蔣磊，李玉強(qiáng)，李男，吳彬，趙碩

（錦州醫(yī)科大學(xué) 1. 附屬第一醫(yī)院普外科，遼寧 錦州 121001； 2. 附屬第一醫(yī)院臨床生物樣本中心，遼寧 錦州 121001； 3. 附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，遼寧 錦州 121001； 4. 附屬第三醫(yī)院護(hù)理部，遼寧 錦州 121000）

肝細(xì)胞癌 （以下簡(jiǎn)稱肝癌） 是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，其發(fā)生、發(fā)展與腫瘤微環(huán)境密不可分［1］，而缺氧是一個(gè)重要的微環(huán)境特征［2］。在缺氧微環(huán)境中，肝癌細(xì)胞不僅可以改變自身的代謝方式，還可以與微環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換，進(jìn)而重塑腫瘤微環(huán)境。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中的重要組成成分［3］。巨噬細(xì)胞可以分為2種表型，即經(jīng)典激活型（M1） 和替代激活型 （M2）。目前研究［4］認(rèn)為，M1型巨噬細(xì)胞參與腫瘤發(fā)生的早期階段，而M2型巨噬細(xì)胞具有促進(jìn)腫瘤免疫逃逸等利于腫瘤發(fā)展的特性。然而，腫瘤細(xì)胞和巨噬細(xì)胞之間的相互作用機(jī)制尚未完全闡明。目前，外泌體在腫瘤細(xì)胞與巨噬細(xì)胞之間的交互作用受到廣泛關(guān)注。

外泌體是直徑為30～100 nm的細(xì)胞外囊泡［5］。外泌體含有各種生物活性分子，包括DNA、mRNA和非編碼RNA［6］。在缺氧條件下，腫瘤細(xì)胞可以釋放富含微RNA （microRNA，miRNA） 的外泌體到腫瘤微環(huán)境中，對(duì)腫瘤微環(huán)境發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。近年來，miRNA在腫瘤中的功能受到越來越多的關(guān)注。研究［7］表明，miR-432-5p 通過CXCL5抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。還有研究［8］發(fā)現(xiàn)，外泌體中的miR-432-5p介導(dǎo)了相鄰細(xì)胞群體間的耐藥表型轉(zhuǎn)移。然而，腫瘤細(xì)胞釋放的富含miR-432-5p的外泌體是否調(diào)節(jié)了缺氧微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞極化，目前尚不清楚。

探索腫瘤微環(huán)境中M2型巨噬細(xì)胞極化的機(jī)制，已成為腫瘤免疫治療的重要研究方向［9］。因此，本研究探討了巨噬細(xì)胞在缺氧微環(huán)境下的極化和機(jī)制，旨在為肝癌的免疫治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織樣本：收集2016年6月至2020年6月于錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院診斷為肝細(xì)胞癌的25例患者的樣本組織，所有患者術(shù)前均未行放化療。所有患者均有完整的臨床資料，本研究通過錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)部審查和倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 細(xì)胞：THP-1人單核細(xì)胞系，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。將THP-1細(xì)胞加入添加10%胎牛血清和1%抗生素 （青霉素和鏈霉素混合雙抗） 的RPMI 1640培養(yǎng)基 （美國(guó)Gibco公司） 中后，放入37 ℃、含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將3×105個(gè)THP-1細(xì)胞加入孔徑為0.4 μm的濾網(wǎng)中，用200 nmol/L 12-肉豆蔻酸-13-酰丙酸 （美國(guó)Sigma-Aldrich公司） 處理24 h，以生成巨噬細(xì)胞。使用非接觸式共培養(yǎng)Transwell系統(tǒng) （美國(guó)Corning公司） 共培養(yǎng)肝癌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。收集肝癌細(xì)胞或腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)分析。2種肝癌細(xì)胞系Huh7和HepG2，購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。Huh7和HepG2均在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基 （美國(guó)Corning公司） 中培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 Western blotting：使用RIPA裂解緩沖液 （上海碧云天生物技術(shù)有限公司） 裂解細(xì)胞。蛋白樣品經(jīng)12% SDS-PAGE凝膠分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。PVDF膜在室溫下用5%牛血清白蛋白封閉2 h，然后與相應(yīng)一抗4 ℃孵育過夜。一抗包括TSG101 （1 ∶1 000，美國(guó)Proteintech公司）、CD63 （1 ∶1 000，美國(guó)GeneTex公司）、CD81 （1 ∶1 000，中國(guó) ABclonal公司）、ALIX（1 ∶1 000，美國(guó)CST公司）、SOSC3 （1 ∶1 000，美國(guó)CST公司）、STAT3 （1 ∶1 000，美國(guó)CST公司）、p-STAT3（1 ∶1 000，美國(guó)CST公司）、actin （1 ∶1 000，美國(guó)Proteintech公司）。TBST清洗后，使用辣根過氧化物酶結(jié)合的二抗室溫孵育2 h，TBST再次清洗后進(jìn)行發(fā)光。

