李勝 江洪 董冀南

(鷹潭市人民醫(yī)院 1藥劑科,江西 鷹潭 335000;2腎內(nèi)科)

糖尿病腎病是糖尿病的主要并發(fā)癥之一,隨著疾病進展可逐步發(fā)展為慢性腎衰竭,足細胞損傷是引起糖尿病腎病的重要原因之一,高糖誘導足細胞凋亡、氧化應激等可造成細胞損傷,因而減輕足細胞損傷對延緩糖尿病腎病的進展具有重要意義〔1〕。我國傳統(tǒng)中草藥的提取物及其活性成分可通過抑制炎癥、氧化應激等減輕足細胞損傷,最終達到治療糖尿病腎病的作用,但關于其具體作用機制尚未完全闡明〔2,3〕。蓬子菜總黃酮(FGVL)是一種黃酮類化合物,是蓬子菜中的主要活性物質(zhì),其不僅能有效改善因過氧化氫誘發(fā)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞氧化損傷,還可通過清除氧自由基而減輕缺氧復氧誘導的心肌微血管內(nèi)皮細胞損傷〔4〕。但現(xiàn)階段關于FGVL對糖尿病腎病患者病情改善作用的研究還尚未出現(xiàn)。長鏈非編碼RNA(LncRNA)在人體中能扮演微小RNA(miRNA),不僅能調(diào)控細胞繁殖和凋亡,還能參與多種疾病發(fā)生及發(fā)展過程,研究〔5〕表明,LncRNA TPTEP1在高糖誘導的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞中表達下調(diào),上調(diào)其表達可改善高糖誘導的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞功能障礙。通過在線網(wǎng)站預測顯示,LncRNA TPTEP1與miR-770-5p存在結(jié)合位點,研究〔6〕表明,miR-770-5p在高糖誘導的足細胞中表達上調(diào),下調(diào)其表達可抑制高糖誘導的足細胞凋亡及炎癥。但TPTEP1/miR-770-5p在糖尿病腎病中發(fā)揮的機制還有待研究,FGVL對高糖誘導的足細胞的保護作用機制尚需進一步探究。本研究以小鼠足細胞損傷模型為研究對象,探討FGVL是否通過調(diào)控TPTEP1/miR-770-5p影響高糖誘導的足細胞損傷。

1 材料與方法

1.1材料 研究使用的蓬子菜購自億弘堂藥業(yè),且經(jīng)鑒定為茜草科拉拉藤屬;小鼠足細胞購自美國ATCC公司;RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司;總RNA提取試劑購自國外Sigma-Aldrich公司;Lipofectamine2000、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)試劑均購自國外Thermo Fisher公司;凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司;四甲基偶氮唑藍(MTT)試劑購自北京索萊寶;二喹啉甲酸(BCA)試劑盒購自江蘇凱基生物公司;丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)檢測試劑盒均購自上海碧云天生物;miR-770-5p寡核苷酸模擬物(miR-770-5p mimics)及其陰性對照mimic NC序列(miR-NC)、TPTEP1小分子干擾RNA(si-TPTEP1)及其陰性對照(si-NC)均購自廣州銳博生物公司;TPTEP1過表達載體(pcDNA-TPTEP1)及其對照空載體(pcDNA)購自南京金斯瑞;兔抗鼠腎病蛋白(nephrin)、足突蛋白(podocin)、突觸極蛋白(synaptopodin)抗體與二抗購自美國CST公司;兔抗鼠酶切的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Cleaved Caspase)-3、Cleaved Caspase-9抗體購自美國Abcam公司;FACS Calibur流式細胞儀購自美國BD公司;Radiance2000顯微鏡購自美國Bio-Rad公司;StepOnePlus公司qRT-PCR儀購自美國ABI公司;酶標儀購自美國BioTek。

1.2FGVL制備〔7〕蓬子菜烘干后粉碎,40目篩過濾后稱取5 kg粉末,按照1∶15比例加入75%乙醇浸泡12 h,應用超聲波提取儀提取3次(45 ℃),收集濾液后減壓濃縮得到粗提取液,然后經(jīng)大孔樹脂完成純化,清除多糖及蛋白質(zhì),再使用75%乙醇洗脫并減壓濃縮,FGVL含量經(jīng)高效液相色譜法檢驗,純度為76%,冷凍干燥后得到FGVL粉末,將其加入甲醇中溶解,加入培養(yǎng)液稀釋至濃度實驗所需濃度(50、100、200 μg/ml)。

