葉倩雅 李華 周生花 任冬冬 李宗尚 郭燕可

(1河南中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院,河南 鄭州 450002;2河南省中醫(yī)院(河南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院))

心搏驟停(CA)是全球范圍內高致死率的疾病之一〔1〕。據(jù)美國2020年CA統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示,院外CA(OHCA)發(fā)生率每年占總人口的0.04%～0.13%,經(jīng)積極心肺復蘇(CPR)后自主循環(huán)恢復(ROSC)而入院的患者中,只有10.4%的患者可存活至出院,腦功能恢復良好的僅占8.2%〔2〕。CPR雖然是有效的救治手段,但仍面臨腦功能恢復不全的難題。目前,針對該問題的西藥療效參差,僅亞低溫治療有一定效果,然而尚未出現(xiàn)成熟治療方案。臨床上中醫(yī)用于神經(jīng)保護的藥物療效較為確切,其中醒腦灌腸液作用明顯〔3〕。研究表明,醒腦灌腸液的抗炎作用顯著,大多僅著眼于腦局部缺血、缺氧等相關的疾病模型研究,如腦出血模型等〔4〕,而關于醒腦灌腸液能否通過調節(jié)凋亡通路蛋白起全腦保護作用的機制尚未見報道。本研究建立CA/CPR后大鼠全腦神經(jīng)元損傷模型,探索醒腦灌腸液對于調節(jié)凋亡相關蛋白B細胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關X蛋白(Bax)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3的影響。

1 材料與方法

1.1試驗藥物 實驗大鼠用醒腦灌腸液,處方為大黃15 g、水蛭10 g、石菖蒲12 g、冰片2 g,每劑含藥量39 g,購于河南中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)院中藥房。將醒腦灌腸液方劑藥物中的大黃、水蛭、石菖蒲按照比例加 15 倍量水煎煮兩次,每次1 h,濾過后藥液合并,減壓濃縮。將冰片細研磨,過篩,篩孔尺寸小于1 mm,加至前述藥液,融化后冷藏,使用時水浴加熱至 25 ℃。安宮牛黃丸:去除塑料球殼,加適量蒸餾水恒溫100 ℃水浴加熱,攪拌融化,冷藏備用。安宮牛黃丸(生產批號:20017004)購于北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠。以上藥液按照等效劑量換算并濃縮成 1 g/ml 的濃縮液。

1.2動物 SD雄性大鼠24只,SPF級,體質量(260.0±37.7)g,購于鄭州華興實驗動物基地,飼養(yǎng)于河南省中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院中心實驗室,溫度維持在24～26 ℃,濕度為30%～40%,飼養(yǎng)條件為大鼠獨立通氣籠具(IVC),無菌飼料和墊料喂養(yǎng),去離子水供應,以上由管理員雷震老師負責管理。經(jīng)實驗動物倫理審查通過批準后進行實驗(審批號:PZ-HNSZYY-2020-018)。

1.3試劑 Bcl-2、Bax、Caspase-3抗體(中國成都,正能生物公司,批號250198、380709、381337);GAPDH 抗體(武漢三鷹生物技術有限公司,批號:00077958、1008047);二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司,批號:112720201223);聚偏氟乙烯(PVDF)膜(美國Millipore公司,批號:IPVH0010);十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酸胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠試劑盒(中暉赫彩生物公司,批號:BAO223)。

1.4設備 包埋機(武漢俊杰電子有限公司,JB-P5);病理切片機(上海徠卡儀器有限公司,RM2016);脫色搖床(江蘇新康醫(yī)療器械有限公司,XK-8);光學顯微鏡(日本尼康,NK20);SDS-PAGE凝膠電泳系統(tǒng)(型號:Mini-PROTEAN)、蛋白濕轉儀(型號:Mini Trans-Blot)、WB成像系統(tǒng)(美國伯樂公司,型號:ChemiDoc XRS+)。

