龍 威， 陳志龍， 劉穗汕

（廣東石油化工學(xué)院 化學(xué)學(xué)院，廣東 茂名 525000）

隨著生活水平的不斷提高，人們對(duì)自身健康的認(rèn)識(shí)和保護(hù)層次逐漸提升，抑菌材料作為科技領(lǐng)域的新興分支已悄然興盛起來(lái)[1]。 不管是醫(yī)療衛(wèi)生行業(yè)還是食品生產(chǎn)與保鮮，抑菌材料均發(fā)揮著重要的作用，甚至在交通工具、衣著防護(hù)、公共設(shè)施等方面也有廣泛的應(yīng)用[2]。

納米TiO2的抑菌性能良好，歸因于自身的高氧化態(tài)，無(wú)毒無(wú)害易保存，在眾多科技領(lǐng)域內(nèi)均有應(yīng)用與報(bào)道[3-5]，而它并非是萬(wàn)能的。 純的TiO2粉末質(zhì)量很輕，空氣的浮動(dòng)就可將TiO2粉末吹散。 TiO2粉末與其他物質(zhì)復(fù)合形成功能材料，可有效彌補(bǔ)這個(gè)缺陷，于是各種含TiO2的纖維、布料、薄膜等被研制出來(lái)[6]。 研究者為了進(jìn)一步提高抑菌活性，將金屬離子摻雜在納米TiO2中加強(qiáng)TiO2的抑菌活性已有報(bào)道[7-9]。

通常來(lái)說(shuō)，直接負(fù)載摻雜法指僅經(jīng)過(guò)一個(gè)步驟合成載有其他金屬離子的納米TiO2（合成納米TiO2的同時(shí)引入金屬離子）， 此種方法的優(yōu)點(diǎn)是混合均勻、結(jié)構(gòu)統(tǒng)一、重復(fù)性好。 間接負(fù)載法是指通過(guò)2 個(gè)步驟對(duì)TiO2進(jìn)行改性，即先合成好基體TiO2，然后通過(guò)浸漬法、物理吸附法等方法將金屬離子負(fù)載上去[10]，這種方法只修飾表面、節(jié)約成本、穩(wěn)定性較差。因此，2 種方法都有自身的優(yōu)點(diǎn)和不足，其制備工藝和運(yùn)用推廣都有報(bào)道[11]。 單純的TiO2粉末具有良好的抑菌和光催化活性[12-13]，但抑菌活性并未達(dá)到100%，光催化活性如何控制也有待解決。 為了有效地提升抑菌活性，將TiO2粉末進(jìn)行金屬離子摻雜引起了研究者的關(guān)注。

2008 年，周建斌等將TiO2與竹炭結(jié)合，發(fā)現(xiàn)改性后的竹炭對(duì)黑曲霉菌和綠色木霉菌的抑菌效果好，TiO2可有效地運(yùn)用于竹炭的加工和保護(hù)[14]。董成成等提出對(duì)TiO2進(jìn)行修飾改性或與其他材料復(fù)合，可賦予材料更好的抑菌活性[15]，主要修飾的成分有非金屬的N 和S、金屬的Ag 和Zn、稀土元素的La和Ce 等。 黃卓林等采用脲和硫脲對(duì)TiO2進(jìn)行N、S的摻雜改性，制備的復(fù)合淀粉膜在可見(jiàn)光下對(duì)大腸桿菌的抑菌率分別提高到89%和95%，比單純TiO2的抑菌率提高了近30%，可用于圣女果的保存與儲(chǔ)藏過(guò)程[16]。 鄭苗苗等采用了溶膠凝膠法和水熱法制備了Ag-TiO2整理棉織物實(shí)驗(yàn)， 發(fā)現(xiàn)摻雜銀后的TiO2可大大提高棉織物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌性能，抗紫外線活性也很好，經(jīng)25 次洗滌后仍保持不變[17]。 秦湯等也采用液相沉淀法成功制備了Ag+/TiO2/SiO2納米復(fù)合材料， 討論了正硅酸四乙酯的加入量對(duì)復(fù)合材料的抗變色性能和抑菌性能， 發(fā)現(xiàn)其對(duì)大腸桿菌抑菌99%的最小質(zhì)量濃度為55 mg/L[18]。 石振武等則使用光沉積法制備Ag@TiO2@SiO2復(fù)合材料，發(fā)現(xiàn)其在紫外光照射下有高催化活性，當(dāng)Ag+質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL 時(shí)，此復(fù)合材料對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌率高達(dá)93%以上，可用于水處理或醫(yī)療器械的消毒[19]。

在TiO2基體上摻雜其他元素也有報(bào)道，如馬超等通過(guò)溶膠-凝膠法制備了含Zn2+摻雜的納米TiO2微粉，在自然光線下對(duì)紅棗鏈格孢、黃瓜枯萎病等6種病原菌進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%的Zn2+摻雜會(huì)明顯改善抑菌活性，對(duì)黃瓜枯萎菌抑制有較好的選擇性，且穩(wěn)定性非常好[20]。陳霞等選擇稀土金屬La 和Ce 摻雜改性TiO2復(fù)合材料，發(fā)現(xiàn)稀土金屬La 對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌具有明顯的促進(jìn)作用，而稀土金屬Ce 的作用不明顯[21]。 當(dāng)摻雜金屬La 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.24%時(shí)，復(fù)合材料對(duì)羅丹明B 的脫色率高達(dá)91.2%， 對(duì)金黃色葡萄球菌最小抑制質(zhì)量濃度為37.5 mg/mL[22]。 摻雜Fe、Au 等元素的納米TiO2微粉在光催化和抑菌性能方面也有報(bào)道[23-24]，但過(guò)高的貴金屬比例會(huì)提高抑菌片成本，不利于在食品工業(yè)中推廣和運(yùn)用[25]。