1.3實驗處理及分組 取對數(shù)生長期足細胞并將其分為Con組(用5.5 mmol/L葡萄糖處理24 h)、Model組(用25 mmol/L葡萄糖處理24 h)〔8〕。分別加入含有50、100、200 μg/ml FGVL與25 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)液處理足細胞24 h,分別記為FGVL 50 μg/ml組、FGVL 100 μg/ml組、FGVL 200 μg/ml組。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pcDNA、pcDNA-TPTEP1轉(zhuǎn)染至足細胞,轉(zhuǎn)染成功后用25 mmol/L葡萄糖處理24 h,分別記為pcDNA組、pcDNA-TPTEP1組。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將si-NC、si-TPTEP1轉(zhuǎn)染至足細胞,轉(zhuǎn)染成功后用200 μg/ml FGVL與25 mmol/L葡萄糖處理24 h,分別記為FGVL 200 μg/ml+si-NC組、FGVL 200 μg/ml+si-TPTEP1組。

1.4檢測氧化應激指標MDA含量與SOD、CAT活性 收集各組足細胞,采用TBA顯色法檢測細胞內(nèi)MDA含量,采用WST-8法檢測細胞內(nèi)SOD活性,采用CAT顯色法檢測細胞內(nèi)CAT的活性,嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.5MTT檢測細胞增殖 收集各組足細胞(3×104個/ml)接種于96孔板(100 μl/孔),在各孔分別加入MTT溶液,劑量為20 μl,然后恒溫37 ℃培育,培育4 h后離心5 min,轉(zhuǎn)速為1 300 r/min,離心完畢后棄其上清,然后在各孔中滴入二甲基亞砜(DMSO),劑量為150 μl,常溫環(huán)境下震蕩反應,5 min后檢驗各孔的光密度值,使用酶標儀完成,檢驗位置取 490 nm波長處,細胞存活率=實驗組OD值/對照組OD值×100%。

1.6流式細胞術檢測細胞凋亡率 在各組足細胞中滴入胰蛋白酶,濃度為0.25%,消化完成后離心6 min,離心半徑為6 cm,轉(zhuǎn)速為3 000 r/min,預冷并用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗,然后棄去上清液,滴入結(jié)合緩沖液(劑量為500 μl)進行細胞凋亡檢驗,檢驗步驟參考試劑盒說明書進行,最后通過流式細胞儀檢驗細胞凋亡率。

1.7qRT-PCR檢驗TPTEP1、miR-770-5p表達 用RNA提取試劑盒分別提取各組足細胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄體系:5×gDNA緩沖液2 μl,10×King反轉(zhuǎn)錄緩沖液2 μl,FastKing反轉(zhuǎn)錄酶混合液1 μl,反轉(zhuǎn)錄引物混合液2 μl,RNA 2 μg,不含核糖核酸酶的雙蒸水補足體系至20 μl;溫度:42 ℃持續(xù)15 min,再升溫至95 ℃,持續(xù) 3 min。cDNA加入20倍不含RNA酶的無核酸酶水稀釋后進行qRT-PCR,按照試劑盒說明書配制反應體系及設置反應程序,用qRT-PCR儀檢測各孔Ct值,TPTEP1和miR-770-5p的相對表達量通過2-ΔΔCt法檢驗。

1.8雙熒光素酶報告實驗檢測TPTEP1與miR-770-5p的靶向關系 根據(jù)LncBase Predicted v.2預測顯示TPTEP1與miR-770-5p存在互補序列,用點突變試劑盒對互補序列進行突變,建立野生型載體(WT-TPTEP1)和突變型載體(MUT-TPTEP1),前者含有互補序列,后者則含有突變序列,用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將miR-NC、miR-770-5p mimics分別與WT-TPTEP1、MUT-TPTEP1共轉(zhuǎn)染至足細胞,恒溫37 ℃環(huán)境下培育24 h,培育結(jié)束后收集細胞,然后觀察細胞的相對熒光素酶活性。