1.2.2 免疫熒光染色：4%甲醛固定細(xì)胞爬片15 min，使用含0.2% Triton X-100的PBS洗滌固定的細(xì)胞，然后用1%牛血清白蛋白封閉，4 ℃下與一抗孵育過夜。一抗包括CD63 （1 ∶150，美國(guó)Abcam公司）、CD163 （1 ∶150，美國(guó)Abcam公司）、CD206 （1 ∶200，美國(guó)Abcam公司）。細(xì)胞用PBS洗滌3次，然后孵育二抗，二抗包括Alexa Fluor 594羊抗兔IgG （1 ∶500，美國(guó)Life Technologies公司）、Alexa Fluor 488羊抗小鼠IgG （1 ∶500，美國(guó)Life Technologies公司）。再用PBS洗滌3次，用DAPI染色細(xì)胞核，Nikon A1R共聚焦顯微鏡 （日本尼康公司） 下觀察。

1.2.3 外泌體的分離：肝癌細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，收集條件培養(yǎng)基并以1 000g離心，使細(xì)胞沉淀。上清液用0.22 μm過濾器過濾，100 000g離心90 min，PBS 清洗1次后，再次100 000g離心90 min。使用Hitachi H7605透射電子顯微鏡 （日本日立公司） 觀察外泌體。

1.2.4 人CD3+T細(xì)胞的分離和培養(yǎng)：使用FACSAria Fusion從健康個(gè)體的外周血中分離出CD3+T細(xì)胞。使用抗CD3單克隆抗體、抗CD28 單克隆抗體和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1刺激分選的CD3+T細(xì)胞，在RPMI 1640培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清和150 IU/mL重組人白細(xì)胞介素 （interleukin，IL） -2 （中國(guó)Novoprotein公司） 進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)：CD11b、CD11c、主要組織相容性復(fù)合體 （major histocompatibility complex，MHC） -Ⅱ、CD3、CD206和CD163抗體，均購(gòu)自美國(guó)BD公司。在4 ℃下，肝癌細(xì)胞被分離成單細(xì)胞懸液，洗滌并在含2 mmol/L EDTA和1%牛血清白蛋白的單克隆抗體或相應(yīng)的同型對(duì)照物中孵育30 min。異硫氰酸熒光素標(biāo)記單克隆抗體，使用Cell Quest軟件 （美國(guó)BD公司）計(jì)算結(jié)果。

1.2.6 實(shí)時(shí)定量PCR （real-time quantitative PCR，qRTPCR）：使用TRIzol （美國(guó) Thermo Scientific公司） 提取總RNA。應(yīng)用PrimeScript RT試劑盒將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，qRT-PCR采用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒 （日本 TaKaRa公司） 和ABI7500系統(tǒng) （美國(guó)Applied Biosystems公司）。以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCt方法計(jì)算基因表達(dá)水平。每個(gè)樣品均重復(fù)進(jìn)行3次檢測(cè)。

1.2.7 免疫組織化學(xué)染色：標(biāo)本蠟塊做4 μm連續(xù)切片，用二甲苯和乙醇脫蠟處理。PBS洗片后，用羊血清工作液封閉30 min，分別加入抗體缺氧誘導(dǎo)因子 （hypoxia inducible factor，HIF） -1α （1 ∶600，美國(guó)CST公司） 和抗CD206 （1 ∶600，美國(guó) CST公司） 37℃孵育45 min。生物素標(biāo)記的二抗37 ℃孵育40 min，PBS洗片后DAB顯色，蘇木精復(fù)染，組織透明，樹膠封片。以0.01 mol/L PBS代替一抗，作為陰性對(duì)照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 22.0軟件和GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有實(shí)驗(yàn)均至少重復(fù)3次。計(jì)量資料用±s表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 缺氧促進(jìn)肝癌細(xì)胞分泌外泌體并促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化

