馬黎麗 代俊偉 王衛(wèi)國

(阜陽市人民醫(yī)院檢驗科,安徽 阜陽 236000)

肺炎克雷伯菌(KPN) 是臨床常見的醫(yī)源性條件致病菌,具有較強的致病性,可引起呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)等系統(tǒng)感染,導致肺炎、敗血癥、腦膜炎、肝膿腫,嚴重危及患者生命安全〔1,2〕。研究發(fā)現(xiàn),KPN對β-內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類等常規(guī)抗生素具有較高耐藥性,也是產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)的一類代表菌〔3〕。中國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示,KPN的檢出率、耐藥率呈增加趨勢,其中2017年克雷伯菌屬的耐藥菌株占比約為15%,僅次于大腸桿菌屬,增加了臨床治療困難,因此研究KPN的耐藥性問題具有重要意義〔4〕。近年來,KPN的高檢出率和高耐藥率使噬菌體療法越來越受到臨床關注,相對于抗菌藥的治療,噬菌體治療存在一定優(yōu)勢〔5〕。噬菌體廣泛存在于自然環(huán)境中,多與細菌伴生,其通過裂解細菌而發(fā)揮良好的抗菌效果,且對抗耐藥性的細菌亦存在明顯效果。最新研究發(fā)現(xiàn)噬菌體能夠抑制宿主細菌生物膜的產(chǎn)生,從而對生物膜相關感染實施控制〔6〕。本研究擬回顧性分析2019～2021年臨床分離的產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)和非產(chǎn)ESBLs KPN菌株的臨床分布及耐藥趨勢,并研究噬菌體對于細菌生物膜的影響。

1 材料與方法

1.1材料 菌株從2019～2021年阜陽市人民醫(yī)院老年患者送檢標本(痰、血、膽汁和尿)中提取,剔除同1個患者同1個區(qū)域重復分離的菌株。

1.2采集標本及病原菌相關的培養(yǎng)和鑒定 標本接種在瓊脂平板內(nèi),在5%濃度CO2培養(yǎng)箱內(nèi)設置35 ℃給予24 h培養(yǎng),挑取純菌落單個,采用全自動微生物鑒定儀(型號為VITEK-32型,購自法國梅里埃公司)對病原菌實施鑒定,依據(jù)《全國臨床檢驗操作規(guī)程》〔7〕操作。質(zhì)控菌株是大腸埃希菌(ATCC25922)、金黃色葡萄球菌(ATCC25923)和肺炎克雷伯菌(ATCC13883),購于北京中科公司。

1.3藥敏試驗 利用紙片擴散法(Kirby-Bauer法)檢測病原菌的耐藥性,藥敏紙片由英國Oxoid公司提供。用瓊脂平板對細菌實施培養(yǎng),在液體培養(yǎng)基內(nèi)將平板上產(chǎn)生的單菌落接種擴大培養(yǎng)后于血瓊脂平板內(nèi)接種,待單菌落后長出實施相關的藥敏試驗,用游標卡尺對抑菌圈的直徑實施檢測。抗菌藥物包括:阿莫西林、阿米卡星、左氧氟沙星、頭孢西丁、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦、環(huán)丙沙星、亞胺培南、美羅培南、氯霉素、慶大霉素。按照美國國家臨床實驗室標準化研究所標準〔8〕判斷結(jié)果。

1.4泛耐藥肺炎克雷伯菌(PDR-KPN)噬菌斑的形態(tài) 根據(jù)文獻〔9〕方法得到高濃度的噬菌體混懸液(1×1011PFU/ml),濾器(孔徑0.22 μm)過濾,4 ℃保存。取1 ml噬菌體混懸液,23 000 r/min×4 ℃離心10 min,除去上清液,加入100 μl噬菌體保存液,戊二醛溶液(3%)固定0.5 h后轉(zhuǎn)移至銅網(wǎng)(300目)上,磷鎢酸(2%,pH7.2)負染30 s,干燥處理后于JEM1400 plus透射電鏡下觀察噬菌體形態(tài)。