為了研究摻雜金屬對(duì)TiO2抑菌片的性能差異，作者選擇固定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的Ag+、Zn2+和Fe3+摻雜TiO2， 通過(guò)抑菌圈、MIC、MBC 的綜合評(píng)價(jià)方法對(duì)其進(jìn)行抑菌性能評(píng)估，通過(guò)微觀結(jié)構(gòu)表征進(jìn)行比較分析，探討常見(jiàn)的3 種金屬離子摻雜后抑菌片的抑菌性能差異及相關(guān)影響因素，獲得了較好的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

無(wú)水乙醇、鈦酸四丁酯、冰醋酸、AgNO3、FeCl3、（CH3COO）2Zn、尿素：分析純，購(gòu)于天津市大茂化學(xué)試劑廠；馬鈴薯淀粉、氯化鈉、瓊脂、牛肉膏、蛋白胨：分析純，購(gòu)于上海麥克林生化有限公司；大腸桿菌斜面二代（型號(hào)為ATCC25922）、金黃色葡萄球菌斜面二代（型號(hào)為ATCC65438）：購(gòu)于北京生物保藏中心；去離子水：自制。

智能馬弗爐（XL-1A 型）：杭州卓馳儀器有限公司；恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9030A 型）：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；恒溫加熱攪拌器（85-2A 型）：金壇億能實(shí)驗(yàn)儀器廠；恒溫培養(yǎng)箱（DGH 型）：瀘鴻儀器設(shè)備有限公司；高溫高壓滅菌鍋（JX-18B 型），上海金鑫醫(yī)療器械有限公司；可見(jiàn)光分光光度計(jì)（721型）： 大地自動(dòng)化儀器有限公司； 手動(dòng)藥片壓片機(jī)（直徑10 mm）： 東莞市日順興金屬制品有限公司；比濁管、玻璃培養(yǎng)皿（無(wú)菌型）：北京寶元興業(yè)科技有限公司。

1.2 金屬摻雜納米TiO2 的制備

取質(zhì)量為17.0 g 的無(wú)水乙醇和質(zhì)量為3.0 g 的冰醋酸，混合均勻后，在磁力攪拌下向溶液中緩慢滴加鈦酸四丁酯（TBOT），混合均勻后繼續(xù)攪拌30 min， 分別將Ag、Fe、Zn 元素代表物按Ti 元素質(zhì)量的0.4%加入溶液中，待固體粉末完全溶解后，繼續(xù)攪拌1.5 h 后將溶液轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯內(nèi)襯中，置110 ℃烘箱加熱15 h，冷卻后抽濾，用去離子水及無(wú)水乙醇分別洗滌3 次，烘干研磨后即得金屬摻雜的納米TiO2粉末。取上述少許干燥粉末與干燥好的馬鈴薯淀粉充分研磨均勻后放入壓片機(jī)進(jìn)行壓片，制作好的抑菌片質(zhì)量控制在0.20 g， 直徑大小固定為1.0 cm，后續(xù)抑菌活性實(shí)驗(yàn)備用。

1.3 表征方法

BET 在3h-2000PS1 型比表面積分析儀上進(jìn)行， 采用N2吸附脫附方式測(cè)定孔徑孔容數(shù)據(jù)；XRD在Ultima 型X 射線衍射儀上進(jìn)行，CuKα 射線，石墨單色器，管電壓40 kV，管電流30 mA，閃爍計(jì)數(shù)器記錄衍射強(qiáng)度；IR 表征在Thermo Scientific 型紅外光譜分析儀上進(jìn)行， 采用KBr 壓片制樣；SEM 用JSM-6510 LV 型掃描電鏡儀進(jìn)行拍攝，鎢絲燈作為光源。

1.4 抑菌測(cè)試方法

1.4.1 配置固體培養(yǎng)基 準(zhǔn)確稱(chēng)量5.0 g 蛋白胨、15.0 g 瓊脂粉、3.0 g 牛肉浸膏和5.0 g 氯化鈉，溶解在1 000 mL 去離子水中，不斷攪拌加熱溶解。 煮沸5~10 min，待瓊脂完全溶解，調(diào)節(jié)pH 為7.0~7.2。然后分裝到試管或錐形瓶?jī)?nèi)，試管裝到1/3 處，在高溫高壓滅菌鍋內(nèi)于120 ℃滅菌20 min，冷卻后密閉無(wú)菌冷藏備用。

將已活化的菌種接種至已滅菌的無(wú)菌液體培養(yǎng)基中， 放入培養(yǎng)箱中于37 ℃培養(yǎng)18 h， 取4 mL菌液至比色皿中，用可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)量菌液在625 nm 處的吸光度。通過(guò)比濁管中特定濃度菌液在分光光度計(jì)中測(cè)吸光度， 形成標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度曲線，用吸光度再推導(dǎo)出試樣菌液的質(zhì)量濃度。