1.5方法

1.5.1實驗模型及分組 遵循Utstein〔5〕模式CPR造模方法,使用窒息法建立大鼠模型。制造模型前禁食8 h,正常飲水。大鼠仰臥位固定于手術臺上,戊巴比妥鈉1 ml/kg 進行麻醉。14 G自制動脈套管行氣管插管。連接生物信號采集處理系統(tǒng)實時監(jiān)測心電Ⅱ導聯(lián),確保心電圖和心率(HR)在基線水平,觀察大鼠HR為300～500次/min〔6〕的納入實驗,若不滿足基線條件則排除實驗。體征穩(wěn)定15 min后,消毒備皮,分離出左股動脈連接壓力換能器,通過壓力傳感系統(tǒng)記錄大鼠動脈血壓(MAP)變化,血壓在80～155 mmHg〔7〕者納入實驗,否則排除;右股靜脈連接24G動脈留置針備用,用于搶救時給藥。頸部皮膚沿正中線切開,鈍性分離出0.5～1.0 cm長氣管,注意分離出氣管旁迷走神經(jīng)以防影響HR。氣管插管端連通小動物呼吸機,通氣氧濃度21%,潮氣量4 ml/kg,頻率為100次/min。保持大鼠平穩(wěn)狀態(tài)5 min后,關停小動物呼吸機并用動脈夾夾閉氣管,觀察MAP和HR,判斷CA標準〔8～10〕為:MAP≤20 mmHg;心電圖出現(xiàn)無脈電活動、機械分離和(或)室顫波或心電活動停止表現(xiàn)。CA 3 min后松開夾閉氣管的動脈夾,進行常規(guī)搶救措施,呼吸機打開行機械通氣,同時進行胸外心臟按壓,要求頻率≥200次/min,按壓深度達到大鼠胸廓前后徑的1/3以上。同時經(jīng)留置針給予腎上腺素0.02 mg/kg及電除顫或利多卡因1.5 mg/kg除顫等進行常規(guī)急救治療。在大鼠ROSC后(即HR≥170次/min且MAP≥60 mmHg)并且能持續(xù) 5 min,則認為已復蘇成功,終止按壓。胸外按壓超過10 min未發(fā)生ROSC者,認為復蘇失敗,終止CPR。為制備模型共準備大鼠37只,基線均符合標準,死亡19只,成功18只,建立CPR模型,可達到ROSC的成功率為48.64%,各組大鼠若出現(xiàn)死亡則從同批次大鼠選擇并隨機補充。造模成功后,隨機分為模型(CPR)組、醒腦灌腸液(XNGC)組、安宮牛黃丸(AGNH)組各6只。另隨機取6只大鼠為假手術(Sham)組。各組大鼠生命體征穩(wěn)定后20 min,Sham組和CPR組給予常規(guī)西醫(yī)急救治療并予生理鹽水灌腸,其余組除常規(guī)治療外,按照相應等效劑量為XNGC和AGNH兩組大鼠給藥。

1.5.2實驗給藥和取材 CPR組、XNGC組和AGNH組均進行CPR模型制備,而Sham組不進行氣管夾閉、CPR操作,余處理同前3組。實驗大鼠用醒腦灌腸液,等效折算系數(shù)為0.018,故XNGC組給藥3.60 g/kg。安宮牛黃丸患者使用劑量為3 g,因此AGNH組大鼠等效給藥0.27 g/kg。在ROSC后0、24、48 h分別給藥,Sham組和CPR組給予生理鹽水灌腸,XNGC組和AGNH組分別根據(jù)大鼠體質量換算給藥劑量并進行灌腸給藥。將ROSC模型成功時記為0 h,在72 h時對大鼠進行空氣栓塞處死,并斷頭取腦,分別置于液氮和4%多聚甲醛中備用于后續(xù)實驗。

