以β-actin作為內(nèi)參,根據(jù)灰度值分析目的蛋白的表達(dá)變化。灰度值分析用ImageJ進(jìn)行。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1益氣活血清熱解毒方對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化小鼠體質(zhì)量影響 普通飼料組16、18、20 w體質(zhì)量明顯低于模型組,黃連組、脂泰寧組18、20 w體質(zhì)量明顯低于模型組,益氣活血清熱解毒組、辛伐他汀組16、18、20 w體質(zhì)量均明顯低于模型組,并且黃連組、脂泰寧組18、20 w體質(zhì)量明顯高于益氣活血清熱解毒組、辛伐他汀組(均P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組體質(zhì)量變化比較

2.2益氣活血清熱解毒方對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化小鼠血脂影響 與普通飼料組比較,模型組TC、TG和LDL-C水平明顯升高,HDL-C水平明顯降低(P<0.05);與模型組比較,黃連組、脂泰寧組、益氣活血清熱解毒組、辛伐他汀組TC、TG和LDL-C水平明顯降低,HDL-C水平明顯升高(P<0.05);并且與黃連組、脂泰寧組比較,益氣活血清熱解毒組TC、TG和LDL-C水平明顯降低,HDL-C水平明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組血脂指標(biāo)、斑塊面積比較

2.3益氣活血清熱解毒方對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化小鼠斑塊面積影響 與普通飼料組比較,模型組動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積明顯增加(P<0.05);與模型組比較,黃連組、脂泰寧組、益氣活血清熱解毒組、辛伐他汀組動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積明顯減小(P<0.05);與黃連組、脂泰寧組比較,益氣活血清熱解毒組動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積明顯減小(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.4益氣活血清熱解毒方對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化小鼠炎癥介質(zhì)影響 與普通飼料組比較,模型組IL-6、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1 mRNA水平明顯增加(P<0.05);與模型組比較,黃連組、脂泰寧組、益氣活血清熱解毒組、辛伐他汀組IL-6、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1 mRNA水平明顯降低(P<0.05);與黃連組、脂泰寧組比較,益氣活血清熱解毒組IL-6、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1 mRNA水平明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組主動(dòng)脈炎癥因子IL-6、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1 mRNA、p-JAK1/JAK1、p-STAT3/STAT3蛋白表達(dá)水平比較

2.5益氣活血清熱解毒方對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化小鼠JAK/STAT3信號(hào)通路的影響 與普通飼料組比較,模型組p-JAK1/JAK1、p-STAT3/STAT3蛋白水平明顯增加(P<0.05);與模型組比較,黃連組、脂泰寧組、益氣活血清熱解毒組、辛伐他汀組p-JAK1/JAK1、p-STAT3/STAT3蛋白水平明顯降低(P<0.05);與黃連組、脂泰寧組比較,益氣活血清熱解毒組小鼠p-JAK1/JAK1、p-STAT3/STAT3蛋白水平明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表3。

3 討 論

動(dòng)脈粥樣硬化最初的表現(xiàn)為大、中動(dòng)脈出現(xiàn)脂質(zhì)條紋,含有大量的脂蛋白殘粒、LDL,血液中大量的LDL沉積在動(dòng)脈分支,導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞被激活,引起炎癥反應(yīng)〔6～8〕。LDL還可以刺激內(nèi)皮細(xì)胞釋放更多的趨化因子,誘導(dǎo)ICAM-1、VCAM-1等表達(dá),加強(qiáng)單核細(xì)胞的黏附,最終形成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊〔9,10〕。IL-6、IL-1β是在動(dòng)脈粥樣硬化中表達(dá)上調(diào)的炎癥因子,二者表達(dá)增加后誘導(dǎo)機(jī)體炎癥反應(yīng),加重組織損傷〔11～14〕。

益氣活血清熱解毒方是由太子參、制首烏、水蛭、天麻、膽南星、全蝎、決明子、蜈蚣、桃仁和紅花等組成的,臨床上已經(jīng)證明其具有改善脂代謝等作用〔3,4〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,益氣活血清熱解毒方改善動(dòng)脈粥樣硬化血脂、炎癥,減少動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成,益氣活血清熱解毒方有動(dòng)脈粥樣硬化保護(hù)作用。黃連具有清熱解毒的功效,脂泰寧有益氣活血的作用〔15,16〕。本實(shí)驗(yàn)還比較了益氣活血清熱解毒方與單純黃連或脂泰寧的治療效果,發(fā)現(xiàn)益氣活血清熱解毒方對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化血脂、炎癥和斑塊形成的改善作用均優(yōu)于單純黃連或脂泰寧的治療效果。

中藥發(fā)揮藥理學(xué)作用的機(jī)制十分復(fù)雜,很多研究已經(jīng)證明中藥能夠通過(guò)影響信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮作用〔17～19〕。JAK是非受體型酪氨酸激酶,在胚胎發(fā)育過(guò)程中具有重要作用,STAT3是STAT蛋白家族成員,其可以被IL-6等相關(guān)細(xì)胞因子激活〔20,21〕。JAK/STAT3信號(hào)通路傳導(dǎo)途徑大致可以表述為:細(xì)胞因子與受體相互結(jié)合后,誘導(dǎo)受體分子發(fā)生二聚化,導(dǎo)致和受體耦聯(lián)的JAK發(fā)生磷酸化,磷酸化的JAK能夠催化受體酪氨酸發(fā)生磷酸化,形成STAT3?？课稽c(diǎn),導(dǎo)致STAT3發(fā)生磷酸化,STAT3形成二聚體進(jìn)入細(xì)胞核,進(jìn)而調(diào)控下游基因的表達(dá)〔22〕。JAK/STAT3參與調(diào)控炎癥、細(xì)胞生長(zhǎng)、氧化應(yīng)激等多個(gè)過(guò)程,并且與疾病進(jìn)展有關(guān)〔23〕。研究顯示,JAK/STAT3在動(dòng)脈粥樣硬化中過(guò)度激活,JAK/STAT3信號(hào)加重疾病進(jìn)程〔24,25〕。本研究結(jié)果顯示,益氣活血清熱解毒方明顯降低了ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型中p-JAK1/JAK1、p-STAT3/STAT3蛋白水平,益氣活血清熱解毒方抑制JAK/STAT3信號(hào)激活,益氣活血清熱解毒方可能通過(guò)JAK/STAT3信號(hào)發(fā)揮動(dòng)脈粥樣硬化保護(hù)作用。

綜上,益氣活血清熱解毒方改善動(dòng)脈粥樣硬化炎癥、血脂,減少斑塊形成,機(jī)制可能與JAK/STAT3信號(hào)有關(guān),這為中西醫(yī)治療和預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)疾病奠定了基礎(chǔ)?，F(xiàn)階段尚不明確益氣活血清熱解毒方通過(guò)何種機(jī)制影響JAK/STAT3信號(hào)進(jìn)而改善動(dòng)脈粥樣硬化,在以后實(shí)驗(yàn)中會(huì)進(jìn)行深入探討。