1.4.2 抑菌圈測(cè)試 將抑菌片緊密粘貼在培養(yǎng)基中央，放置于3 W 的LED 光照下的細(xì)菌培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)特定時(shí)間后測(cè)量培養(yǎng)基上出現(xiàn)的抑菌環(huán)直徑的大小，通過(guò)對(duì)比不同的抑菌材料抑菌圈的大小及抑菌圈直徑隨時(shí)間的變化趨勢(shì)，初步得到不同抑菌材料的抑菌性能。 抑菌圈實(shí)驗(yàn)在相同條件下平行做2 次，結(jié)果取2 次數(shù)據(jù)的平均值。

1.4.3 MIC 測(cè)試 配置一系列濃度的抑菌溶液，再將溶液加到實(shí)驗(yàn)用菌液中， 放入培養(yǎng)箱于37 ℃進(jìn)行培養(yǎng)，每隔2 h 將菌液取出搖勻后，測(cè)定它在625 nm 處的吸光度，得到多組數(shù)據(jù)后擬合成曲線，可以判斷菌落的生長(zhǎng)情況，曲線中吸光度不隨時(shí)間變化的抑菌材料最低質(zhì)量濃度即為抑菌材料的最小抑菌質(zhì)量濃度MIC。 實(shí)驗(yàn)在相同條件下平行做3 次，結(jié)果取3 次數(shù)據(jù)的平均值。

1.4.4 MBC 測(cè)試 根據(jù)MIC 中的測(cè)試結(jié)果， 選取幾組配置好的菌液進(jìn)行涂平板觀察菌落生長(zhǎng)情況。將菌液用生理鹽水稀釋至10-6，取0.1 mL 稀釋后的菌液滴加至培養(yǎng)基中，涂布均勻，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，對(duì)比不同抑菌材料質(zhì)量濃度對(duì)菌液生長(zhǎng)狀況的影響， 能完全殺滅細(xì)菌的最低質(zhì)量濃度即為MBC。實(shí)驗(yàn)在相同條件下平行做3 次，結(jié)果取3 次數(shù)據(jù)的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌圈測(cè)試性能分析

2.1.1 對(duì)大腸桿菌的抑菌測(cè)試 利用純TiO2粉末制作成質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為10%、20%和30%的抑菌片，培養(yǎng)12 h 后測(cè)試其抑菌圈直徑，分別為14、16、20 mm，可作為參比數(shù)據(jù)[26]。 將3 種不同的樣品Ag@TiO2、Fe@TiO2和Zn@TiO2的粉末，分別制作成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%、20%、30%的抑菌片對(duì)大腸桿菌進(jìn)行抑菌圈測(cè)試實(shí)驗(yàn)。 當(dāng)TiO2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，相對(duì)于無(wú)金屬摻雜情況， 摻雜了Ag+、Zn2+、Fe3+的納米TiO2抑菌片的抑菌圈直徑分別增加至34、17、15 mm；當(dāng)TiO2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%時(shí)，相對(duì)于無(wú)金屬摻雜情況，摻雜了Ag+、Zn2+、Fe3+的納米TiO2抑菌片的抑菌圈直徑分別增加至38、29、22 mm；當(dāng)TiO2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%時(shí)，相對(duì)于無(wú)金屬摻雜情況，摻雜了Ag+、Zn2+、Fe3+的納米TiO2抑菌片的抑菌圈直徑分別增加至40、29、24 mm。 抑菌圈直徑的增加表明3 種金屬離子的摻雜在一定程度上改善了納米TiO2的抑菌性能，而摻雜Ag+具有最大的優(yōu)勢(shì)，摻雜Zn2+次之。

為了更準(zhǔn)確地研究抑菌的持久性能，分別固定TiO2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%、20%和30%制作抑菌片，研究3 種不同樣品Ag@TiO2、Fe@TiO2和Zn@TiO2的抑菌片對(duì)大腸桿菌連續(xù)抑菌圈培養(yǎng)的影響。 當(dāng)TiO2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，培養(yǎng)12 h 后每隔3 h 記錄抑菌圈直徑大小，得到“抑菌圈直徑-時(shí)間”曲線，見(jiàn)圖1。

圖1 3 種質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的TiO2 抑菌片隨時(shí)間變化對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑的影響Fig. 1 Variation trends of antibacterial zone diameters and time for three TiO2 antibacterial tablets with a mass fraction of 10% on Escherichia coli

由圖1 可以看出，Ag@TiO2的抑菌片的抑菌性能遠(yuǎn)超其他2 組樣品，且其抑菌性能隨時(shí)間的變化比較穩(wěn)定。 12 h 時(shí)抑菌圈直徑達(dá)34 mm，24 h 內(nèi)抑菌圈直徑都維持在32 mm 以上，36 h 后Ag@TiO2的抑菌片仍有較大的抑菌圈，表明它的抑菌持久性好。 Zn@TiO2的抑菌片的抑菌性能相對(duì)于Fe@TiO2的抑菌片較好一些，兩者的抑菌圈直徑隨時(shí)間延長(zhǎng)變化的趨勢(shì)基本一致。

當(dāng)TiO2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%時(shí)，3 種金屬摻雜的納米TiO2抑菌片對(duì)大腸桿菌的抑菌效果影響用連續(xù)抑菌圈測(cè)試， 培養(yǎng)12 h 后每隔3 h 記錄菌圈直徑，得到“抑菌圈直徑-時(shí)間”曲線，見(jiàn)圖2。

圖2 3 種質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的TiO2 抑菌片隨時(shí)間變化對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑的影響Fig. 2 Variation trends of antibacterial zone diameters and time for three TiO2 antibacterial tablets with a mass fraction of 20% on Escherichia coli