1.9Western印跡檢測nephrin、podocin、synaptopodin、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表達 用蛋白裂解液分別提取各組足細胞總蛋白,用BCA試劑盒檢驗蛋白濃度,制備10%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離蛋白,收集分離蛋白凝膠后將其置入聚偏氟乙烯(PVDF)膜,然后將PVDF膜封閉于5%脫脂牛奶封閉液中,室溫封閉2 h,分別置于含有nephrin(1∶800)、podocin(1∶800)、synaptopodin(1∶800)、Cleaved Caspase-3(1∶1 000)、Cleaved Caspase-9(1∶1 000)一抗稀釋液與內(nèi)參GAPDH抗體(1∶2 000)稀釋液中恒溫4 ℃的環(huán)境下靜置1夜,使用TBST將PVDF膜清洗完成,加入二抗稀釋液,比例為1∶3 000,常溫孵育1 h,再使用TBST將PVDF膜清洗,避光曝光顯影檢驗各條帶灰度值,灰度值使用ImageJ軟件讀取。

1.10統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1FGVL對高糖誘導的足細胞氧化應激及nephrin、podocin、synaptopodin蛋白表達的影響 與Con組比較,Model組MDA水平顯著升高,SOD、CAT活性顯著降低,nephrin、podocin、synaptopodin蛋白表達顯著降低(均P<0.05);與Model組比較,FGVL 50、100、200 μg/ml組MDA水平均顯著降低,SOD、CAT活性均顯著升高,nephrin、podocin、synaptopodin蛋白表達均顯著升高(均P<0.05),且呈劑量依賴性。見表1、圖1。

1～9:Con組、Model組、FGVL 50 μg/ml組、FGVL 100 μg/ml組、FGVL 200 μg/ml組、pcDNA組、pcDNA-TPTEP1組、FGVL 200 μg/ml+si-NC組、FGVL 200 μg/ml+si-TPTEP1組

表1 FGVL對高糖誘導的足細胞氧化應激及nephrin、podocin、synaptopodin蛋白表達的影響

2.2FGVL對高糖誘導的足細胞增殖及凋亡的影響 與Con組比較,Model組細胞存活率顯著降低(P<0.05),細胞凋亡率、Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9蛋白表達明顯升高(P<0.05);與Model組比較,FGVL 50、100、200 μg/ml組細胞存活率顯著上升(P<0.05),細胞凋亡率、Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9蛋白表達顯著下降,且呈劑量依賴性(P<0.05)。見圖1、圖2、表2。

表2 蓬子菜總黃酮對高糖誘導的足細胞增殖、凋亡及細胞中TPTEP1、miR-770-5p表達量的影響

2.3FGVL對高糖誘導的足細胞中TPTEP1與miR-770-5p表達量的影響 與Con組比較,Model組TPTEP1表達量明顯降低,miR-770-5p表達量明顯升高(P<0.05);與Model組比較,FGVL 50、100、200 μg/ml組TPTEP1表達量明顯升高,miR-770-5p表達量明顯降低,且單劑量依賴性(P<0.05)。見表2。

2.4TPTEP1靶向調(diào)控miR-770-5p 經(jīng)LncBase Predicted v.2軟件檢驗,發(fā)現(xiàn)TPTEP1和miR-770-5p具有緊密的結(jié)合位點。見圖3。共轉(zhuǎn)染野生型載體WT-TPTEP1足細胞熒光素酶活性受miR-770-5p表達調(diào)控,miR-770-5p過表達能有效降低前者活性(P<0.05),但并不影響共轉(zhuǎn)染突變型載體MUT-TPTEP1足細胞的熒光素酶活性。見表3。pcDNA-TPTEP1組miR-770-5p表達(0.41±0.03)明顯低于pcDNA組(1.00±0.05;P<0.05);si-TPTEP1組miR-770-5p表達(2.32±0.16)明顯高于si-NC組(1.00±0.04;P<0.05)。

圖3 LncBase Predicted v.2預測顯示TPTEP1與miR-770-5p存在結(jié)合位點

表3 兩組雙熒光素酶報告實驗檢測

2.5TPTEP1過表達對高糖誘導的足細胞氧化應激、增殖、凋亡及nephrin、podocin、synaptopodin蛋白表達的影響 與pcDNA組比較,pcDNA-TPTEP1組miR-770-5p表達量明顯降低,MDA水平明顯降低,SOD、CAT活性明顯升高,細胞存活率明顯升高,nephrin、podocin、synaptopodin蛋白表達明顯升高,細胞凋亡率和Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表達明顯降低(P<0.05)。見圖1、圖4、表4。