透射電鏡下觀察肝癌細(xì)胞培養(yǎng)基純化的外泌體，外泌體大小約為80～100 nm，有雙層膜結(jié)構(gòu)包裹，形態(tài)和結(jié)構(gòu)類似于常見的外泌體 （圖1A）。檢測(cè)肝癌細(xì)胞中的外泌體標(biāo)志物TSG101、CD63、CD81和ALIX的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，缺氧條件下可以誘導(dǎo)外泌體分泌 （圖1B）。缺氧誘導(dǎo)的外泌體可以誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化為M2型巨噬細(xì)胞 （圖1C、1D）。

圖1 缺氧促進(jìn)肝癌細(xì)胞分泌外泌體并誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2型極化Fig.1 Hypoxia promotes exocrine secretion of hepatocellular carcinoma cells and induces M2 macrophage polarization

2.2 缺氧肝癌細(xì)胞來源外泌體改變免疫微環(huán)境

為了明確缺氧誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞外泌體是否影響免疫微環(huán)境，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)缺氧和常氧條件誘導(dǎo)的外泌體共培養(yǎng)的肝癌樣本中腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的組成。在髓樣細(xì)胞中，樹突狀細(xì)胞的百分比降低 （圖2A）。在缺氧誘導(dǎo)的外泌體處理后，CD3+T細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)明顯減少 （圖2B）。

圖2 缺氧肝癌細(xì)胞來源外泌體改變免疫微環(huán)境Fig.2 Hypoxic hepatocellular carcinoma cell-derived exosomes alter the tumor immune microenvironment

2.3 缺氧肝癌細(xì)胞來源外泌體裝載的miR-432-5p被巨噬細(xì)胞攝取

為了檢測(cè)缺氧下肝癌細(xì)胞來源的外泌體中是否富含miR-432-5p，使用qRT-PCR檢測(cè)miR-432-5p水平。結(jié)果顯示，在缺氧條件下，肝癌細(xì)胞及其分泌的外泌體中miR-432-5p表達(dá)水平更高 （圖3A）。為了明確缺氧是否通過HIF-1α增加miR-432-5p水平，使用干擾小RNA沉默HIF-1α或HIF-2α的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在缺氧條件下外泌體中miR-432-5p水平顯著升高 （P＜ 0.05），但在HIF-1α敲低后miR-432-5p水平顯著降低 （圖3B）。這些結(jié)果表明，在缺氧條件下肝癌細(xì)胞來源的外泌體miR-432-5p水平取決于HIF-1α。同時(shí)檢測(cè)缺氧誘導(dǎo)的外泌體是否可以將miR-432-5p傳遞至巨噬細(xì)胞中，結(jié)果表明，與常氧條件下相比，缺氧誘導(dǎo)的外泌體共培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞中miR-432-5p水平升高 （P＜ 0.05，圖3C）。

圖3 缺氧肝癌細(xì)胞來源外泌體含有高水平的miR-432-5p并將其傳遞至巨噬細(xì)胞Fig.3 Hypoxic hepatocellular carcinoma cell-derived exosomes contain high levels of miR-432-5p and transmit it to the macrophages

2.4 缺氧肝癌細(xì)胞來源外泌體通過miR-432-5p促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化

通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)缺氧誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞分泌的外泌體與單核細(xì)胞間的相互作用。與si-miR-432-5p處理的缺氧誘導(dǎo)的外泌體相比，使用缺氧誘導(dǎo)的外泌體處理肝癌樣本后，CD206+腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞上的MHC-Ⅱ類分子的表達(dá)也增加 （圖4A、4B）。此外，與si-miR-432-5p處理的缺氧誘導(dǎo)的外泌體相比，缺氧誘導(dǎo)的外泌體促進(jìn)了M2型巨噬細(xì)胞的形成 （圖4C）。

圖4 缺氧肝癌細(xì)胞來源外泌體通過miR-432-5p促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化Fig.4 Hypoxic hepatocellular carcinoma cell-derived exosomes promote M2 macrophage polarization through miR-432-5p