由圖2 可知，TiO2抑菌片中納米TiO2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%時(shí)，Ag@TiO2的抑菌片的抑菌性也遠(yuǎn)超其他2 組樣品， 且12 h 時(shí)抑菌圈直徑達(dá)38 mm，24 h時(shí)抑菌圈直徑達(dá)34 mm，36 h 后Ag@TiO2的抑菌片仍有較大的抑菌圈， 表明它的抑菌持久性好。Zn@TiO2抑菌片的抑菌圈直徑明顯比Fe@TiO2抑菌片的大，兩者的抑菌圈直徑隨時(shí)間的變化趨勢(shì)基本一致，而Fe@TiO2抑菌片的抑菌活性降低更為明顯。

當(dāng)TiO2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%時(shí)，3 種金屬摻雜的納米TiO2抑菌片對(duì)大腸桿菌的抑菌效果用連續(xù)抑菌圈測(cè)試， 培養(yǎng)12 h 后每隔3 h 記錄抑菌圈直徑，得到“抑菌圈直徑-時(shí)間”曲線，也出現(xiàn)了上述類(lèi)似的結(jié)果，見(jiàn)圖3。

圖3 3 種質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的TiO2 抑菌片隨時(shí)間變化對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑的影響Fig. 3 Variation trends of antibacterial zone diameters and time for three TiO2 antibacterial tablets with a mass fraction of 30% on Escherichia coli

綜合圖1~3 的情況，隨著抑菌片中納米TiO2粉末質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加， 抑菌圈直徑數(shù)據(jù)有所增大，納米TiO2抑菌性能有明顯提升。Ag@TiO2、Zn@TiO2和Fe@TiO2的抑菌片抑菌性能比無(wú)摻雜的有明顯提高，且三者抑菌圈直徑隨時(shí)間的變化很小，其抑菌持久性好。 說(shuō)明Ag+和Zn2+摻雜對(duì)納米TiO2抑制大腸桿菌具有很大提升作用；Fe3+的摻雜對(duì)納米TiO2的抑菌圈直徑雖有改善但相對(duì)較小，其抑菌性能提升的幅度相對(duì)較弱。

Fe@TiO2對(duì)大腸桿菌的抑菌效果較弱， 主要體現(xiàn)在納米TiO2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為10%、20%、30%時(shí)， 培養(yǎng)12 h 時(shí)Fe@TiO2抑菌圈直徑僅分別增加1、6、4 mm； 培養(yǎng)至36 h 后抑菌圈直徑減小至12、16、19 mm，抑菌效果較差。 納米TiO2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%時(shí)，培養(yǎng)12 h 時(shí)抑菌圈直徑為22 mm；培養(yǎng)36 h后抑菌圈直徑減小特別明顯。 Ag@TiO2和Zn@TiO2的抑菌片抑菌效果好，尤其是Ag@TiO2抑菌片不管納米TiO2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高低均體現(xiàn)了較大的抑菌圈直徑，且抑菌圈直徑隨時(shí)間的延長(zhǎng)變化小，在抑菌性能上具有最大的優(yōu)勢(shì)。

2.1.2 對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌測(cè)試 利用純TiO2粉末制作成質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為10%、20%和30%的抑菌片，對(duì)金黃色葡萄球菌培養(yǎng)12 h 后測(cè)試其抑菌圈直徑，分別為14、17、19 mm，可作為參比數(shù)據(jù)。將3 種不同的樣品Ag@TiO2、Fe@TiO2和Zn@TiO2的粉末， 選擇TiO2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%、20%和30%也分別制作成抑菌片，對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行抑菌圈測(cè)試實(shí)驗(yàn)。相對(duì)于無(wú)金屬摻雜的情況，Ag@TiO2的抑菌性能有明顯提高，Zn@TiO2抑菌片的抑菌性能有較好的改善但不穩(wěn)定，F(xiàn)e@TiO2的抑菌性能無(wú)明顯改善。

為了更準(zhǔn)確地研究抑菌的持久性能，分別固定TiO2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%、20%和30%制作抑菌片，研究Ag@TiO2、Fe@TiO2和Zn@TiO2抑菌片對(duì)金黃色葡萄球菌的連續(xù)抑菌圈培養(yǎng)的影響。當(dāng)TiO2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，培養(yǎng)12 h 后每隔3 h 記錄抑菌圈直徑大小，得到“抑菌圈直徑-時(shí)間”曲線，見(jiàn)圖4。發(fā)現(xiàn)Ag@TiO2抑菌片對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑高達(dá)30 mm，Zn@TiO2的納米TiO2抑菌片對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑高達(dá)22 mm，F(xiàn)e@TiO2的抑菌效果無(wú)明顯改善。

圖4 3 種質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的TiO2 抑菌片隨時(shí)間變化對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑的影響Fig. 4 Variation trends of antibacterial zone diameters and time for three TiO2 antibacterial tablets with a mass fraction of 10% on Staphylococcus aureus

由圖4 可知，Ag@TiO2抑菌片的抑菌效果遠(yuǎn)超其他2 組樣品，且其抑菌性能與無(wú)摻雜的納米TiO2相比，12 h 時(shí)抑菌圈直徑高達(dá)30 mm， 抑菌圈直徑隨時(shí)間的延長(zhǎng)變化小， 說(shuō)明其抑菌持久性好。Zn@TiO2的抑菌圈直徑也有較大的增加， 但抑菌圈直徑隨時(shí)間的延長(zhǎng)變化大，抑菌持久性弱。 Fe@TiO2的抑菌圈直徑與沒(méi)有摻雜時(shí)無(wú)明顯變化，其抑菌活性比較穩(wěn)定。

