王思茹，楊娉婷

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 1. 附屬盛京醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，沈陽(yáng) 110004； 2. 附屬第一醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，沈陽(yáng) 110001）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡 （systemic lupus erythematosus，SLE） 是以產(chǎn)生自身免疫性抗體以及免疫復(fù)合物為特點(diǎn)的慢性、炎癥性自身免疫性疾?。?］。免疫復(fù)合物沉積激活了經(jīng)典補(bǔ)體通路，導(dǎo)致了自身炎癥和多系統(tǒng)的損傷。SLE病因比較復(fù)雜，目前其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。已有研究［2］表明，免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)共同調(diào)控炎癥的發(fā)生和發(fā)展。近年來(lái)迷走神經(jīng)介導(dǎo)的“膽堿抗炎通路”受到廣泛關(guān)注［3］。作為免疫的核心細(xì)胞，T細(xì)胞表達(dá)大部分膽堿能系統(tǒng)的組成成分，包括膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶、乙酰膽堿酯酶受體以及毒蕈堿型和煙堿型乙酰膽堿受體 （muscarinic acetylcholine receptors，mAChRs；nicotinic acetylcholine receptors，nAChRs）。在乙酰膽堿酯酶受體中，免疫細(xì)胞表達(dá)mAChRs 5 個(gè)亞型 （M1～M5） 和nAChRs中的α2、α4、α5、α6、α7、 α9、α10 亞型［4］。

nAChRs廣泛表達(dá)，是乙酰膽堿門(mén)控離子通道，具有不同的性質(zhì)和功能［5］。在神經(jīng)肌肉連接處和自主神經(jīng)節(jié)中，nAChRs介導(dǎo)興奮性突觸傳遞；而在中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元中，nAChRs主要起調(diào)節(jié)作用。nAChRs也在非興奮性細(xì)胞中表達(dá)，影響細(xì)胞分化和增殖［6］。α7煙堿型乙酰膽堿受體 （α7 nicotinic acetylcholine receptor，α7nAChR） 在非興奮細(xì)胞中的作用體現(xiàn)在膽堿能抗炎途徑中。免疫細(xì)胞中α7nAChR表達(dá)，通過(guò)迷走神經(jīng)的傳出神經(jīng)抑制炎癥［5］。在炎癥發(fā)展過(guò)程中，外周細(xì)胞因子激活迷走神經(jīng)的傳入纖維，使迷走神經(jīng)遠(yuǎn)端釋放乙酰膽堿；乙酰膽堿激活α7nAChR，進(jìn)而參與調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥反應(yīng)［7］。

FUJII等［8］研究提示T細(xì)胞表面α7nAChR參與慢性炎癥的免疫調(diào)節(jié)及 輔助T細(xì)胞 （T helper cell，Th） 分化，α7nAChR與腎臟慢性炎癥和腎臟損傷相關(guān)。SLE患者外周血中乙酰膽堿水平低且不穩(wěn)定，乙酰膽堿受體表達(dá)水平也相對(duì)較低，因此，檢測(cè)乙酰膽堿受體mRNA表達(dá)是目前常用的方法［8］。關(guān)于SLE患者外周血T細(xì)胞α7nAChRsmRNA水平的研究目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究探討SLE患者外周血中CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞α7nAChRmRNA的表達(dá)情況及臨床意義，旨在為SLE的發(fā)病機(jī)制及治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取2019 年 7 月至12 月中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院風(fēng)濕免疫科住院的16例女性SLE患者為SLE組。下載患者電子病歷收集一般臨床資料 （年齡、性別、病程和主要癥狀） 和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo) ［血常規(guī)、尿常規(guī)、肝腎功能、24 h尿蛋白定量、紅細(xì)胞沉降率 （erythrocyte sedimentation rate，ESR）、 C反應(yīng)蛋白 （C-reactive protein，CRP）、免疫球蛋白 （IgA、IgG、IgM）、補(bǔ)體 （complement，C） 3、C4、細(xì)胞因子和T細(xì)胞亞群、SLE疾病活動(dòng)指數(shù) （systemic lupus erythematosus disaease activity index，SLEDAI） ］。

納入標(biāo)準(zhǔn)：符合歐洲風(fēng)濕病聯(lián)盟 （EULAR） 和美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì) （ACR） 的SLE分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)［9］。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1） 原發(fā)性腎臟疾病、腎血管畸形；（2） 糖尿病、心腦血管疾病、惡性腫瘤、腦梗死、病毒性肝炎、肝硬化、血液病及其他嚴(yán)重疾?。唬?） 并發(fā)感染。選取 16 例年齡相匹配的女性健康志愿者作為對(duì)照組 （NC組）。本研究獲得中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 外周血單個(gè)核細(xì)胞 （peripheral blood mononuclear cell，PBMC） 分離

