張奎明 葛鸞蝶 崔應(yīng)麟 陳冠廷 葛文靜

(1河南中醫(yī)藥大學(xué),河南 鄭州 450002;2河南省中醫(yī)院腦病科)

缺血性腦卒中是由于腦供血?jiǎng)用}急性閉塞或嚴(yán)重狹窄,腦供血不足所致的局部腦組織壞死性疾病,具有高致殘率、高致死率的特點(diǎn),嚴(yán)重威脅老齡人口的生命健康〔1,2〕。血管再通療法雖可部分恢復(fù)腦部供血、消除有毒代謝物,亦會(huì)誘發(fā)腦水腫、加重腦組織損傷〔3〕。腦缺血再灌注損傷已成為腦卒中臨床治療亟待解決的問(wèn)題,因此,需深入研究缺血再灌注損傷的防治策略。中醫(yī)藥具有多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)、整體治療的特點(diǎn),對(duì)腦缺血的治療發(fā)揮重要作用〔4〕。腦缺血再灌注損傷歸屬于中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇,中醫(yī)對(duì)該病因機(jī)證治的論述較為豐富,王清任于《醫(yī)林改錯(cuò)·半身不遂論》記載:“半身不遂,虧損元?dú)?是其本源……無(wú)氣則不能動(dòng),不能動(dòng),名曰半身不遂”“元?dú)饧忍?必不能達(dá)于血管,血管無(wú)氣,必停留而瘀”,開(kāi)拓性地提出“氣虛血瘀”理論?，F(xiàn)代中醫(yī)研究表明,缺血性腦卒中是在氣虛的基礎(chǔ)上,風(fēng)、火、痰、瘀彼此作用,相互轉(zhuǎn)化而發(fā)病〔5〕。王永炎院士認(rèn)為該病本虛標(biāo)實(shí),本虛以“氣虛”多見(jiàn),標(biāo)實(shí)以“痰瘀”為主,并謹(jǐn)守中醫(yī)“急則治標(biāo),緩則治本”原則,急性期側(cè)重“化痰散瘀”,恢復(fù)期重在“益氣培本”〔6〕。因此,氣虛為缺血性腦卒中基本病機(jī),痰濁、血瘀是該病主要致病因素及病理產(chǎn)物。

康益膠囊由紅參、丹參、三七、土鱉蟲(chóng)、水蛭、大黃研末而成,具有益氣活血、化痰散瘀之效,臨床療效顯著〔7〕。前期臨床研究發(fā)現(xiàn),康益膠囊可上調(diào)缺血性腦卒中患者血清中腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及神經(jīng)生長(zhǎng)因子含量,改善缺血腦組織損傷、降低患者顱內(nèi)壓、提升患者生活質(zhì)量〔8〕。實(shí)驗(yàn)研究表明,康益膠囊通過(guò)增強(qiáng)大鼠缺血側(cè)腦組織中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶及過(guò)氧化氫酶表達(dá),減輕腦組織氧化損傷、改善大鼠腦水腫,亦能減少乳酸脫氫酶的釋放,保護(hù)受損神經(jīng)元〔9〕。上述研究證實(shí)康益膠囊可降低缺血側(cè)腦含水量,但具體作用機(jī)制尚不明確,因此,本研究以腦缺血再灌注大鼠為模型,探討康益膠囊對(duì)腦缺血后水通道蛋白(AQP)4、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9蛋白的干預(yù)作用,為康益膠囊治療缺血性腦卒中提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1動(dòng)物 清潔級(jí)健康雄性SD大鼠72只,體質(zhì)量(250±30)g,購(gòu)自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2019-0010。大鼠分籠飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室清潔級(jí)動(dòng)物房中,在喂養(yǎng)溫度(22±2)℃、相對(duì)濕度(50±10)%,人工控制光照、黑暗各12 h條件下,予以Co60輻照維持飼料及去離子水飼養(yǎng)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)由河南省中醫(yī)院及河南中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后進(jìn)行。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器 氣體麻醉機(jī)(深圳市瑞沃德生命科技有限公司,型號(hào):R500IF);病理切片機(jī)(德國(guó)徠卡公司,型號(hào):RM2016);生物顯微鏡(日本奧林巴斯公司,型號(hào):BX53)、生物組織攤烤片機(jī)(型號(hào):JK-6)、脫水機(jī)(型號(hào):JT-12J)、包埋機(jī)(型號(hào):JB-P5)均購(gòu)自武漢俊杰電子有限公司;一次性刀片(日本羽毛公司,型號(hào):8093081);精密電子天平(上海?？惦娮觾x器廠(chǎng),型號(hào):JA203);電熱恒溫干燥箱(上海恒科學(xué)儀器有限公司,型號(hào):DHG-9023A);線(xiàn)栓(北京西濃科技有限公司,型號(hào):2636A2);恒溫水浴箱(上海天美科學(xué)儀器有限公司,型號(hào):UV1000);Western印跡電泳儀(型號(hào):1645050)、Western印跡轉(zhuǎn)膜儀(型號(hào):Mini trans-Blot17)、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠系統(tǒng)(型號(hào):Mini PROTEAN)、化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀(型號(hào):ChenmiDoc XRS+)均購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司。