當(dāng)TiO2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%時(shí)，研究了3 種金屬摻雜的納米TiO2抑菌片對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果的影響，培養(yǎng)12 h 后每隔3 h 記錄抑菌圈直徑大小，見(jiàn)圖5。

圖5 3 種質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的TiO2 抑菌片隨時(shí)間變化對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑的影響Fig. 5 Variation trends of antibacterial zone diameters and time for three TiO2 antibacterial tablets with a mass fraction of 20% on Staphylococcus aureus

由圖5 可知，抑菌片中納米TiO2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加到20%，Ag@TiO2抑菌性能稍有提升， 隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，抑菌圈直徑變化減少，抑菌持久性進(jìn)一步提高。 Zn@TiO2的抑菌圈直徑與Ag@TiO2的一樣，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)迅速減少，36 h 的抑菌圈直徑已經(jīng)減少到22 nm，F(xiàn)e@TiO2的抑菌圈直徑較無(wú)金屬摻雜的變化不大，且隨時(shí)間的延長(zhǎng)下降明顯。

當(dāng)TiO2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%時(shí)，研究了3 種金屬摻雜的納米TiO2抑菌片對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果。 培養(yǎng)12 h 后每隔3 h 記錄抑菌圈直徑大小，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 3 種質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的TiO2 抑菌片隨時(shí)間變化對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑的影響Fig. 6 Variation trends of antibacterial zone diameters and time for three TiO2 antibacterial tablets with a mass fraction of 30% on Staphylococcus aureus

由圖6 可知，當(dāng)納米TiO2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%時(shí)，Ag@TiO2抑菌片的抑菌性能較TiO2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%時(shí)有明顯提高 （增加了10 mm），Zn@TiO2和Fe@TiO2的抑菌環(huán)直徑增加幅度僅約2 mm。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，Ag@TiO2抑菌片還保持了穩(wěn)定的抑菌活性，24 h 的抑菌圈直徑為38 mm，36 h 的抑菌圈直徑為37 mm。Zn@TiO2的抑菌圈直徑在24 h 降低至25 mm，36 h 的抑菌圈直徑降低至20 mm， 表明Zn@TiO2的抑菌活性非常不穩(wěn)定。 Fe@TiO2的抑菌活性比較穩(wěn)定，抑菌環(huán)直徑與無(wú)金屬摻雜時(shí)相當(dāng)。

抑菌性能的提升與TiO2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)也有一定關(guān)系，抑菌片中TiO2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)越大，金屬摻雜后抑菌性能提升越明顯。 從3 種金屬摻雜的納米TiO2對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果隨時(shí)間的變化趨勢(shì)可知，Ag@TiO2的抑菌效果最佳，不僅抑菌環(huán)直徑增大且抑菌穩(wěn)定時(shí)間長(zhǎng)，抑菌環(huán)直徑隨時(shí)間延長(zhǎng)的變化小。Zn@TiO2也有改善抑菌的效果，但抑菌環(huán)直徑隨時(shí)間延長(zhǎng)的變化大，十分不穩(wěn)定。Fe@TiO2抑菌效果較無(wú)金屬摻雜的純TiO2粉末變化不明顯，但增加了抑菌的穩(wěn)定時(shí)間。

2.2 最小抑菌質(zhì)量濃度測(cè)試（MIC）

因?yàn)镕e@TiO2抑菌效果遠(yuǎn)低于Ag@TiO2和Zn@TiO2， 選擇Ag@TiO2和Zn@TiO2分別進(jìn)行對(duì)大腸桿菌菌液進(jìn)行MIC 測(cè)試實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 Ag@TiO2 和Zn@TiO2 樣品對(duì)大腸桿菌的MIC 測(cè)試Fig. 7 MIC test of Ag@TiO2 and Zn@TiO2 against Escherichia coli

在不添加樣品時(shí)， 溶液的吸光度快速增長(zhǎng)，符合菌落的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)規(guī)律，圖7（a）為不同質(zhì)量濃度的Ag@TiO2在24 h 內(nèi)對(duì)大腸桿菌菌液吸光度的影響。在菌落培養(yǎng)的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)， 在質(zhì)量濃度不小于10 mg/L 的3 組試樣在625 nm 波長(zhǎng)的后段時(shí)間吸光度并沒(méi)有很大變化，表明大腸桿菌的生長(zhǎng)受該質(zhì)量濃度的Ag@TiO2試樣的抑制， 因此，Ag@TiO2對(duì)大腸桿菌的MIC 約為10 mg/L。 由圖7（a）可以看出，在Ag@TiO2試樣質(zhì)量濃度小于10 mg/L 時(shí)溶液搖勻后渾濁， 而試樣質(zhì)量濃度大于10 mg/L 時(shí)溶液搖勻后較為澄清，與吸光度曲線一致。

