傅文婷,江惠華,鐘文謠,李銘臻

脆性位點(diǎn)是人類基因組中的特定染色體區(qū)域,在缺乏葉酸和胸苷的培養(yǎng)基中易形成如缺失、裂隙和無著絲粒片段等染色體異常。脆性位點(diǎn)根據(jù)其在群體中的頻率分為罕見型和普通型兩大類。罕見型脆性位點(diǎn)在人群中的發(fā)生率<5 %[1]。有學(xué)者認(rèn)為脆性位點(diǎn)是染色體正常變異,但有報(bào)道認(rèn)為脆性位點(diǎn)攜帶者的流產(chǎn)率和后代的染色體異常率增高[2]。在16號(hào)染色體上有三類脆性部位,包括對(duì)葉酸敏感的FRA16A、可用遠(yuǎn)霉素A誘導(dǎo)的FRA16B和FRA16E[3],其中FRA16B(16q22.1)最為常見。有研究認(rèn)為FRA16B與hsa-mir-328、hsa-mir-140 miRNA有關(guān)聯(lián)[4],并與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)和男性不育相關(guān)[5]。本文應(yīng)用染色體G顯帶技術(shù)和基因組拷貝數(shù)變異測(cè)序,確診1例男性fra16q22攜帶患者,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 病例資料

患者,男,37歲,身高172 cm,體重68 kg,平素體健,無既往病史。2017年結(jié)婚,性生活正常,未避孕未育。精子總數(shù)417.54百萬/mL,精子存活率41%,精子濃度102.2百萬/mL,總活力(PR+NP)百分率32.7%,正常形態(tài)10個(gè)(4.8%),異常形態(tài)197個(gè)(95.2%),頭部缺陷190個(gè)(91.8%),頸部和中段缺陷92個(gè)(44.4%),主段缺陷45個(gè)(21.7%)。臨床診斷為不育癥和畸形精子癥。內(nèi)分泌激素、Hb電泳、地中海貧血基因和致畸4項(xiàng)結(jié)果未見異常。妻子染色體核型、地中海貧血、內(nèi)分泌激素、抗子宮內(nèi)膜抗體和抗精子抗體等檢查均未見異常。

1.1 檢測(cè)方法

1.1.1 染色體G顯帶分析 采用常規(guī)染色體G顯帶核型分析技術(shù),按照《人類細(xì)胞基因組學(xué)國際命名體系》(ISCN2020)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行核型分析,計(jì)數(shù)20個(gè)分裂相,分析5個(gè)核型,如懷疑嵌合體,則加數(shù)到100個(gè)分裂相。第一次培養(yǎng)分析發(fā)現(xiàn)核型異常后,考慮脆性位點(diǎn)易受培養(yǎng)液和實(shí)驗(yàn)過程的影響,遂通知患者重新采血,用兩個(gè)不同廠家的培養(yǎng)液進(jìn)行第二次常規(guī)培養(yǎng),加大計(jì)數(shù)到131個(gè)分裂相,并分析了13個(gè)核型。

1.1.2 基因組拷貝數(shù)變異測(cè)序 將患者外周血進(jìn)行核酸提取和純化;對(duì)血液中提取的人基因組DNA酶切打斷,在其兩端添加測(cè)序接頭,再通過磁珠分選富集200～500 bp大小的文庫片段,構(gòu)建好測(cè)序文庫。利用DNA納米球技術(shù)對(duì)測(cè)序文庫進(jìn)行擴(kuò)增,形成測(cè)序模板,通過基于聯(lián)合探針錨定聚合測(cè)序技術(shù)的基因測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。利用生物信息學(xué)軟件對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,得到匹配到每條染色體上的有效序列數(shù)量,計(jì)算有效序列數(shù)量與參考數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)染色體序列數(shù)量的比值,判斷染色體非整倍體異常。

