徐?；?林冠,孫蓬明

異位妊娠是婦產(chǎn)科常見(jiàn)的急腹癥,也是早期妊娠相關(guān)死亡的最常見(jiàn)原因。異位妊娠中95%為輸卵管妊娠[1],其中以輸卵管壺腹部妊娠最多見(jiàn)。目前對(duì)于輸卵管妊娠的發(fā)病機(jī)制仍不明確,多數(shù)學(xué)者認(rèn)為輸卵管炎癥是其主要病因。Toll樣受體(Toll like receptor,TLR)是一類進(jìn)化保守的膜式識(shí)別受體,TLR分子主要表達(dá)于固有免疫細(xì)胞(如單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞)和與外界環(huán)境直接接觸的機(jī)體上皮細(xì)胞(如皮膚、胃腸道、呼吸道、泌尿生殖道等)上,為宿主防御微生物的第一道免疫防線。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)TLR分子與炎癥密切相關(guān),目前在TLR分子家族中,對(duì)TLR-2和TLR-4的研究最多;但TLR-2在妊娠狀態(tài)下的輸卵管中的表達(dá)情況研究報(bào)道甚少。有研究表明TLR異常表達(dá)及其誘導(dǎo)產(chǎn)生的炎癥因子可能參與了輸卵管妊娠的發(fā)病[2-3]。本文通過(guò)檢測(cè)輸卵管壺腹部妊娠和宮內(nèi)足月妊娠不同部位的輸卵管組織TLR-2 mRNA表達(dá)水平、外周血血清腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的濃度,探討TLR-2、TNF-α與輸卵管妊娠的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年10月至2018年3月福建省婦幼保健院收治的30例輸卵管壺腹部妊娠的患者為輸卵管妊娠組,該組病例術(shù)前未進(jìn)行藥物保守治療,術(shù)后病理證實(shí)為輸卵管壺腹部妊娠。另選同期30例足月妊娠無(wú)合并癥的孕婦作為宮內(nèi)妊娠組,入院剖宮產(chǎn)的同時(shí)要求行輸卵管結(jié)扎,肉眼外觀正常輸卵管。所選研究對(duì)象均為自然受孕,手術(shù)前3個(gè)月內(nèi)均未使用激素、抗生素治療,患者簽署知情同意書(shū)。研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 儀器與試劑

TNF-αELISA試劑盒(北京義翹神州公司),酶標(biāo)分析儀RT-6100(深圳雷杜生命科學(xué)公司),Trizol 試劑 (美國(guó)Ambion公司),電動(dòng)組織研磨器(北京天根生化科技公司),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Promega公司)、熒光定量PCR試劑盒(日本 Ta Ka Ra 公司),熒光定量 PCR 儀 LightCycler 480 II(瑞士 roche 公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 血清TNF-α濃度檢測(cè) 研究對(duì)象入院時(shí)抽外周靜脈血2 mL置入EDTA抗凝紫色頭蓋管,將所收集血液置于低速離心機(jī)1 000 g,離心20 min,移除懸浮顆粒并吸取分離所得血清,立即進(jìn)行分析或者將樣本分裝置于-20℃儲(chǔ)存。采用 ELISA 法檢測(cè)血清TNF-α的濃度,在ELISA檢測(cè)儀上于450 nm處,以空白對(duì)照調(diào)零后測(cè)各孔的 OD值,進(jìn)而換算出TNF-α濃度。