圖7（b）為不同質(zhì)量濃度下的Zn@TiO2在24 h內(nèi)對(duì)大腸桿菌菌液吸光度的影響。 在菌落培養(yǎng)的過(guò)程發(fā)現(xiàn)， 在Zn@TiO2試樣質(zhì)量濃度不小于30 mg/L的2 組試樣在625 nm 波長(zhǎng)的后段時(shí)間吸光度并沒(méi)有很大變動(dòng)， 表明大腸桿菌的生長(zhǎng)受該質(zhì)量濃度Zn@TiO2試樣的抑制。 當(dāng)Zn@TiO2試樣質(zhì)量濃度小于30 mg/L 時(shí)，試樣吸光度基本與0 mg/L 的菌液吸光度相符， 因此Zn@TiO2對(duì)大腸桿菌的MIC 為30 mg/L。 圖7 也可以看出，在試樣Zn@TiO2質(zhì)量濃度小于30 mg/L 時(shí)溶液搖勻后成渾濁， 而質(zhì)量濃度大于或等于30 mg/L 時(shí)溶液搖勻后較為澄清， 與吸光度變化曲線一致。

選擇Ag@TiO2和Zn@TiO2分別進(jìn)行對(duì)金黃色葡萄球菌菌液的MIC 實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖8。 在不添加樣品時(shí)，溶液吸光度快速增長(zhǎng)，符合菌落的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)規(guī)律，圖8（a）為不同質(zhì)量濃度下的Ag@TiO2試樣在24 h 內(nèi)對(duì)金黃色葡萄球菌菌液吸光度的影響。在菌落培養(yǎng)的過(guò)程發(fā)現(xiàn)，Ag@TiO2試樣質(zhì)量濃度不小于10 mg/L 的3 組試樣在后段時(shí)間內(nèi)在625 nm 下的吸光度并沒(méi)有很大的變動(dòng)，表明金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)受該質(zhì)量濃度Ag@TiO2試樣的抑制。 因此，Ag@TiO2試樣對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC 為10 mg/L，且Ag@TiO2試樣質(zhì)量濃度為0 mg/L 溶液搖勻后渾濁，而10 mg/L 搖勻后溶液較為澄清，與吸光度變化曲線一致。

圖8 Ag@TiO2 和Zn@TiO2 樣品對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC 測(cè)試Fig. 8 MIC test of Ag@TiO2 and Zn@TiO2 against Staphylococcus aureus

圖8（b）為不同質(zhì)量濃度下的Zn@TiO2試樣在24 h 內(nèi)對(duì)金黃色葡萄球菌菌液吸光度的影響。 在菌落培養(yǎng)的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，在Zn@TiO2試樣質(zhì)量濃度不小于30 mg/L 的2 組試樣在后段時(shí)間內(nèi)在625 nm下的吸光度幾乎沒(méi)有變化，表明金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)完全受該質(zhì)量濃度Zn@TiO2試樣的抑制；當(dāng)Zn@TiO2試樣質(zhì)量濃度小于30 mg/L 時(shí)， 試樣吸光度基本與0 mg/L 的菌液吸光度相符，因此Zn@TiO2試樣對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC 為30 mg/L。 可以看出， 在Zn@TiO2試樣質(zhì)量濃度小于30 mg/L 搖勻后渾濁， 而質(zhì)量濃度大于等于30 mg/L 搖勻后溶液較為澄清，與吸光度變化曲線一致。

2.3 最小殺菌質(zhì)量濃度測(cè)試（MBC）

為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)樣品的抑菌性能，通過(guò)平板菌液計(jì)數(shù)法來(lái)測(cè)量樣品的MBC。 步驟可具體概括為：每個(gè)樣品根據(jù)MIC 的測(cè)試結(jié)果選取接近MIC 的幾個(gè)試樣， 然后每個(gè)質(zhì)量濃度稀釋至10-6倍。 取0.1 mL 稀釋的菌液至無(wú)菌的固體培養(yǎng)基中，涂布均勻，培養(yǎng)24 h 后， 觀察菌落的生長(zhǎng)情況， 并拍照計(jì)數(shù)。Ag@TiO2試樣及Zn@TiO2試樣對(duì)大腸桿菌的MBC測(cè)試結(jié)果見(jiàn)圖9。 圖9（a）樣品質(zhì)量濃度為0、10、20、30 mg/L，圖中培養(yǎng)基1 和培養(yǎng)基2 中有菌落出現(xiàn)，表明此時(shí)大腸桿菌還沒(méi)完全被殺死； 培養(yǎng)基3 和培養(yǎng)基4 中無(wú)菌落生長(zhǎng)， 菌落數(shù)為0， 即該質(zhì)量濃度的Ag@TiO2可全部殺死大腸桿菌；Ag@TiO2對(duì)大腸桿菌的最小殺菌質(zhì)量濃度MBC 約為20 mg/L。

圖9 Ag@TiO2 與Zn@TiO2 對(duì)大腸桿菌的MBC 測(cè)試Fig. 9 MBC test of Ag@TiO2 and Zn@TiO2 against Escherichia coli

圖9（b）中培養(yǎng)基1~4 樣品質(zhì)量濃度分別為0、20、30、50 mg/L， 培養(yǎng)基1~3 均能看到菌落出現(xiàn)，表明此時(shí)大腸桿菌還沒(méi)完全被殺死；培養(yǎng)基4 中無(wú)菌落生長(zhǎng)，菌落數(shù)為0，即該質(zhì)量濃度的Zn@TiO2可全部殺死大腸桿菌。 因此，Zn@TiO2對(duì)大腸桿菌的最小殺菌質(zhì)量濃度MBC 約為50 mg/L。