1.5.3神經(jīng)功能缺陷評分(NDS)〔11〕在CPR后2、24、48 h時分別對大鼠進行NDS,評分范圍為0%～100%,正常大鼠NDS為0%,腦死亡大鼠NDS為100%。從5個不同維度進行神經(jīng)功能評價:意識和呼吸、腦神經(jīng)功能、運動功能、感覺功能和平衡協(xié)調功能(包括平衡木行走)等。

1.5.4病理切片染色 取大鼠腦組織,并將組織浸泡于4%多聚甲醛常溫下固定24 h以上,組織包埋石蠟修塊后,以5 μm連續(xù)切片,固定在載玻片后用梯度濃度的乙醇脫水,入蘇木素染液染8～10 min,用分化液分化、返藍液返藍,梯度酒精脫水后,伊紅染液中復染8～10 min。最后,將切片脫水封片并在顯微鏡下觀察拍照。

本研究在文獻查閱與問卷調查的基礎上，發(fā)現(xiàn)問題，提出研究構思，然后根據(jù)文獻查閱及問卷分析，對小學生數(shù)學基本活動經(jīng)驗積累策略進行研究。除了采用文獻法，主要有以下幾種方法。

1.5.5免疫組化(IHC) 取大鼠腦組織,并浸泡于4%多聚甲醛常溫下固定24 h以上,常規(guī)包埋修塊后,以5 μm連續(xù)切片后進行脫蠟水化,高溫煮沸進行抗原修復,加入一抗(Bcl-2為1∶200;Bax為1∶200;Caspase-3為1∶500,均為中國,正能生物公司提供)50 μl,4 ℃冰箱孵育過夜,滴加生物素標記的羊抗兔/鼠IgG 50 μl,室溫放置15 min,加鏈霉親和素-過氧化物酶溶液,同條件孵育15 min,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)-H2O2顯色、蘇木素復染細胞核后脫水固定。顯微鏡下觀察,并用平均光密度值(IOD/Area)累計各切片陽性區(qū)域細胞表達百分比,并進行組間統(tǒng)計學對比。

1.5.6Western印跡 取大鼠腦組織分離出海馬區(qū)并馬上置于液氮保存,取材后放置-80 ℃冰箱凍存。取海馬區(qū)的腦組織各300 mg,加入鋼珠和裂解液(每300 mg加300 μl裂解液)后置于電動勻漿機快速勻漿,常規(guī)冰下裂解組織,提取蛋白,并用BCA法進行蛋白定量。取12%的SDS-PAGE處理10 μg蛋白,濕轉至PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉1 h,加一抗(Bcl-2為1∶500;Bax為1∶1 000;Caspase-3為1∶1 000;均為中國,正能生物公司提供)4 ℃過夜。TBST洗滌3次,10 min/次,膜上加二抗(兔/鼠抗鼠,1∶2 000稀釋),電化學發(fā)光(ECL)顯色液曝光后凝膠成像儀顯影。實驗重復3次。Image Lab軟件分析并計算相對灰度值進行半定量,對比結果。

1.6統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0和GraphPad Prism8.0軟件進行One-way ANOVA分析、LSD-t檢驗、Kruskal-WallisH檢驗、Log-rank法χ2檢驗。

2 結 果

2.1各組基線情況比較 各組血壓、HR、體質量和呼吸頻率情況差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表1。

表1 各組基線資料及CA CPR模型情況對比

2.2各組CA CPR模型情況比較 CPR組、XNGC組和AGNH組CA時長、CPR時長、腎上腺素用量差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表1。

2.3各組NDS比較 與Sham組比較,CPR、XNGC、AGNH組2、24、48 h NDS明顯增加(P<0.01);ROSC后2 h時,CPR、XNGC和AGNH組NDS差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。24 h時,XNGC組、AGNH組與CPR組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01,P<0.05);48 h時,XNGC組、AGNH組與CPR組比較,均有統(tǒng)計學差異(P<0.01)。見表2。