1.3.2 采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)TLR-2 mRNA表達(dá) 通過(guò)手術(shù)采集輸卵管壺腹部妊娠組的輸卵管分為胚胎種植部位組(在妊娠包塊5 mm以內(nèi)的區(qū)域,去除胚胎組織,為輸卵管壺腹部)和胚胎非種植部位組(為輸卵管峽部);宮內(nèi)妊娠組為輸卵管結(jié)扎部位(為輸卵管峽部)。根據(jù) Pub Med Gene Bank 提供的GAPDH、TLR-2 基因序列,并使用 Primer-Blast進(jìn)行引物設(shè)計(jì),由上海鉑尚生物合成,序列如下:TLR-2(144bp)上游:5’-GCCTCTCCAAGGAAGAATCC-3’;下游:5’-TCCTGTTGTTGGACAGGTCA-3’;GAPDH(138bp)上游:5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’;下游:5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’。實(shí)時(shí)定量熒光PCR:根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格進(jìn)行操作:① 提取組織總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA;② 應(yīng)用Cobas Z480熒光定量PCR擴(kuò)增儀對(duì)TLR-2 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè);③ 采用 2-ΔΔct法計(jì)算各組目的基因表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0處理數(shù)據(jù),計(jì)量資料以M(P25,P75)表示,組間比較采用Mann-Whitney U秩和檢驗(yàn),多組間比較采用Kruskal-Wallish H秩和檢驗(yàn),P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較

兩組年齡、妊娠次數(shù)、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),詳見(jiàn)表 1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 兩組TLR-2 mRNA和TNF-α表達(dá)情況比較

輸卵管妊娠組(胚胎種植部位與非種植部位合為輸卵管妊娠組)TLR-2 mRNA的表達(dá)水平及TNF-α的濃度均高于宮內(nèi)妊娠組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),詳見(jiàn)表2。

2.3 TLR-2 mRNA在不同輸卵管組織中的表達(dá)情況比較

將輸卵管組織分為宮內(nèi)妊娠組、輸卵管妊娠胚胎種植部位組、輸卵管妊娠胚胎非種植部位組,各30例樣本。輸卵管妊娠胚胎種植部位組的TLR-2 mRNA表達(dá)最低,輸卵管妊娠非種植部位表達(dá)最高,其中兩兩比較結(jié)果詳見(jiàn)表3。

表3 TLR-2mRNA在不同輸卵管組織中的表達(dá)情況比較

3 討論

TLR-2主要表達(dá)在上生殖道(子宮內(nèi)膜和輸卵管),而下生殖道卻很少發(fā)現(xiàn)(宮頸外口和陰道),這種表達(dá)模式利于最大程度地降低對(duì)富有寄生菌的下生殖道的免疫反應(yīng),同時(shí)又能有效識(shí)別侵入上生殖道的病原體,從而起到有效的免疫防御作用[4]。當(dāng)病原體入侵感染輸卵管,輸卵管TLR-2的表達(dá)增強(qiáng),TLR-2通過(guò)膜式識(shí)別受體對(duì)其相應(yīng)的病原體相關(guān)分子進(jìn)行識(shí)別、結(jié)合,TIR結(jié)構(gòu)域(Toll/IL-1 receptor homologue region)向胞內(nèi)傳遞信號(hào),啟動(dòng)核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)轉(zhuǎn)錄因子,誘導(dǎo)IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α等多種炎癥細(xì)胞因子表達(dá),啟動(dòng)免疫反應(yīng)參與抗感染[5]。生理水平的TNF-α可以平衡滋養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育,在胚胎正常發(fā)育過(guò)程中不可或缺;通過(guò)影響細(xì)胞凋亡來(lái)維持胎盤(pán)組織細(xì)胞穩(wěn)態(tài);高于生理含量的TNF-α則可能刺激一些有害物質(zhì)的生成,干擾孕卵游走,使其著床于管壁,導(dǎo)致輸卵管妊娠[6]。