1.2 結(jié)果

(1)染色體核型分析:兩次細(xì)胞培養(yǎng),第一次核型結(jié)果為mos 46,XY,del(16)(q22)[27]/46,XY,fra(16)(q22)[16]/46,XY[39],第2次分析核型時(shí)加數(shù)到131個(gè)細(xì)胞,結(jié)果顯示mos 46,XY,del(16)(q22)[39]/46,XY,fra(16)(q22)[31]/47,XY,del(16)(q22),+chtb(16)(qter→q22)[18]/46,XY[43](見圖1),與第1次結(jié)果相比,異常細(xì)胞類型多了一種,異常細(xì)胞數(shù)目略有差別。

注:A:46,XY,del(16)(q22);B:46,XY,fra(16)(q22);C:47,XY,del(16)(q22),+chtb(16)(qter→q22);D:46,XY

(2)基因組拷貝數(shù)變異測(cè)序:依據(jù)ACMG(2019)指南[6]對(duì)所有變異進(jìn)行致病性評(píng)級(jí),將所有變異分為5類:致病性、可能致病性、臨床意義未明、可能良性和良性。根據(jù)指南共識(shí)建議進(jìn)行結(jié)果報(bào)告,報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)為染色體非整倍體、100 Kb以上已知明確致病的CNVs以及1 Mb以上的基因組缺失或重復(fù)。經(jīng)分析本例患者結(jié)果未見染色體重復(fù)和缺失(圖2,見彩插2)。

2 討論

脆性位點(diǎn)是指染色體上一些特殊的部位,和染色體上特定的區(qū)帶相關(guān),以顯性孟德爾方式遺傳。根據(jù)其在群體中的頻率分為罕見型和普通型。罕見型脆性位點(diǎn)可由富含AT的DNA配體或核苷酸類物質(zhì)誘導(dǎo),有不穩(wěn)定的三核苷酸重復(fù)序列。普通型可用阿非迪霉素誘導(dǎo),除了有數(shù)目高度可變的(TAA)重復(fù)序列外,其端粒側(cè)還有與DNA復(fù)制有關(guān)的重復(fù)Alu序列[7]。雖然脆性位點(diǎn)表達(dá)的機(jī)制仍未明確,但有研究表明,所有脆性位點(diǎn)都可能會(huì)發(fā)生延遲復(fù)制,從而使具有穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)的DNA序列在復(fù)制過程中受到阻礙,導(dǎo)致基因組未復(fù)制的區(qū)域在中期出現(xiàn)裂隙和斷裂[8]。人群中除了與臨床表型明確相關(guān)的脆性X綜合征外,脆性位點(diǎn)攜帶者通常認(rèn)為是正常變異,無臨床異常表型和生育影響[9]。但也有學(xué)者認(rèn)為,脆性位點(diǎn)能形成二級(jí)結(jié)構(gòu),這些結(jié)構(gòu)可干擾DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄等過程,導(dǎo)致配子或胎兒細(xì)胞染色體結(jié)構(gòu)發(fā)生斷裂或重排,造成流產(chǎn)、死胎等[10]。

16號(hào)染色體可不經(jīng)誘導(dǎo)在常規(guī)培養(yǎng)基中產(chǎn)生脆性[11],位于染色體16q22。fra16q22同時(shí)具有普通型和罕見型脆性位點(diǎn)的特征[12],可作為脆性位點(diǎn)的研究模型。該脆性位點(diǎn)可能與外界環(huán)境如輻射、接觸農(nóng)藥等有關(guān),所以當(dāng)臨床遇到此類患者時(shí),應(yīng)注意:① 首先詢問患者的職業(yè),排除接觸史;② 重新采血檢測(cè),用不同廠家的培養(yǎng)液平行培養(yǎng),以排除實(shí)驗(yàn)過程的因素;③ 再次檢測(cè)結(jié)果仍然異常,則需進(jìn)行基因?qū)用娴臋z測(cè),以判斷16q22斷裂點(diǎn)位置是否存在遺傳物質(zhì)的缺失。