圖4 TPTEP1過表達對高糖誘導的足細胞凋亡的影響

表4 TPTEP1過表達對高糖誘導的足細胞氧化應激、增殖、凋亡及nephrin、podocin、synaptopodin蛋白表達的影響

2.6抑制TPTEP1表達可逆轉(zhuǎn)FGVL對高糖誘導的足細胞氧化應激、增殖、凋亡及nephrin、podocin、synaptopodin蛋白表達的作用 與FGVL 200 μg/ml+si-NC組比較,FGVL 200 μg/ml+si-TPTEP1組miR-770-5p表達量明顯升高,MDA水平明顯升高,SOD、CAT活性明顯降低,nephrin、podocin、synaptopodin蛋白表達明顯降低,細胞存活率明顯降低,細胞凋亡率和Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表達明顯升高(P<0.05)。見圖1、表5、圖5。

圖5 抑制TPTEP1表達可逆轉(zhuǎn)FGVL對高糖誘導的足細胞凋亡的影響

表5 抑制TPTEP1表達可逆FGVL對高糖誘導的足細胞氧化應激、增殖、凋亡及nephrin、podocin、synaptopodin蛋白表達的作用

3 討 論

足細胞屬于腎小球的固有細胞且是腎小球濾過屏障結(jié)構(gòu)成分,研究發(fā)現(xiàn),中藥可明顯改善足細胞損傷,因而探究足細胞損傷的發(fā)生機制不僅能為糖尿病腎病患者的康復提供新方案,還能從中醫(yī)層面為該疾病的治療提供靶點〔9,10〕。研究表明,黃芪甲苷Ⅳ可通過作用于LncRNA-牛磺酸上調(diào)基因(TUG)1而抑制高糖誘導的足細胞凋亡從而抑制糖尿病腎病的發(fā)展進程〔11〕。

FGVL可通過抑制脂質(zhì)過氧化與炎癥因子的釋放從而減輕急性肝損傷〔12〕。FGVL可抑制氧化應激反應而減輕過氧化氫誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞損傷〔13〕。FGVL在人體內(nèi)能發(fā)揮良好的抗炎效果,因此針對因多糖誘發(fā)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞損傷具有良好的抑制效果〔14〕。但FGVL對高糖誘導足細胞損傷的確切機制還尚未明確。本研究中與既往研究報道結(jié)果相似〔15〕,提示成功建立足細胞損傷模型。本研究結(jié)果提示,FGVL可抑制高糖誘導的足細胞氧化應激并可增強細胞抗氧化能力。nephrin、podocin屬于足細胞裂孔膜蛋白的成分,并可維持腎小球濾過功能,抑制其表達可引起蛋白尿,其水平降低是反映足細胞損傷的重要指標〔16〕。synaptopodin可作為足細胞分化成熟的標志物,其水平降低可反映糖尿病腎病足細胞損傷〔17〕。本研究結(jié)果提示,FGVL可減輕高糖誘導的足細胞損傷。本研究結(jié)果與既往研究報道結(jié)果相似〔18〕,提示FGVL可促進高糖誘導的足細胞增殖而抑制細胞凋亡。

TPTEP1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中表達下調(diào),并可參與腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程〔19〕。本研究結(jié)果提示,TPTEP1可能參與糖尿病腎病的發(fā)生過程。同時本研究證實,TPTEP1可競爭性與miR-770-5p發(fā)生反應,對miR-770-5p的表達還具有顯著的負向調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn),miR-770-5p通過靶向E2F3而促進糖尿病性腎病足細胞損傷〔20〕。miR-770-5p表達上調(diào)可促進糖尿病性腎病足細胞凋亡〔21〕。由于miR-770-5p與高糖誘導的足細胞損傷相關研究較多,但其上游調(diào)控基因尚未完全闡明,因而本研究通過在線預測及驗證得到,TPTEP1可靶向結(jié)合miR-770-5p,提示FGVL可能通過促進TPTEP1表達而抑制miR-770-5p表達從而減輕高糖誘導的足細胞損傷。另外,FGVL可通過促進TPTEP1表達而抑制miR-770-5p表達,因此對因高糖誘導的足細胞具有顯著的增殖效果,同時還能減低氧化應激反應和細胞凋亡速率。

綜上,FGVL可促進高糖誘導的足細胞增殖并可抑制高糖誘導的足細胞氧化應激、凋亡從而減輕高糖誘導的足細胞損傷,高糖誘導的足細胞中TPTEP1表達下調(diào),而miR-770-5p的表達上調(diào),TPTEP1可靶向結(jié)合miR-770-5p,FGVL可能通過促進TPTEP1表達而抑制miR-770-5p表達從而減緩糖尿病腎病的發(fā)展進程。但關于其具體作用機制仍需進一步探究。