1.5噬菌體對宿主菌生物膜的作用 取噬菌體混懸液及宿主菌液(終濃度為3×108PFU/ml)。生物膜抑制實驗中,根據(jù)感染復數(shù)1.000、0.100、0.010和0.001,調(diào)整噬菌體混懸液的效價,在96孔板內(nèi)加入體積為200 μl的宿主菌液及20 μl噬菌體混懸液(平行3份),陰性對照組中加入200 μl宿主菌液及20 μl噬菌體保存液,空白對照組中加入220 μl LB培養(yǎng)液,37 ℃孵育48 h。生物膜破壞試驗中,于96孔板中加入200 μl宿主菌液,37 ℃孵育48 h,每孔加入20 μl噬菌體混懸液(平行3份),噬菌體效價分別為1×106、107、108、109、1010PFU/ml,陰性對照組中加入200 μl宿主菌液及20 μl噬菌體保存液,空白對照組中加入220 μl LB培養(yǎng)液,37 ℃孵育48 h。采用結(jié)晶紫染色法半定量測定生物膜,除去混合液,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次,每孔中加入100 μl甲醇(10%)固定15 min,風干甲醇后加入100 μl體積的結(jié)晶紫溶液(濃度為4 g/L),染色10 min后將結(jié)晶紫染色液除去,并用蒸餾水將板洗至無色。晾干后加入體積為100 μl的冰乙酸(濃度為33%),設定37 ℃在恒溫培養(yǎng)箱中孵育30 min,充分溶解結(jié)晶紫。采用Synergy2型酶標儀(美國BioTek公司)測定每孔中的吸光度值,最大吸收波長為595 nm,最終取3次均值。生物膜抑制率=(陰性對照的吸光度值-共培養(yǎng)的吸光度值)/(陰性對照的吸光度值-空白對照的吸光度值)×100%,生物膜破壞率=(陰性對照吸光度值-共培養(yǎng)吸光度值)/(陰性對照吸光度值-空白對照吸光度值)×100%。

1.6統(tǒng)計學分析 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1KPN臨床分布特點 KPN主要分離于痰液、尿液、血液,見表1。

表1 KPN臨床分布特點〔n(%)〕

2.2KPN檢出率 見表2。

表2 3年KPN檢出率〔n(%)〕

2.3KPN耐藥情況 產(chǎn)ESBLs菌、非產(chǎn)ESBLs菌對氯霉素、阿莫西林、慶大霉素的耐藥率比較高,而對亞胺培南、美羅培南的耐藥率比較低,非產(chǎn)ESBLs對主要抗生素的耐藥率均低于產(chǎn)ESBLs,見表3。

表3 KPN耐藥性〔n(%)〕

2.4PDR-KPN噬菌斑形態(tài) PDR-KPN噬菌斑在雙層平板上呈圓形、透亮狀態(tài),噬菌斑周圍有一半透明圈,大小較為均一,直徑約為1.6 mm。

2.5噬菌體對宿主菌生物膜的抑制作用 0.001、0.010、0.100、1.000共同對噬菌體和宿主菌實施培養(yǎng),生物膜抑制率為(44.61±4.33)%、(44.28±4.52)%、(45.32±5.28)%、(45.25±4.21)%,平均(44.87±5.54)%。

2.6噬菌體對宿主菌生物膜的破壞作用 隨著噬菌體效價的升高,生物膜破壞率逐漸升高,其中當效價為1×106、1×107、1×108PFU/ml時,破壞率為(15.33±2.48)%、(28.61±2.55)%、(37.37±2.72)%,當效價為1×109PFU/ml時,生物膜破壞最高達為(41.73±2.61)%,效價為1×1010PFU/ml時〔(35.33±2.51)%〕呈降低趨勢。

