吳嵐 齊亞靈 程明勛 王勤書 石瑞平 王淑秋 Shaobo ZHOU 葛子正

(1佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154007;2佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生態(tài)-免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)與相關(guān)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;3海南醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室;佳木斯大學(xué) 4附屬第一醫(yī)院;5附屬第三醫(yī)院;6 Faculty of Engineering and Science,University of Greenwich;7滁州城市職業(yè)學(xué)院)

預(yù)計(jì)到2045年,患糖尿病(DM)人數(shù)將到達(dá)7億高峰〔1〕。DM涉及腎臟、心臟、眼睛、神經(jīng)等多部位的慢性并發(fā)癥,其中以心血管系統(tǒng)損傷最為常見。Rubler等〔2〕首次提出糖尿病心肌病(DCM)的概念:一種獨(dú)立于高血壓、瓣膜病和冠心病等傳統(tǒng)心臟危險(xiǎn)因素的特異性心肌病,其典型特征為病理性心肌肥厚、間質(zhì)纖維化及功能障礙等,最終導(dǎo)致危及生命的心力衰竭。 機(jī)體持續(xù)暴露于高血糖水平會(huì)引起氧化和抗氧化機(jī)制失衡,堆積的超氧化物攻擊心肌細(xì)胞中的線粒體,嚴(yán)重?fù)p害心臟代謝。而線粒體自噬是一種靶向線粒體的分解代謝過程,及時(shí)將心肌細(xì)胞內(nèi)受損線粒體運(yùn)輸至溶酶體消化分解,有利于心肌細(xì)胞在DM應(yīng)激反應(yīng)下的生存。PTEN誘導(dǎo)假定激酶(PINK)1/parkin通路是當(dāng)前研究最多的線粒體自噬信號(hào)途徑,因帕金森病得名〔3〕。過量的氧化產(chǎn)物同樣能夠激活細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)。事實(shí)上,細(xì)胞自噬與細(xì)胞凋亡既有區(qū)別又有聯(lián)系,共同維護(hù)著心肌細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。靈芝是中國傳統(tǒng)的名貴藥材,因具有降血糖、抗炎、抗氧化等多種特性受到廣泛關(guān)注〔4〕。靈芝孢子是從靈芝的菌褶中彈射的成熟生殖細(xì)胞,儲(chǔ)存靈芝的全部遺傳物質(zhì)〔5〕。靈芝孢子作為潛在抗DM藥物的可行性研究已取得較大進(jìn)展,但靶向DCM的相關(guān)分子機(jī)制尚未徹底闡明。本研究旨在探討靈芝孢子對(duì)DM心肌損傷的保護(hù)作用及其潛在的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心選購40只SPF級(jí)SD雄性大鼠,6～8周齡,體質(zhì)量190～220 g,飼養(yǎng)于溫度適宜(20±2)℃的清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證編號(hào):SYXK(黑)2016-014,倫理委員會(huì)審批號(hào):JMSU-210。

1.2主要試劑 靈芝孢子購于佳木斯靈芝種植基地;鏈脲佐菌素購于美國Sigma;PINK1抗體購于上海碧云天;微管相關(guān)蛋白輕鏈(LC)3抗體購于美國CST;p62、parkin抗體購于英國Abcam;p-parkin抗體購于美國Affinity;B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2同源結(jié)構(gòu)域蛋白抗體(beclin)1、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、Bcl-2抗體購于武漢博士德;超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)試劑盒購于南京建成生物工程研究所;蘇木素-伊紅染色(HE)、馬松(Masson)染色試劑盒購于北京Solarbio。脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)染色試劑盒購于瑞士Roche。

1.3模型建立與分組 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w,自由飲食飲水。隨機(jī)均分成對(duì)照(NC)組、高脂高糖飲食(HFD)組、DM組和靈芝孢子(GLS)組。NC組給予基礎(chǔ)飼料,其余3組均給予高脂高糖飲食。持續(xù)高脂高糖飲食4 w后,DM組和GLS組禁食12 h,一次性腹腔注射30 mg/kg鏈脲佐菌素(溶于檸檬酸鹽緩沖液,避光現(xiàn)配)復(fù)制2型DM大鼠模型,NC組和HFD組腹腔注射等量的檸檬酸鹽緩沖液。3 d和7 d后監(jiān)測DM組和GLS組空腹血糖水平,連續(xù)兩次高于16.7 mmol/L視為模型制備成功。GLS組每天進(jìn)行1次靈芝孢子(300 mg/kg)灌胃,此濃度參考Yang等〔6〕使用的最高劑量,其余3組灌胃等量生理鹽水。