1.3實(shí)驗(yàn)試劑與耗材 異氟烷(深圳市瑞沃德生命科技有限公司,批號(hào):30037516);二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司,貨號(hào):P0010);CFASany KD PAGE蛋白電泳凝膠制備試劑盒Ⅰ型(陜西中暉赫彩生物醫(yī)藥科技有限公司,貨號(hào):PE008);彩色預(yù)染蛋白(香港柯非特生物科技有限公司,貨號(hào):LBP6510-02);4×蛋白上樣緩沖液(貨號(hào):P1016)、高效RIPA裂解液(貨號(hào):R0010)、電化學(xué)發(fā)光(ECL)超敏發(fā)光液(貨號(hào):PE0010)、4×蛋白上樣緩沖液(貨號(hào):P1016)、2%2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色液(貨號(hào):G3005)均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;聚偏氟乙烯(PVDF)膜(美國(guó)Millipore公司,貨號(hào):IPVH00010);抗AQP4抗體(武漢博士德生物公司,貨號(hào):BA1560);抗MMP9抗體(武漢博士德生物公司,貨號(hào):PB9669);羊抗兔 IgG二抗(貨號(hào):SA00001-2)、抗β-actin抗體(貨號(hào):20536-1-AP)均購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;蘇木素(美國(guó)Sigma公司,貨號(hào):H9627);伊紅Y(貨號(hào):71014544)、無(wú)水乙醇(貨號(hào):10009218)、二甲苯(貨號(hào):10023418)、鹽酸(貨號(hào):10011018)、包埋石蠟(貨號(hào):69019361)、中性樹(shù)膠(貨號(hào):10004160)均購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司。

1.4藥物 康益膠囊(按照人參、丹參、土鱉蟲(chóng)、水蛭、三七、大黃1.0∶3.0∶2.0∶1.0∶1.0∶0.8比例,中藥飲片研末配制而成)、銀杏葉片(揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字Z20027949,9.6 mg∶2.4 mg/片)購(gòu)自河南省中醫(yī)院藥房,上述藥物均由100 ℃沸水制備懸濁液,常溫冷卻,4 ℃貯藏備用。

1.5制備模型 參照文獻(xiàn)造模方法〔10〕,應(yīng)用線(xiàn)栓法制備大鼠左側(cè)大腦中動(dòng)脈栓塞(MCAO)模型。術(shù)前所有大鼠禁食12 h,自由飲水,5%異氟烷氣體吸入麻醉大鼠,將麻醉大鼠以仰臥位固定于手術(shù)板,備皮后,在大鼠頸部正中線(xiàn)開(kāi)口,逐層鈍性分離,暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)及頸外動(dòng)脈(ECA),分離CCA與迷走神經(jīng),并在CCA近心端、ECA近“Y”口分叉處、ICA遠(yuǎn)心端各備一根手術(shù)線(xiàn)備用,結(jié)扎CCA、ECA并用動(dòng)脈夾夾閉ICA,距ICA、CCA分叉處4 mm位置,以眼科剪在CCA剪一“V”形切口,將尼龍線(xiàn)栓〔長(zhǎng)度45 mm,頭端直徑(0.36±0.02)mm〕半球端由切口插入ICA,向前緩慢推進(jìn)17～20 mm,略遇阻力為止,記錄時(shí)間。結(jié)扎ICA以固定栓線(xiàn),逐層消毒縫合手術(shù)開(kāi)口,栓線(xiàn)殘端1 cm留于皮外,1.5 h后拔出線(xiàn)栓球端,恢復(fù)左側(cè)腦部血供,假手術(shù)組大鼠只作分離,不插入線(xiàn)栓。造模室溫24～25 ℃,大鼠體溫36.5～37.5 ℃。