采集患者早晨空腹肘靜脈血 （5 mL）。采用Ficoll-PaqueTMPLUS （美國(guó)Amersham Biosciences公司） 以梯度離心法從5 mL乙二胺四乙酸 （ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA） -新鮮抗凝全血中分離獲得PBMC。

1.3 CD4+ T和CD8+ T細(xì)胞分選

以等體積磷酸鹽緩沖液 （phosphate buffer saline，PBS） 重懸PBMC，PBS和PBMC按1 ∶1混合，共230g。 25 ℃下220g離心8 min，離心后取上清液，重復(fù)上述操作。然后使用人CD4 MicroBeads、人CD8 MicroBeads （德國(guó)Miltenyi Biotec公司）按照試劑說(shuō)明書(shū)分選并獲得CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞。

1.4 實(shí)時(shí)PCR （real time PCR，RT-PCR） 檢測(cè)CD4+T細(xì)胞、CD8+ T細(xì)胞中α7nAChR mRNA表達(dá)

使用Axyprep? Multisource Total RNA Miniprep Kit （#AP-MN-MS-RNA-50，美國(guó)Axygen公司） 試劑盒分別從CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞中提取RNA 。使用Primescript? RT reagent Kit with gDNA Eraser（#RR047A，大連TaKaRa公司） 試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。RT-PCR采用TB Green? Premix EX Taq?Ⅱ （#RR820A，大連TaKaRa公司） 試劑盒，引物系列：α7nAChR，正向5’-CCGACGGGGGCAAGATGC-3；反向5’-GGCCGCGGAAGCCGATGTAC-3’。GAPDH，正向5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAACC-3；反向5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’。

實(shí)驗(yàn)前對(duì)引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，1.5%瓊脂糖凝膠電泳可以得到擴(kuò)增后的單一片段。RT-PCR反應(yīng)體系為20 μL，TB Green qPCR Master Mix 12.5 μL，正向、反向引物各1 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 3.5 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min，然后95 ℃溶解15 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共39個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用±s表示；偏態(tài)分布的計(jì)量資料采用M（P25～P75） 表示，對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化后數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布。2組間CD4+T細(xì)胞和 CD8+T細(xì)胞α7nAchRmRNA表達(dá)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。α7nAchRmRNA表達(dá)與各臨床指標(biāo)的關(guān)系采用Pearson或Spearman相關(guān)分析。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

SLE組年齡 （33.42±14.60） 歲，NC組年齡 （25.33±5.66） 歲，2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞ 0.05）。SLE組患者各項(xiàng)臨床指標(biāo)見(jiàn)表1。

表1 SLE組患者各項(xiàng)臨床指標(biāo)Tab.1 Clinical indicators in the SLE group

2.1 2組外周血中CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞α7nAChR mRNA的表達(dá)比較

結(jié)果顯示，SLE組患者外周血中CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞α7nAChRmRNA表達(dá)分別為0.50±0.27、0.83±0.58；NC組CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞α7nAChRmRNA表達(dá)分別為1.02±0.49、1.83±0.46，SLE組均顯著低于NC組 （P分別為0.005、0.001）。

2.2 SLE患者外周血中CD4+ T細(xì)胞和CD8+ T細(xì)胞α7nAChR mRNA的表達(dá)與各項(xiàng)臨床指標(biāo)的相關(guān)分析

結(jié)果顯示，SLE患者CD4+T細(xì)胞α7nAChRmRNA表達(dá)與SLEDAI （r= -0.605，P= 0.03） 血清IgG （r=-0.637，P= 0.035） 和CRP （r= -0.611，P= 0.034） 水平顯著負(fù)相關(guān)。見(jiàn)表2。

表2 SLE患者CD4+ T細(xì)胞和 CD8+ T細(xì)胞α7nAChR mRNA水平與各項(xiàng)臨床指標(biāo)的相關(guān)分析結(jié)果Tab.2 Correlation analysis of α7nAChR mRNA levels in CD4+ and CD8+ T cells with various clinical indicators in patients with SLE

3 討論

膽堿能抗炎途徑是一種免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)機(jī)制，取決于自主神經(jīng)系統(tǒng)，是由迷走神經(jīng)、乙酰膽堿及其受體等組成的經(jīng)典神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)通路，也稱(chēng)為抗炎反射［10］。膽堿能抗炎途徑可激活調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，通過(guò)抑制細(xì)胞增殖分化和細(xì)胞因子釋放發(fā)揮抗炎作用［11-12］。在敗血癥、結(jié)腸炎和心肌缺血性損傷模型中，增加副交感神經(jīng)張力可以抑制細(xì)胞因子釋放、減輕組織損傷并改善炎癥介導(dǎo)的損傷［13］。