本研究中,與宮內(nèi)妊娠組相比,輸卵管妊娠組的血清TNF-α濃度更高。TLR-2 mRNA在輸卵管妊娠胚胎種植部位中表達(dá)最低,宮內(nèi)妊娠組次之,輸卵管妊娠非種植部位最高;這種結(jié)果可能是受病原體感染的輸卵管產(chǎn)生免疫損傷所致。Huggins等[7]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)當(dāng)微生物暴露后,TLR通過(guò)炎癥信號(hào)將T細(xì)胞募集到感染部位,增強(qiáng)了適應(yīng)性免疫反應(yīng);但免疫反應(yīng)是一把“雙刃劍”,免疫反應(yīng)過(guò)度會(huì)導(dǎo)致免疫損傷。張紅霞等[8]發(fā)現(xiàn)TLR-2蛋白在輕度病變的輸卵管黏膜中表達(dá)增高,而在積水的輸卵管中的表達(dá)下降;可能處于初次感染的階段時(shí),輸卵管TLR-2蛋白的表達(dá)上調(diào),它通過(guò)啟動(dòng)相關(guān)通路激發(fā)各種免疫細(xì)胞分泌炎癥因子來(lái)參與病原體清除,保持輸卵管黏膜上皮的完整性,從而使輸卵管正?；騼H為黏膜炎癥;但當(dāng)TLR-2介導(dǎo)的局部炎癥反應(yīng)過(guò)強(qiáng),則誘發(fā)組織損傷,受損后輸卵管上皮的TLR-2蛋白表達(dá)減少。推測(cè)TLR-2 mRNA在宮內(nèi)妊娠組中是妊娠狀態(tài)下的基礎(chǔ)表達(dá),而在輸卵管妊娠組的胚胎種植部位為免疫過(guò)度反應(yīng)導(dǎo)致了低表達(dá),非種植部位是免疫反應(yīng)后的高表達(dá)。

且TLR-2 mRNA在輸卵管胚胎種植部位中表達(dá)最低,非種植部位的表達(dá)最高,可能存在可溶性TLR-2蛋白的免疫負(fù)反饋?zhàn)饔谩Ｑ芯堪l(fā)現(xiàn)在胚胎種植部位的輸卵管管腔中發(fā)現(xiàn)可溶形式的顆粒狀TLR-2蛋白,其對(duì)輸卵管黏膜上的TLR-2 mRNA表達(dá)有負(fù)反饋?zhàn)饔?抑制了黏膜上TLR-2 mRNA的表達(dá)[2]。可溶形式的TLR-2蛋白在感染和炎性疾病期間濃度會(huì)增加,并從組織和血細(xì)胞釋放到循環(huán)系統(tǒng)中[9],它可通過(guò)隔離病原體來(lái)降低免疫激活[10]。

目前多數(shù)輸卵管TLR-2表達(dá)情況的研究是在輸卵管妊娠與因良性疾病切除的輸卵管比較[2],或是炎癥感染的輸卵管與正常輸卵管組織相比[3,8,11],沒(méi)有同在妊娠狀態(tài)或輸卵管不同部位TLR-2表達(dá)的報(bào)道。而本研究通過(guò)檢測(cè)宮內(nèi)足月妊娠的輸卵管峽部及輸卵管壺腹部妊娠的輸卵管峽部、壺腹部的TLR-2 mRNA的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)輸卵管TLR-2 mRNA、外周血血清TNF-α與輸卵管妊娠相關(guān)。本研究樣本量較少,且早孕與晚孕激素水平的不同也可能影響輸卵管TLR-2 mRNA的表達(dá),將來(lái)應(yīng)通過(guò)擴(kuò)大樣本量及加做免疫組化實(shí)驗(yàn)等進(jìn)一步探究TLR-2與輸卵管妊娠的關(guān)系。有學(xué)者指出TLR-2介導(dǎo)的炎癥信號(hào)傳導(dǎo)和超敏反應(yīng)的特異性阻斷策略可能會(huì)提供新穎的治療策略來(lái)預(yù)防多種疾病[12],將來(lái)通過(guò)對(duì)輸卵管妊娠患者血清中TNF-α及可溶形式的TLR-2蛋白或輸卵管組織中的TLR-2蛋白表達(dá)等的進(jìn)一步深入研究,有望助力于輸卵管妊娠的早期診斷及臨床治療。