3 討 論

KPN屬于革蘭陰性桿菌,具有高的侵襲性,是醫(yī)院獲得性感染中最為常見的致病菌,其引起的典型疾病為原發(fā)性肺炎、多種肺外感染〔10〕。研究認為〔11〕,抗菌藥物大量不合理的使用是造成KPN耐藥率、感染率均呈上升趨勢的重要原因,特別是KPN耐藥菌株的廣泛存在,給疾病治療方面帶來很大挑戰(zhàn)。本研究結(jié)果表明,呼吸道感染、泌尿道感染及血流感染是醫(yī)院感染的多發(fā)部位,提示臨床醫(yī)務工作者需重點關注以上易感染部位,采取預防性的抗感染措施,及時控制醫(yī)院感染。本文中KPN檢出率與以往研究結(jié)果存在一定程度差異,可能與不同醫(yī)院和地區(qū)對頭孢菌素的數(shù)量、種類及時間使用的不同對 ESBLs的篩選、誘導差異有關〔12,13〕。產(chǎn)ESBLs KPN的分離率出現(xiàn)了上升趨勢,其中不合理使用廣譜抗菌藥是最為直接的因素,亦說明合理使用廣譜抗菌藥的必要性。同時,進一步分析發(fā)現(xiàn),產(chǎn)ESBLs菌、非產(chǎn)ESBLs菌對氯霉素、阿莫西林、慶大霉素的耐藥率比較高,而對亞胺培南、美羅培南的耐藥率比較低(不超過2%),非產(chǎn)ESBLs對主要抗生素的耐藥率均低于產(chǎn)ESBLs。KPN產(chǎn)ESBLs是導致β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥的主要機制,故而產(chǎn)ESBLs的耐藥率明顯高于非產(chǎn)ESBLs。同時,因為多數(shù)ESBLs基因由質(zhì)粒所介導,而質(zhì)粒攜帶了AmpC 酶喹諾酮類藥物、氨基糖苷鈍化酶等耐藥基因,從而造成多重耐藥的產(chǎn)生〔14〕。

近年來,噬菌體療法已成為抗菌藥物以外的另一種抗感染治療方案,且隨著噬菌體技術(shù)不斷發(fā)展,已被廣泛應用于多種病原菌感染性疾病。同時,噬菌體于自然界廣泛存在,具有分離篩選簡單快速、數(shù)量多的特點,且噬菌體通過裂解細菌而殺滅病原菌的效果,可對耐藥菌株產(chǎn)生良好的殺菌作用。本研究發(fā)現(xiàn),PDR-KPN噬菌斑在雙層平板上呈圓形、透亮,大小較為均一,直徑約為1.6 mm。其中,噬菌斑的透明度越高、體積越大,則代表噬菌體對宿主菌的殺傷力越強;且既往研究發(fā)現(xiàn)〔15〕,噬菌斑隨著時間延長而擴大,說明噬菌體可持續(xù)性殺傷宿主菌。噬菌體感染宿主具有嚴格的特異性,并不會干擾其他菌群,從而可避免菌群的二重感染、失調(diào)。目前,已有相關研究顯示噬菌體可能會對腸道的共生微生物產(chǎn)生影響〔16〕,臨床上需要明確噬菌體療法的療效,從而為臨床方案的制定提供指導。

KPN可形成生物膜,從而在患者感染組織及醫(yī)療器械上構(gòu)成一道物理屏障,進而抵抗消毒劑、抗菌藥物的殺滅,使其比游離KPN對抗菌藥物更加耐受,增加了院內(nèi)傳播風險。KPN的生物膜形成存在循環(huán)往復的特點,在臨床上會表現(xiàn)出靜止期和急性期交替反復感染的情況〔17〕。本研究結(jié)果表明,噬菌體可有效抑制宿主菌生物膜的影響,且基本不受噬菌體感染復數(shù)的影響。既往研究發(fā)現(xiàn)〔18〕,該抑制效能為時間依賴性,即作用時間越長則抑制率越高,在臨床抗菌治療中可采取抗菌藥物與噬菌體的聯(lián)用,完全殺滅感染細菌。對于已形成生物膜的KPN,隨著噬菌體效價的升高,生物膜破壞率逐漸升高,表明在一定范圍內(nèi)破壞生物膜能力隨著效價的升高而增強,隨后進一步增加效價反而存在降低趨勢。盡管既往研究也發(fā)現(xiàn)噬菌體的抗菌作用,噬菌體KPN噬菌體B5055與鈷離子聯(lián)用使用時,對生物膜的破壞能力更強,噬菌體與抗菌藥物聯(lián)用使用時,可有效殺滅病原菌,保留感染患肢〔19,20〕,但目前對于抑制、破壞生物膜的作用機制尚不明確,因此仍需通過分子、細胞生物學水平的研究進行深入探討。

綜上,2019～2022年ESBLs檢出率總體呈上升趨勢,對非β-內(nèi)酰胺類抗菌藥具有較高耐藥性,對碳青霉烯類抗菌藥物具有較高敏感性。PDR-KPN噬菌體可破壞宿主菌的生物膜及抑制宿主菌生物膜的形成。