膽堿能神經(jīng)元可以抑制急性炎癥，迷走神經(jīng)刺激在多種炎癥介導(dǎo)疾病模型中具備有益作用［14］。膽堿能抗炎途徑的核心成分是α7nAChR。研究［14］顯示，在α7-/-小鼠分離的巨噬細(xì)胞中，尼古丁對(duì)腫瘤壞死因子-α （tumor necrosis factor alpha，TNF-α） 產(chǎn)生的抑制作用減弱。同樣，迷走神經(jīng)刺激降低血清TNF-α水平。

既往研究［15］闡明a7nAChR對(duì)T細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞 （antigen-presenting cells，APCs） 具有特異性功能，a7nAChR通過(guò)抑制抗原加工而干擾抗原遞呈，從而抑制CD4+T細(xì)胞活化；CD4+T細(xì)胞a7nAChR促進(jìn)Treg和效應(yīng)T細(xì)胞的發(fā)育。a7nAChR對(duì)APCs和T細(xì)胞的不同功能可能與免疫應(yīng)答強(qiáng)度的調(diào)節(jié)有關(guān)［16］。核因子κB （nuclear factor κB，NF-κB） 是炎癥反應(yīng)中不可代替的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子，NF-κB可與多種調(diào)控基因的啟動(dòng)子結(jié)合并活化，調(diào)控炎癥反應(yīng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)大量炎性細(xì)胞因子的表達(dá)［17-18］。CHRNA7是α7nAChR的編碼基因，大量表達(dá)于免疫細(xì)胞及線(xiàn)粒體表面［19］。α7nAChR與乙酰膽堿特異性結(jié)合后可激活下游信號(hào)因子，抑制NF-κB信號(hào)通路激活，使炎癥介質(zhì)合成下調(diào)來(lái)發(fā)揮抗炎作用［20］。

既往研究［21］證實(shí)了脾膽堿能信號(hào)在促進(jìn)自身反應(yīng)性B細(xì)胞生成和SLE發(fā)生發(fā)展中起重要作用。通過(guò)中和乙酰膽堿能遞質(zhì)或拮抗膽堿能受體來(lái)抑制膽堿能信號(hào)傳導(dǎo)可能是使體內(nèi)B細(xì)胞代謝正?；臋C(jī)制，并可作為SLE患者的治療藥物靶點(diǎn)。FAIRLEY等［22］研究發(fā)現(xiàn)SLE狼瘡小鼠膽堿抗炎通路受到抑制，刺激膽堿抗炎通路可以使炎癥反應(yīng)減弱，從而保護(hù)腎臟。此外，SLE部分患者還會(huì)表現(xiàn)自主神經(jīng)病變［22］，這些均提示迷走神經(jīng)低活性和膽堿抗炎通路受損參與了SLE的發(fā)生和發(fā)展。

已有研究［22-23］表明，免疫T細(xì)胞表面高度表達(dá)乙酰膽堿受體，其中α7nAChR受體與膽堿抗炎通路顯著相關(guān)；研究還發(fā)現(xiàn)尼古丁體外作用于α7 缺陷小鼠的CD4+T細(xì)胞，能抑制CD4+T細(xì)胞對(duì)外來(lái)抗原的應(yīng)答，下調(diào)T細(xì)胞的自身增殖，降低Th1 細(xì)胞的免疫應(yīng)答，從而下調(diào)TNF-α和INF-γ的表達(dá)，并降低Th17細(xì)胞的免疫應(yīng)答，下調(diào)IL-17、 IL-21、 IL-22 分泌，從而提升膽堿抗炎通路的活性。提示α7nAChR參與免疫調(diào)節(jié)，α7nAChR拮抗劑 （尼古丁等） 有望成為免疫系統(tǒng)疾病的有效治療靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，SLE組外周血CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞α7nAChRmRNA表達(dá)較NC組顯著降低 （均P＜ 0.05）。SLE患者外周血CD4+T細(xì)胞α7nAChRmRNA表達(dá)與SLEDAI、血清IgG和CRP水平呈顯著負(fù)相關(guān) （均P＜ 0.05）。提示SLE患者外周血中CD4+T細(xì)胞表面α7nAChR可能參與了SLE的發(fā)生發(fā)展，因此α7nAChR可以作為判定SLE疾病活動(dòng)的臨床新指標(biāo)，與以往研究結(jié)果一致。

綜上所述，SLE患者外周血CD4+T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞表面α7nAChRmRNA與正常人相比顯著降低，其水平與SLEDAI、IgG、CRP水平顯著負(fù)相關(guān)。本研究為進(jìn)一步明確 SLE發(fā)病中的具體機(jī)制及臨床工作中病情活動(dòng)評(píng)價(jià)提供了依據(jù)。今后將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，同時(shí)按照器官受累情況進(jìn)一步分組，深入探討α7nAChRmRNA表達(dá)在SLE患者中的臨床意義。