1.4大鼠體質(zhì)量、心臟指數(shù)、空腹血糖檢測 給藥12 w末,記錄各組末次體質(zhì)量和空腹血糖。全部大鼠禁食不禁水12 h。次日腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉,斷頸處死動(dòng)物,在冰臺(tái)上快速打開胸腔,小心剝離心臟組織,用預(yù)冷0.9%生理鹽水沖洗干凈殘留血液,拭干并計(jì)算心臟指數(shù)(心臟指數(shù)=心臟質(zhì)量/體質(zhì)量)。剪去心房、右心室及周圍結(jié)締組織等,沿垂直長軸方向均分左心室,靠心底部位固定于新鮮配制的4%多聚甲醛溶液,制備5 μm石蠟切片,靠心尖部位置于-80 ℃冰箱保存待用。

1.5大鼠心肌組織SOD活性、MDA含量檢測 準(zhǔn)確稱取心肌組織制備勻漿液,3 000 r/min離心10 min,取上清液測得OD值。嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟操作。

1.6大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)觀察 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水,行蘇木素(染細(xì)胞核)-伊紅(染細(xì)胞質(zhì))染色;Masson染色時(shí)膠原纖維呈藍(lán)色,肌纖維呈紅色。

1.7Western印跡檢測 從-80 ℃冰箱中取出凍存心肌組織,加入適量預(yù)冷的放射免疫沉淀法(RIPA)組織裂解液,充分剪碎研磨,超聲3次,整個(gè)流程在冰上操作。低溫高速(4 ℃,12 000 r/min)條件下離心15 min,收集上清液,用二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量。取30 μg蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE),并濕轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,5%脫脂奶粉封閉非特異性位點(diǎn)后,等滲緩沖鹽溶液(TBST)清洗2次,加入PINK1(1∶1 000)、parkin(1∶2 000)、p-parkin(1∶1 000)、LC3(1∶1 000)、p62(1∶1 000)、beclin1(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)抗體,4 ℃孵育過夜。次日TBST清洗后,37 ℃溫箱中孵育相應(yīng)種屬二抗(1∶10 000)1 h。現(xiàn)配增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(ECL)曝光液,在凝膠成像系統(tǒng)上顯影。

1.8免疫組織化學(xué)檢測 在60 ℃烤箱烘烤石蠟切片30 min,常規(guī)脫蠟至水。枸櫞酸微波修復(fù)20 min后自然冷卻,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次。免疫組化筆圍繞組織畫圈,滴加3%H2O2避光封閉10 min,PBS洗后滴加封閉液,放置37 ℃溫箱30 min,勿洗。直接滴加PINK1(1∶100)、parkin(1∶100)抗體,4 ℃孵育過夜。次日PBS洗滌后,37 ℃溫箱中孵育相應(yīng)種屬二抗及鏈霉親合素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物(SABC) 30 min?，F(xiàn)配二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液,鏡下控制染色時(shí)間。蘇木素復(fù)染及脫水,中性樹膠封片。

1.9TUNEL染色觀察大鼠心臟組織凋亡 石蠟切片常規(guī)脫蠟水化,按照試劑盒說明書進(jìn)行TUNEL熒光染色,使用抗熒光猝滅封片劑封片。及時(shí)閱片,斷裂DNA呈現(xiàn)綠色熒光。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1靈芝孢子對(duì)DM組體質(zhì)量、心臟指數(shù)、空腹血糖的影響 與NC組相比,HFD組血糖水平無明顯波動(dòng)(P>0.05),體質(zhì)量和心臟指數(shù)顯著增加(P<0.05);DM組血糖和心臟指數(shù)明顯增加,體質(zhì)量明顯下降(P<0.05)。與DM組相比,GLS組和HFD組血糖和心臟指數(shù)顯著下降,體質(zhì)量顯著增加(均P<0.05)。見表1。