表2 各組CPR后2、24、48 h NDS比較

2.4各組病理形態(tài)觀察 與Sham組相比,CPR組海馬區(qū)細胞明顯核固縮碎裂,且細胞排列紊亂,有較多細胞水腫和胞質空泡狀。與CPR組相比,XNGC和AGNH組海馬區(qū)細胞排列較整齊,且胞質空泡狀減少,核固縮碎裂情況有所改善,細胞水腫少見。見圖1。

圖1 各組海馬神經(jīng)元病理形態(tài)學(HE染色,×400)

圖2 各組海馬神經(jīng)元Bcl-2、Bax、Caspase-3陽性細胞表達(免疫組化染色,×400)

表3 各組Bcl-2、Bax和Caspase-3陽性細胞平均光密度比值

2.6各組CPR后海馬神經(jīng)元Bcl-2、Bax、Caspase-3、蛋白表達 與Sham組相比,CPR組海馬區(qū)細胞Bcl-2蛋白表達明顯下調,Bax、Caspase-3蛋白表達明顯上調(均P<0.01)。與CPR組相比,XNGC和AGNH組Bcl-2蛋白表達明顯上調(P<0.05),Bax、Caspase-3蛋白表達明顯下調(P<0.01,P<0.05)。見表4、圖3。

圖3 Western印跡檢測各組CPR后海馬神經(jīng)元Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達

表4 各組Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達相對灰度值

2.7各組存活率 Sham組存活率為100.0%。與CPR組(33.3%)相比,XNGC組和AGNH組48 h內存活率(83.3%、83.3%)差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=6.695,P=0.035)。

3 討 論

醒腦灌腸液為中藥復方,由大黃、水蛭、石菖蒲、冰片組成,臨床應用此方已21年余。大黃扶正攻下,消瘀清熱,明朝時期《本草綱目》記載用于瘟疫陽狂、斑黃譫語〔12〕,現(xiàn)今也用于急危重病〔13〕。石菖蒲具有通腑祛痰、開竅醒神之效〔14〕;水蛭破血通經(jīng)、活血化瘀;冰片開竅清熱、逐瘀醒腦。四藥合用,則能發(fā)揮該方劑的神經(jīng)保護作用〔15〕?，F(xiàn)代藥理學研究表明,本方對腦局部缺血、出血疾病的研究較為成熟。其中大黃通過調節(jié)磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和核轉錄因子(NF)-κB通路可以抗凋亡〔16〕等;石菖蒲提取成分能夠通過抑制TNF-α/NF-κB信號進而抑制凋亡〔17〕;水蛭提取物在臨床上具有抗腦缺血、改善側支循環(huán)的功效〔18〕,而水蛭素兼具抗凋亡〔19〕作用;冰片可作用于緊密連接蛋白基因進而影響B(tài)ax/Bcl-2復合物而發(fā)揮抗凋亡作用〔20〕。然而以上研究均著重于此方治療局部腦損傷,對于全腦損傷模型的研究較少。對于CA/CPR后全腦損傷者,有研究證實醒腦灌腸液可使CA/CPR模型大鼠的炎癥因子白細胞介素(IL)-33/生長刺激表達基因2蛋白(ST2)表達下調〔21〕,從而有力證明本復方對CA/CPR后大鼠腦損傷具有抗炎功效。隨著研究進展,探索凋亡通路在該疾病模型的中提供腦保護的可能是種延伸和新思路。安宮牛黃丸在CA患者〔22〕及各項動物實驗研究〔23〕中顯示,對于調節(jié)Bcl-2相關凋亡通路蛋白有顯著藥效,而CA/CPR后大鼠具有相似的病理生理機制,如腦缺血再灌注損傷及缺血缺氧性腦病機制,因此推測安宮牛黃丸在此模型中同樣發(fā)揮抗凋亡作用,選用為陽性對照組藥物。