同理，Ag@TiO2與Zn@TiO2試樣對(duì)金黃色葡萄球菌的MBC 測(cè)試結(jié)果見(jiàn)圖10。 圖10（a）中樣品質(zhì)量濃度分別為0、10、20、30 mg/L， 培養(yǎng)皿1~2 均能看到菌落，表明此時(shí)金黃色葡萄球菌還沒(méi)完全被殺死；培養(yǎng)皿3~4 中無(wú)菌落生長(zhǎng)，菌落數(shù)為0，即該質(zhì)量濃度的Ag@TiO2可全部殺死金黃色葡萄球菌。 因此，Ag@TiO2對(duì)金黃色葡萄球菌的最小殺菌質(zhì)量濃度MBC 約為20 mg/L。

圖10 Ag@TiO2 與Zn@TiO2 對(duì)金黃色葡萄球菌的MBC測(cè)試Fig. 10 MBC test of Ag@TiO2 and Zn@TiO2 against Staphylococcus aureus

同理，圖10（b）樣品質(zhì)量濃度分別為0、20、30、50 mg/L。 培養(yǎng)皿1~3 均能看到菌落出現(xiàn)，表明此時(shí)金黃色葡萄球菌還沒(méi)完全被殺死；培養(yǎng)皿4 中無(wú)菌落生長(zhǎng)，菌落數(shù)為0，即該質(zhì)量濃度的Zn@TiO2可完全殺死金黃色葡萄球菌。因此，Zn@TiO2試樣對(duì)金黃色葡萄球菌的最小殺菌質(zhì)量濃度MBC 為50 mg/L。

通過(guò)MIC 法和MBC 法測(cè)試可知： 金屬摻雜后細(xì)菌的MIC 和MBC 的值變小，表明抑菌能力增強(qiáng)。Ag@TiO2對(duì) 大 腸 桿 菌 的MIC、MBC 分 別 是10、20 mg/L，對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC、MBC 也分別是10、20 mg/L，比未摻雜前的納米TiO2降低了約40 mg/L，抑菌性能顯著提高，這與文獻(xiàn)[27]報(bào)道的結(jié)果基本一致。 本研究制備的Ag@TiO2對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC 和MBC 數(shù)值均變小， 表明制備的Ag@TiO2抑菌性能優(yōu)勢(shì)大，Zn@TiO2的抑菌性能次之，而Fe@TiO2的抑菌性能欠佳。 為了進(jìn)一步揭示該材料的內(nèi)部影響機(jī)制，對(duì)部分樣品進(jìn)行表征分析。

2.4 表征分析

2.4.1 BET 與紅外光譜分析 將純TiO2、Ag@TiO2、Zn@TiO2和Fe@TiO2分別進(jìn)行了BET 分析，孔結(jié)構(gòu)性質(zhì)數(shù)據(jù)列于表1。

表1 不同樣品的物理結(jié)構(gòu)性質(zhì)Table 1 Physical structure and properties of different samples

因?yàn)闃悠分蠥g、Zn、Fe 的含量非常低， 基本上不改變樣品的孔結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，但Fe@TiO2樣品中孔徑數(shù)據(jù)有變小的特征。 可能是由于含鐵的粒子引起孔道結(jié)構(gòu)的部分堵塞所致，其平均粒徑的數(shù)值也明顯增大，不利于抑菌性能的發(fā)揮。Ag@TiO2的比表面積更大，孔容更大，平均粒徑更小。

在前述的抑菌性能測(cè)試中，F(xiàn)e@TiO2的抑菌性能并未提高，故選擇Ag@TiO2和Zn@TiO2分別進(jìn)行紅外光譜表征，見(jiàn)圖11。 700~500 cm-1處的吸收峰歸屬于Ti—O—Ti 伸縮振動(dòng)；1 750~1 350 cm-1的吸收峰歸屬于表層羧基中COO—的伸縮振動(dòng)；3 600~3 000 cm-1吸收峰歸屬于—OH 的伸縮振動(dòng)。Ag@TiO2和Zn@TiO2中 均含有Ti—O—Ti、COO—和—OH， 說(shuō)明制備過(guò)程中TiO2基體上引入了大量的—COOH 和—OH 官能團(tuán)， 而金屬對(duì)應(yīng)的特征峰由于含量過(guò)低無(wú)法顯示[28]， 而表層的官能團(tuán)種類(lèi)、性質(zhì)基本一致。

圖11 Ag@TiO2 與Zn@TiO2 的紅外光譜圖Fig. 11 Infrared spectra of Ag@TiO2 and Zn@TiO2

2.4.2 X 射線衍射表征 選擇Ag@TiO2和Zn@TiO2粉末分別進(jìn)行XRD 表征分析，結(jié)果見(jiàn)圖12。 2 條曲線的輪廓十分相似，Ag@TiO2曲線在2θ 為25.3°、38.1°處出現(xiàn)的尖銳峰，歸屬于TiO2的（101）、（004）晶面；2θ 為44.3°、66.4°、77.4°處的小峰，歸屬于TiO2的（200）、（220）、（311）晶面[29]；2θ 為48.4°、56.4°處的小峰， 歸屬于銳鈦礦型TiO2的其他晶面（ICDD PDF #21-1272）。由于金屬Ag 和Zn 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)低，較好地分散鑲嵌在納米TiO2表面， 特征峰十分彌散，光譜中未明顯出現(xiàn)。