表1 各組體質(zhì)量、心臟指數(shù)、空腹血糖水平、心肌組織MDA含量及SOD活性比較

2.2靈芝孢子對(duì)DM組心肌組織MDA含量、SOD活性的影響 與NC組相比,HFD組和DM組MDA顯著上調(diào),SOD顯著下降(P<0.05);與DM組相比,GLS組和HFD組MDA顯著減少,SOD顯著上升(均P<0.05)。見表1。

2.3靈芝孢子對(duì)DM組心肌組織形態(tài)學(xué)的影響 NC組心肌細(xì)胞排列緊密,形態(tài)規(guī)則,血管周圍僅有較少膠原纖維分布,含量僅為(1.23±0.19)%;HFD組排列稍顯疏松,偶見局部斷裂,有少量紅細(xì)胞浸潤,膠原含量增加至(2.40±0.17)%;DM組心肌細(xì)胞腫脹,邊界模糊,排列紊亂,伴有肌纖維明顯斷裂,可見大量紅細(xì)胞浸潤,藍(lán)染的膠原纖維呈片狀沉積,含量高達(dá)(4.93±0.40)%。GLS組心肌細(xì)胞形態(tài)及排列得以改善,膠原含量顯著降低至(1.71±0.11)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組心肌組織形態(tài)學(xué)(×400)

2.4靈芝孢子對(duì)DM組心肌組織PINK1/parkin通路蛋白水平的影響 與NC組相比,HFD組和DM組心肌組織PINK1、parkin、p-parkin通路蛋白的表達(dá)水平明顯增高(P<0.05)。與DM組相比,GLS組和HFD組PINK1、parkin、p-parkin表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)。免疫組織化學(xué)法檢測PINK1、parkin與Western印跡保持一致,棕黃色為陽性表達(dá)區(qū)域。見圖2、圖3、表2。

圖2 各組心肌組織中PINK1、parkin蛋白表達(dá)(免疫組化,×400)

圖3 各組心肌組織中PINK1、parkin、p-parkin蛋白表達(dá)

表2 各組心肌組織中通路蛋白、自噬蛋白、凋亡蛋白表達(dá)比較

2.5靈芝孢子對(duì)DM組心肌組織凋亡相關(guān)蛋白水平及TUNEL染色的影響 與NC組相比,HFD組和DM組心肌組織中Bax/Bcl-2表達(dá)水平明顯增高(P<0.05)。與DM組相比,GLS組和HFD組Bax/Bcl-2表達(dá)水平顯著下降(均P<0.05)。TUNEL熒光染色進(jìn)一步觀察心肌細(xì)胞凋亡情況,結(jié)果提示,與NC組細(xì)胞凋亡率〔(0.35±0.04)%〕比較,HFD組和DM組凋亡率〔(4.19±0.25)%、(13.67±1.15)%〕明顯升高(P<0.05)。與DM組比較,GLS組〔(3.48±0.48)%〕和HFD組顯著降低(P<0.05)。見表2、圖4、圖5。

圖4 各組心肌細(xì)胞凋亡情況(TUNEL染色,×400)

圖5 各組心肌組織中LC3、beclin1、p62、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)

2.6靈芝孢子對(duì)DM組心肌組織自噬相關(guān)蛋白水平的影響 與NC組相比,HFD組和DM組心肌組織LC3、beclin1自噬蛋白的表達(dá)水平明顯增高,p62蛋白表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)。與DM組相比,GLS組和HFD組LC3、beclin1表達(dá)水平顯著下降,p62表達(dá)水平顯著上升(均P<0.05)。見表2、圖5。

3 討 論

2型DM是一種以持續(xù)高血糖為特征的慢性代謝性疾病,累及全身多器官病變,DCM是最致命的并發(fā)癥之一。多種機(jī)制參與DCM的發(fā)生發(fā)展,涉及氧化應(yīng)激、能量代謝紊亂、線粒體功能障礙等〔7〕,其中高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激是致病的關(guān)鍵因素。心臟較其他器官更容易受過氧化作用的損傷〔8〕。SOD是生物體中最重要的內(nèi)源性抗氧化酶之一,能夠加速游離自由基的轉(zhuǎn)化和失活,保護(hù)心肌細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損害〔9〕。MDA是脂質(zhì)被氧自由基攻擊后發(fā)生過氧化反應(yīng)的氧化終產(chǎn)物,具有細(xì)胞毒性,最終誘發(fā)細(xì)胞損傷甚至死亡〔10〕。本研究提示,GLS組大鼠對(duì)超氧自由基的清除能力明顯增強(qiáng),氧化應(yīng)激水平減輕。