根據(jù)Zea-Longa五分法評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)〔11〕,術(shù)后24 h對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):0分,行為正常,無(wú)神經(jīng)功能缺損;1分,提尾不能完全伸展右側(cè)前爪;2分,提尾右側(cè)前肢內(nèi)收,爬行右側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分,站立不穩(wěn),向右側(cè)跌倒;4分,意識(shí)障礙,不能行走。保留1～3分大鼠,剔除0分、4分大鼠。

1.6分組與給藥 采用隨機(jī)數(shù)字表法將SD雄性大鼠分為假手術(shù)組、模型組、康益膠囊低、中、高劑量組、銀杏葉組,每組12只。根據(jù)成人標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量每日攝入總量3 g,依據(jù)人與大鼠之間用藥劑量換算系數(shù)表計(jì)算大鼠用藥量〔12〕,配制康益膠囊中劑量組(540 mg/kg)、低劑量組(270 mg/kg)、高劑量組(1 080 mg/kg),銀杏葉組(680 mg/kg),假手術(shù)、模型組則給予同等體積的溶劑。在左側(cè)大腦恢復(fù)血供后24 h后行灌胃給藥,每日按時(shí)1次,持續(xù)給藥14 d。

1.7觀(guān)察指標(biāo)

1.7.1改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分(mNSS評(píng)分)〔13〕mNSS評(píng)分評(píng)價(jià)腦缺血大鼠神經(jīng)功能缺損情況,評(píng)分項(xiàng)目包含感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)、平衡及反射功能等多個(gè)方面,全面評(píng)估腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能缺損恢復(fù)情況,總評(píng)分為18分,腦損傷與分值呈正比,評(píng)估選擇術(shù)后第1、3、7、14天,固定相同時(shí)間節(jié)點(diǎn)進(jìn)行。

1.7.2腦水腫測(cè)定 灌胃14 d、評(píng)分結(jié)束后,于各組隨機(jī)選取6只大鼠,氣麻后處死,斷頭取腦,舍棄嗅球、小腦及小腦旁絨球,以生理鹽水沖洗大腦表面血漬,濾紙吸附表面水分后,稱(chēng)取腦組織濕重質(zhì)量,將大腦在100 ℃烘箱中干燥24 h,再稱(chēng)取腦組織干重質(zhì)量。腦含水量百分比按照腦含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%計(jì)算。

1.7.3TTC染色測(cè)定腦梗死面積 腦水腫測(cè)定完成后,麻醉處死各組剩余6只大鼠,迅速斷頭取出完整大腦,生理鹽水沖洗后,吸干表面水分,置于-20 ℃冰箱冷凍30 min,將凍硬大腦置于大鼠腦切片模具中,在腦視交叉前后1 mm處,作冠狀切片,在2%TTC染色液中,37 ℃避光孵育30 min,期間翻片,確保染色充分,隨后浸泡于10%多聚甲醛固定,缺血腦組織呈白色,正常腦組織呈紅色,應(yīng)用Image Pro Plus計(jì)算切片腦梗死面積,腦梗死面積百分比=(梗死面積/全腦總面積)×100%。

1.7.4蘇木素-伊紅(HE)染色法檢測(cè)病理變化 TTC染色完成后,將每組6只大鼠缺血側(cè)大腦組織視交叉至枕極部分,置于10%甲醛溶液固定,先使用梯度酒精對(duì)腦組織進(jìn)行脫水處理,后經(jīng)二甲苯透明處理,再由60 ℃石蠟浸泡,最后使浸蠟組織塊包埋于蠟塊中。使用蠟塊制備5 μm厚度的石蠟切片,經(jīng)切片脫蠟、蘇木素染色10 min、分化液分化、返藍(lán)液返藍(lán)、伊紅復(fù)染、去離子水水洗、脫水、透明、風(fēng)干、封片、鏡檢。