圖12 Ag@TiO2 和Zn@TiO2 的X 射線衍射圖Fig. 12 XRD spectrum of Ag@TiO2 and Zn@TiO2

Ag@TiO2樣品的抑菌性能好，是由于銳鈦礦型的納米TiO2與Ag+發(fā)生了復(fù)合， 雙重抑菌能力互相促進(jìn)有疊加，比單一的納米TiO2強(qiáng)。Zn2+與納米TiO2復(fù)合亦能提高納米TiO2的抑菌性能，但Zn2+本身沒(méi)有抑菌能力，故Zn@TiO2的抑菌能力沒(méi)有Ag@TiO2強(qiáng)。

2.4.3 掃描電子顯微鏡 （SEM） 對(duì)樣品Zn@TiO2進(jìn)行掃描電子顯微鏡測(cè)試，結(jié)果見(jiàn)圖13。

圖13 納米Zn@TiO2 的掃描電鏡圖Fig. 13 SEM images of nano-Zn@TiO2

圖13 中（a）~（d）分別為500、2 000、10 000 和20 000 倍下的電鏡形貌，觀察到納米Zn@TiO2外貌形態(tài)呈塊狀堆積。 當(dāng)放大倍數(shù)高達(dá)10 000 倍及20 000 倍時(shí)， 可看出塊狀樣品由許多細(xì)小顆粒堆積形成。 說(shuō)明樣品顆粒太小易團(tuán)聚，SEM 圖中塊狀固體表面黏附的細(xì)小顆粒，可能是Zn2+與TiO2產(chǎn)生的活性位點(diǎn)。 Zn@TiO2試樣良好的抑菌活性與納米TiO2的顆粒尺寸密切有關(guān)，這也是抑菌圈直徑大的原因[30]。細(xì)小的顆粒更容易吸附在細(xì)菌的表面，使質(zhì)量分?jǐn)?shù)較小的Zn@TiO2樣品也擁有較大的抑菌活性，但細(xì)小顆粒容易受外界影響發(fā)生脫落， 導(dǎo)致抑菌活性不穩(wěn)定。

Ag@TiO2的掃描電鏡見(jiàn)圖14。 圖14（a）~（d）分別為500、2 000、10 000 和20 000 倍下的電子掃描電鏡影像， 可看到Ag@TiO2的外貌形態(tài)呈不定型。當(dāng)放大倍數(shù)為500 倍時(shí)，可看出它是一些塊狀的固體。 隨著放大倍數(shù)的增加，粉末的形貌逐漸變?yōu)椴欢ㄐ蜕y分布，在固體表面能看到很多突起的細(xì)小顆粒?？赡苁茿g+與TiO2共同產(chǎn)生的活性位點(diǎn)，此位點(diǎn)穩(wěn)固地固定在TiO2的表層，抑菌活性穩(wěn)定持久。

圖14 納米Ag@TiO2 的掃描電鏡圖Fig.14 SEM images of nano-Ag@TiO2

Ag@TiO2試樣良好的抑菌活性與納米TiO2的顆粒尺寸密切相關(guān)，它也是Ag@TiO2抑菌片抑菌圈直徑大和持久的另一個(gè)原因。 細(xì)小的顆粒有利于Ag+的擴(kuò)散分布，抑制細(xì)菌的滋生，即使質(zhì)量分?jǐn)?shù)較小的樣品，也擁有較大的抑菌活性，抑菌性能不斷提高，因此，Ag@TiO2抑菌性能更好且持久。

當(dāng)前對(duì)TiO2的研究十分火爆，不僅在光催化和污染物的降解領(lǐng)域， 更多是利用它獨(dú)特的抑菌活性，將其與其他物質(zhì)形成薄膜材料或響應(yīng)功能材料[31-32]，在抑菌領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用。

3 結(jié) 語(yǔ)

選 擇Ag@TiO2、Zn@TiO2和Fe@TiO2為 研 究 對(duì)象，通過(guò)抑菌圈法、最小抑菌質(zhì)量濃度MIC 及最小殺菌質(zhì)量濃度MBC 進(jìn)行抑菌性能評(píng)價(jià)，通過(guò)BET、IR、XRD、SEM 等對(duì)樣品進(jìn)行表征。 得到如下結(jié)論：

1）通過(guò)抑菌圈直徑測(cè)試可知，在相同情況下抑菌性能順序?yàn)锳g@TiO2> Zn@TiO2>Fe@TiO2。 其中Zn@TiO2的抑菌性能不穩(wěn)定， 隨著時(shí)間的延長(zhǎng)容易降低；Fe@TiO2的抑菌性能提升不明顯；Ag@TiO2的抑菌性能提升明顯且持久，抑菌活性的提升在TiO2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%時(shí)更顯著。

2）MIC 和MBC 測(cè)試表明，Ag@TiO2對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC、MBC 分別均是10、20 mg/L；Zn@TiO2對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC、MBC 分別是30、50 mg/L；Ag@TiO2的抑菌性能更優(yōu)。

3）XRD 表征表明，Ag@TiO2和Zn@TiO2中TiO2為銳鈦礦型，金屬分散良好無(wú)明顯衍射峰。 SEM 表征發(fā)現(xiàn)，Zn@TiO2微觀結(jié)構(gòu)呈球形顆粒狀，Ag@TiO2微觀結(jié)構(gòu)呈不定型。Ag@TiO2試樣的抑菌性能好，歸因于銳鈦礦型TiO2與Ag+復(fù)合，雙重抑菌效果疊加。

因此，Ag@TiO2對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有很好的抑菌作用，可用于食物保鮮、醫(yī)藥消毒行業(yè)；Zn@TiO2的抑菌持久性有待改進(jìn)和優(yōu)化加強(qiáng)；Fe@TiO2的抑菌性能較差。