窒息法行CA大鼠模型建立有很大優(yōu)勢〔24〕。窒息法作為Utstein模式的統(tǒng)一標準,在CA/CPR大鼠模型具有權威意義。模型制備過程中,總體可達到ROSC的成功率約50%,其中CA時間是較難把控的關鍵點,而本研究從夾閉氣管到開始ROSC結束為止期間,進行了詳細的時間記錄,急救時腎上腺素用量也并非完全相同,但以上因素在組間對比后并無統(tǒng)計學意義。

本研究選取的權威NDS評分〔11〕,更加系統(tǒng)化、準確化的評估大鼠神經(jīng)功能,分值越高神經(jīng)功能缺陷越明顯。細胞在凋亡的早期會出現(xiàn)特征性的萎縮,核固縮(染色質的不可逆凝聚)也同時發(fā)生在細胞凋亡的早期階段。本研究CA/CPR模型神經(jīng)細胞凋亡的病理染色與Chenoune等〔25〕研究結果一致。

Bax是Bcl-2的蛋白家族的重要成員。CA后,腦缺血/再灌注損傷達到一定程度,神經(jīng)細胞進入應激狀態(tài),產生大量自由基,刺激信號使促凋亡成員如Bax和Bak激活,Bax和Bak通過形成線粒體外膜通透性(MOMP)復合物來啟動細胞凋亡,進而導致線粒體膜上形成一個稱為通透性轉換孔(PT孔)的孔。之后線粒體釋放促凋亡蛋白,如細胞色素C等形成凋亡體,從而使凋亡體激活Caspase-9的啟動,進而導致Caspase-3的激活,最終誘導細胞凋亡。Caspase-3是在細胞凋亡執(zhí)行階段的中心分子,隸屬于Caspases蛋白質家族,正常細胞中以不活躍的前體或酵素形式存在于細胞內。凋亡程序不論通過外源途徑刺激還是內源途徑轉化,最后均可導致Caspase-3及家族成員激活,并導致細胞發(fā)生生化及形態(tài)學變化,破壞細胞骨架與核蛋白等,均為細胞凋亡的典型表現(xiàn)。Bcl-2是位于線粒體、內質網(wǎng)或核膜中的跨膜蛋白,主要起抗凋亡作用,具有4個不同的Bcl-2同源(BH)區(qū)域的多區(qū)域蛋白,即BH1～BH4。其中BH4是抗凋亡活性所必需的。為了避免細胞凋亡,Bcl-2或Bcl-xl等凋亡蛋白必須結合和隱藏BH3蛋白結合位點以阻止Bax/Bak激活。Bcl-2定位于內質網(wǎng),通過抑制促凋亡蛋白來防止凋亡。Bcl-2或Bcl-xl過表達將抵消促凋亡蛋白針對線粒體外膜產生的改變,進而引起膜通道電位的變化,最終會導致線粒體腫脹和線粒體膜外膜的破裂,此時,BH3位點被占據(jù),因此阻止了Bax/Bak激活,進而通過與B細胞受體相關蛋白(p28Bap)31結合介導Caspases的抑制,從而發(fā)揮抗凋亡作用〔26〕。

本文中大鼠生存統(tǒng)計中48 h成活率CPR組成活率較之XNGC組、AGNH組降低。結果提示,醒腦灌腸液和安宮牛黃丸的可能達到相近的神經(jīng)保護效果。

綜上,醒腦灌腸液在腦卒中患者及基礎實驗的抗凋亡、抗炎相關研究比較完善。本課題拓展了該方劑應用范圍的可能性,并且為臨床CPR后腦損傷及昏迷患者提供了治療方向。醒腦灌腸液方劑不僅價格經(jīng)濟,而且給藥方式為灌腸法,為CPR后的昏迷患者給藥提供方便。本研究在基礎實驗方面提供了與安宮牛黃丸治療效果可能相似的實驗數(shù)據(jù),為醒腦灌腸液更廣泛的應用于臨床提供可能。本研究不足之處在于僅探索醒腦灌腸液對凋亡相關蛋白表達的研究,并未探索其上游通路蛋白的表達。