1.7.5Western印跡法檢測(cè)AQP4、MMP-9蛋白表達(dá) 取各組剩余大鼠缺血側(cè)腦組織腦前極至視交叉部分,將腦組織置于裂解液中,在勻漿機(jī)1 500 r/min、8 min中勻漿,提取上清液,BCA試劑盒對(duì)蛋白濃度定量,加入1×蛋白質(zhì)上樣緩沖液,在100 ℃水浴加熱5 min,使蛋白變性,配膠、上樣進(jìn)行電泳分離蛋白,后將凝膠蛋白印跡轉(zhuǎn)印至PVDF膜中,用5%脫脂奶粉封閉1 h,在4 ℃冰箱一抗(AQP4,1∶1 000;MMP-9,1∶1 000;β-actin,1∶2 000)孵育過(guò)夜。Tris鹽酸緩沖液吐溫(TBST)清洗5 min,重復(fù)5次后,二抗羊抗兔IgG(1∶3 000)孵育1 h,TBST清洗5次后,使用超敏發(fā)光液在凝膠成像儀中檢測(cè)蛋白印跡,而后使用Image J軟件量化目的蛋白條帶的灰度值,并以β-actin作為內(nèi)參蛋白,對(duì)比分析目的蛋白表達(dá)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA),兩兩比較采用LSD法檢驗(yàn),統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1各組mNSS評(píng)分結(jié)果 如表1所示,假手術(shù)組無(wú)神經(jīng)功能缺損癥狀,剩余各組均呈現(xiàn)神經(jīng)功能缺損。與假手術(shù)組相比,各時(shí)間點(diǎn)模型組均有明顯神經(jīng)功能缺損(P<0.01)。與模型組相比,康益膠囊低、中劑量組灌胃第1天無(wú)顯著差異(P>0.05),其余時(shí)間點(diǎn)治療組均顯著改善神經(jīng)功能缺損(P<0.01)。與康益膠囊低劑量組相比,各時(shí)間點(diǎn)高劑量組、銀杏葉組治療效果均顯著(P<0.05)。與康益膠囊中劑量組相比,各時(shí)間點(diǎn)高劑量組效果明顯(P<0.05)。灌胃第14天,康益膠囊高劑量組治療效果與銀杏葉組存在顯著差異(P<0.05)。治療組均能改善MCAO大鼠神經(jīng)功能缺損,且康益膠囊高劑量組治療效果優(yōu)于其余各組。

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)mNSS評(píng)分結(jié)果比較分,n=12)

2.2各組腦含水量及腦梗死面積比較 如表2所示,與假手術(shù)組相比,模型組腦組織含水量及腦梗死面積明顯上升(P<0.01);與模型組相比,康益膠囊低、中、高及銀杏葉片組腦組織含水量及腦梗死面積明顯下降(均P<0.01);與康益膠囊低劑量組相比,康益膠囊中、高及銀杏葉片組腦組織含水量及腦梗死面積顯著減少(均P<0.01);與康益膠囊中劑量組相比,康益膠囊高劑量組和銀杏葉片組腦組織含水量及腦梗死面積顯著下調(diào)(均P<0.05)。與康益膠囊高劑量組相比,銀杏葉組腦梗死面積百分比顯著升高(P<0.05)?？狄婺z囊可改善大鼠腦缺血損傷,且高劑量組治療效果較好。治療組均能改善MCAO大鼠腦水腫,而康益膠囊高劑量組效果最佳。如圖1所示,假手術(shù)組腦切片呈紅色,未見(jiàn)梗死區(qū)域;模型組腦切片缺血側(cè)出現(xiàn)大面積白色梗死區(qū),治療組相比模型組梗死面積均減少,說(shuō)明康益膠囊和銀杏葉片可改善大鼠腦缺血損傷。

表2 各組腦組織含水量及腦梗死面積比較

2.3各組腦組織病理形態(tài)變化 如圖2所示,假手術(shù)組腦皮層神經(jīng)元結(jié)構(gòu)及形態(tài)完整,胞膜完整,胞漿充盈,核仁清晰;模型組神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變,皮質(zhì)區(qū)廣泛水腫,細(xì)胞間隙增大,部分細(xì)胞腫脹,核仁固縮或變淺,細(xì)胞數(shù)目明顯減少;與模型組相比,治療組缺血側(cè)腦組織隨著中藥劑量的增加,水腫減輕,神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)改善、數(shù)目增加,細(xì)胞腫脹及核固縮、溶解減輕,其中康益膠囊高劑量組腦組織損傷較為輕微。

圖2 各組腦組織病理形態(tài)(HE染色,×400)

2.4各組腦組織AQP4及MMP-9蛋白表達(dá) 如圖3、表3所示,與假手術(shù)組相比,模型組腦組織AQP4及MMP-9蛋白表達(dá)顯著上升(均P<0.01);與模型組相比,各治療組腦組織AQP4及MMP-9蛋白表達(dá)均顯著降低(均P<0.01)。

圖3 各組AQP4、MMP-9蛋白表達(dá)