本例患者從事財(cái)務(wù)工作,健康狀況良好。外周血淋巴細(xì)胞在未經(jīng)誘導(dǎo)的培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng),出現(xiàn)fra1622嵌合型核型,涉及染色體裂隙、斷裂、缺失等多種異常,為排除實(shí)驗(yàn)因素的影響,和患者溝通后重新抽血,用兩種不同品牌的培養(yǎng)液重新培養(yǎng),并加大了細(xì)胞計(jì)數(shù)。兩次核型結(jié)果大致相同,異常細(xì)胞數(shù)目略有差別,第二次培養(yǎng)異常細(xì)胞類型多了一種。因患者異常細(xì)胞比例超過了39%,考慮其為真性嵌合。臨床工作中要重視細(xì)胞計(jì)數(shù),當(dāng)遇到可疑脆性位點(diǎn)核型時(shí),為避免漏檢,至少需計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞[13]。由于α-珠蛋白鏈基因位于16號(hào)染色體,為排除α-珠蛋白鏈異常,同時(shí)進(jìn)行了血紅蛋白(Hb)電泳和地中海貧血基因檢測(cè),患者結(jié)果均未見異常。

在健康人群中,16q22區(qū)域的脆性位點(diǎn)普遍認(rèn)為是正常變異,不與特定的臨床病征相關(guān)。但有研究者認(rèn)為,盡管16q22脆性位點(diǎn)沒有表型效應(yīng),但它可能與不育、自然流產(chǎn)、雙側(cè)隱睪癥、嚴(yán)重少精子癥等有關(guān)[14]。本例患者的精子亦存在異常,其精子異常形態(tài)197個(gè)(95.2%),頭部缺陷190個(gè)(91.8%),頸部和中段缺陷92個(gè)(44.4%),主段缺陷45個(gè)(21.7%),臨床診斷為畸形精子癥。Aswini等[15]報(bào)道了1例復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的罕見病例,夫婦雙方都是fra16(q22)脆性位點(diǎn)攜帶者。Martorell等[16]報(bào)道了1對(duì)不育夫婦,男方外周血存在fra16q22.1,精液FISH(熒光原位雜交)發(fā)現(xiàn)98.6%的精子正常,異常包括16p重復(fù)(0.19%)、16p(0.39%)和16q(0.59%)的缺失。進(jìn)一步對(duì)患者的胚胎通過胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)(PGT),發(fā)現(xiàn)有2枚胚胎異常,分別為16p部分單體和16q部分三體,提示fra16q22.1的存在可能會(huì)增加后代染色體異常和自然流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)。

根據(jù)患者的檢測(cè)結(jié)果及文獻(xiàn)復(fù)習(xí),考慮本例患者的不育可能跟16q22脆性位點(diǎn)有關(guān)。鑒于患者婚后3年不育,且染色體存在較高比例的fra16q22,較易形成核型異常的胚胎,為降低自然流產(chǎn)和生育異常后代的風(fēng)險(xiǎn),建議患者行體外受精(IVF)獲得胚胎,并進(jìn)行PGT。越來越多研究表明脆性位點(diǎn)與腫瘤的發(fā)生有關(guān)[17],故建議患者定期檢查健康狀況。患者于2021年4月在本地醫(yī)院行體外受精和PGT,經(jīng)兩次移植順利妊娠單胎。胎兒孕期檢查和羊水染色體核型均正常,足月順產(chǎn)一男嬰。隨訪至今嬰兒發(fā)育正常,患者亦無異常表現(xiàn)。

綜上所述, fra16q22攜帶者的臨床表型異質(zhì)性較強(qiáng),16q22脆性位點(diǎn)的重要性尚未得到充分評(píng)估,明確脆性位點(diǎn)不穩(wěn)定性的機(jī)理和基因的表達(dá)調(diào)控,以及脆性位點(diǎn)與疾病之間的關(guān)系,可以為患者后續(xù)的精準(zhǔn)治療和產(chǎn)前診斷提供線索,同時(shí)可進(jìn)行優(yōu)生優(yōu)育和提高人口素質(zhì)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突。