當(dāng)生物體處于氧化應(yīng)激狀態(tài),自噬能夠作為一種防御應(yīng)答手段被啟動(dòng)〔11〕。自噬是一種選擇性清除受損細(xì)胞成分的保守“自食”過程,而線粒體自噬作為靶向線粒體的自噬形式,能夠?qū)⒃馐苎趸瘬p傷的線粒體運(yùn)輸?shù)饺苊阁w降解,有助于減輕氧化應(yīng)激。在DM患者的心臟中,高糖/高脂肪酸氧化水平導(dǎo)致了活性氧(ROS)的蓄積,進(jìn)而攻擊心肌線粒體。堆積的障礙線粒體進(jìn)一步引發(fā)更多的ROS產(chǎn)生,形成線粒體損傷和氧化應(yīng)激加劇的惡性循環(huán)〔12〕。因此,線粒體自噬對(duì)于維持健康的線粒體狀態(tài)至關(guān)重要,能夠有效延緩DCM的發(fā)生發(fā)展。鑒于線粒體自噬的積極作用,PINK1/parkin介導(dǎo)的線粒體自噬途徑有望成為靈芝孢子保護(hù)心肌的潛在靶點(diǎn)?；A(chǔ)水平的自噬作為細(xì)胞的自我保護(hù)機(jī)制,能夠在線粒體受到病理刺激時(shí)被啟動(dòng),導(dǎo)致PINK1在受損的線粒體外膜表面穩(wěn)定性聚集,進(jìn)而招募并激活E3泛素連接酶parkin。泛素化的損傷線粒體被銜接蛋白p62識(shí)別后,再與LC3結(jié)合形成自噬小體,最終被溶酶體降解〔13,14〕。當(dāng)自噬持續(xù)增高,細(xì)胞由于過量消耗內(nèi)容物無法再繼續(xù)生存,自噬不再產(chǎn)生積極作用〔15〕。LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、p62是自噬形成過程中重要的自噬標(biāo)志蛋白,其中p62與自噬活性呈負(fù)相關(guān)〔16,17〕。本研究提示,以上自噬因子的異常表達(dá)可能是DCM進(jìn)展的誘發(fā)因素,而靈芝孢子對(duì)DM心肌的保護(hù)作用可能是通過調(diào)控PINK1/parkin信號(hào)通路抑制心肌細(xì)胞自噬的過度激活實(shí)現(xiàn)的。氧化應(yīng)激和凋亡同樣關(guān)系密切,線粒體的過氧化損傷能夠加速線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放,觸發(fā)細(xì)胞色素C等促凋亡因子的釋放〔18〕。Bcl-2家族蛋白是細(xì)胞凋亡過程重要的調(diào)控分子,包含抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax等。研究表明,Bax/Bcl-2的比值是細(xì)胞存亡的決定性因素〔19〕。本研究提示,靈芝孢子可能通過激活抗凋亡途徑,改善高糖對(duì)心臟的有害影響。大量報(bào)道發(fā)現(xiàn),Bcl-2家族不僅是細(xì)胞凋亡的明星靶點(diǎn),與細(xì)胞自噬也有聯(lián)系。Bcl-2等抗凋亡分子能通過與自噬基因beclin-1相互作用介導(dǎo)細(xì)胞自噬〔20〕,還能阻礙parkin向去極化線粒體的易位,從而抑制線粒體過度自噬〔21〕。PINK1/parkin信號(hào)通路可能是細(xì)胞自噬與凋亡交互作用的關(guān)鍵靶點(diǎn),二者的關(guān)聯(lián)有待進(jìn)一步探討。本研究發(fā)現(xiàn),HFD組大鼠心肌組織的病變程度與DM組有一定差距,推測高脂高糖食物短時(shí)間內(nèi)無法構(gòu)建2型DM模型,還需進(jìn)一步深入研究。