表3 各組腦組織AQP4、MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量

3 討 論

腦缺血再灌注損傷是復(fù)雜、多因素過(guò)程,由于動(dòng)脈栓塞或狹窄致使缺血腦組織能量衰竭、去極化和興奮性損傷,導(dǎo)致細(xì)胞毒性及血管源性水腫,繼而誘發(fā)神經(jīng)元死亡〔14,15〕。缺血性腦水腫通常由細(xì)胞毒性水腫引起,而后發(fā)展為血管源性水腫,且伴有廣泛性腦損傷〔16〕。細(xì)胞毒性水腫是由于細(xì)胞膜上鈉、鉀泵功能受損導(dǎo)致離子失衡,水分向胞內(nèi)遷移、聚集,最終誘發(fā)細(xì)胞水腫。而星形膠質(zhì)細(xì)胞是細(xì)胞毒性水腫的主要類(lèi)型,反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)釋放血管生成因子,該因子在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)皮細(xì)胞中傳遞抑制信號(hào),下調(diào)緊密連接蛋白及閉合蛋白的表達(dá),破壞血腦屏障〔17,18〕。血管源性水腫是血腦屏障破壞的結(jié)果,血腦屏障通透性增加導(dǎo)致離子和蛋白質(zhì)進(jìn)入血管外空間,水分子順濃度梯度滲透、聚集于大腦間質(zhì),誘發(fā)腦水腫〔19〕。

AQP4是一種疏水性跨膜小分子單體,在腦血管周?chē)切文z質(zhì)細(xì)胞終足中表達(dá),并通過(guò)參與水分子通過(guò)血腦屏障的運(yùn)動(dòng),控制神經(jīng)系統(tǒng)的水穩(wěn)態(tài)〔20,21〕。研究表明,腦缺血發(fā)生后,AQP4在反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá),促進(jìn)該細(xì)胞遷移,而反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外滲透壓改變,AQP4在星形膠質(zhì)細(xì)胞前端片脂中發(fā)生極化,水分子流入胞內(nèi),導(dǎo)致細(xì)胞毒性水腫〔22〕。此外,由AQP4介導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹可促進(jìn)谷氨酸興奮性毒性、一氧化氮產(chǎn)生及細(xì)胞因子如:白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6及腫瘤壞死因子-α的釋放,從而加重缺血區(qū)血腦屏障損傷,誘發(fā)腦水腫〔23〕。因此,AQP4在血腦屏障周?chē)切渭?xì)胞終足的優(yōu)先表達(dá),對(duì)腦缺血再灌注損傷性水腫的治療,具有重要意義。

MMP-9是一種活性部位含有鋅離子的內(nèi)肽酶,可消化細(xì)胞外基質(zhì)成分包括層黏連蛋白、纖維連接蛋白、彈性蛋白和蛋白多糖,在腦缺血再灌注過(guò)程發(fā)揮作用〔24〕。腦組織缺血區(qū)域MMP-9表達(dá)增強(qiáng),通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)提高血腦屏障的通透性,從而促進(jìn)血管源性腦水腫,增加炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),促進(jìn)炎癥反應(yīng)和凋亡,從而加劇腦缺血再灌注損傷〔25,26〕。實(shí)驗(yàn)研究表明,在局灶性腦缺血模型中,MMP-9基因缺陷小鼠相比普通小鼠,具有較強(qiáng)的血腦屏障保護(hù)作用〔27〕。臨床研究發(fā)現(xiàn),腦梗死患者梗死核心及缺血半暗帶區(qū)域中MMP-9表達(dá)明顯上調(diào),在梗死核心區(qū),表達(dá)于浸潤(rùn)的中性粒細(xì)胞及活化的小膠質(zhì)細(xì)胞,而在缺血半暗帶區(qū),主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞,表明MMP-9與缺血性腦損傷和繼發(fā)性腦水腫密切相關(guān)〔28〕。因此,抑制MMP-9的表達(dá)可減輕血腦屏障功能障礙及缺血性腦損傷。

綜上所述,腦缺血再灌注可導(dǎo)致腦組織損傷、神經(jīng)功能障礙、腦水腫,同時(shí)伴有血腦屏障通透性增加、炎癥因子浸潤(rùn)、神經(jīng)細(xì)胞凋亡等病理改變〔29〕。本研究結(jié)果說(shuō)明,康益膠囊具有改善腦缺血再灌注損傷,抗腦水腫的作用。康益膠囊可改善腦缺血再灌注損傷、降低繼發(fā)性腦水腫,發(fā)揮腦保護(hù)作用,但腦缺血再灌注損傷病理機(jī)制復(fù)雜,康益膠囊作用機(jī)制是否與炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)、細(xì)胞凋亡有關(guān)及對(duì)血腦屏障的保護(hù)機(jī)制,有待深入研究。