2.5 缺氧肝癌細(xì)胞來源外泌體以HIF-1α依賴方式裝載miR-432-5p

為了明確miR-432-5p與HIF-1α之間的關(guān)系，分析miR-432-5p與HIF-1α結(jié)合位點(diǎn)序列并構(gòu)建突變質(zhì)粒。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，在肝癌細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染HIF-1α和野生型miR-432-5p導(dǎo)致熒光素酶活性顯著降低 （P＜ 0.05），而在突變的miR-432-5p中未觀察到這種現(xiàn)象 （圖5A）。在缺氧條件下，CD63和miR-432-5p共定位 （圖5B）。這些結(jié)果表明，缺氧通過HIF-1α依賴方式將miR-432-5p裝載進(jìn)入外泌體。

圖5 缺氧肝癌細(xì)胞來源外泌體以HIF-1α依賴方式裝載miR-432-5pFig.5 Hypoxia induces exosomal miR-432-5p via HIF-1α binding

2.6 缺氧肝癌細(xì)胞來源外泌體抑制腫瘤免疫活性

免疫組織化學(xué)染色顯示，HIF-1α水平與巨噬細(xì)胞的存在顯著相關(guān) （圖6A）。使用IL-2刺激采自健康供體血液中CFSE標(biāo)記的CD3+T細(xì)胞進(jìn)行體外功能實(shí)驗(yàn)。在共培養(yǎng)條件下，缺氧誘導(dǎo)的外泌體孵育的巨噬細(xì)胞抑制T細(xì)胞活化 （P＜ 0.05，圖6B、6C）。結(jié)果提示，缺氧肝癌細(xì)胞來源外泌體抑制腫瘤免疫。

圖6 缺氧肝癌細(xì)胞來源外泌體抑制腫瘤免疫活性Fig.6 Hypoxic hepatocellular carcinoma cell-derived exosomes inhibited immunological activity

2.7 miR-432-5p通過SOCS3/STAT3信號(hào)通路促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化

為了探索缺氧誘導(dǎo)的外泌體裝載的miR-432-5p促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化的具體機(jī)制，通過microRNA.org-Targets （http：//www.mirdb.org/） 預(yù)測(cè)miR-432-5p與SOCS3mRNA上的結(jié)合位點(diǎn) （圖7A）。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染SOCS3和野生型miR-432-5p導(dǎo)致熒光素酶活性降低 （P＜ 0.05，圖7B）。此外，miR-432-5p的過表達(dá)降低了巨噬細(xì)胞中SOCS3蛋白表達(dá)，并增加了磷酸化STAT3表達(dá) （圖7C）。這些結(jié)果表明，缺氧誘導(dǎo)的外泌體miR-432-5p通過SOCS3/STAT3信號(hào)通路促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化。

圖7 miR-432-5p通過SOCS3/STAT3信號(hào)通路促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化Fig.7 miR-432-5p promotes M2 macrophage polarization through SOCS3/STAT3 signal pathway

3 討論

缺氧是實(shí)體瘤的標(biāo)志之一，與腫瘤免疫抑制有關(guān)［10］。腫瘤微環(huán)境中多種細(xì)胞均能釋放外泌體并參與腫瘤的進(jìn)展［11］。研究［12］表明，外泌體參與腫瘤免疫抑制微環(huán)境形成。缺氧可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞釋放特異性外泌體，這些外泌體參與了腫瘤免疫抑制。

目前的研究［13］證實(shí)，巨噬細(xì)胞在腫瘤進(jìn)展過程中發(fā)揮多種作用，尤其是M2型巨噬細(xì)胞在腫瘤免疫抑制微環(huán)境形成中的作用，使得其有望成為腫瘤免疫治療的新靶點(diǎn)。本文證實(shí)了缺氧促進(jìn)肝癌細(xì)胞釋放外泌體，并證明了缺氧誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞來源的外泌體可以誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞極化。多種機(jī)制參與調(diào)控M2型巨噬細(xì)胞極化，尤其是STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在巨噬細(xì)胞極化中的作用值得關(guān)注。

既往的研究［14］證實(shí)，在生理?xiàng)l件下STAT3信號(hào)通路的活化十分短暫，在胚胎時(shí)期以及正常組織分化過程中發(fā)揮不可或缺的作用。隨著人們對(duì)STAT3信號(hào)通路認(rèn)識(shí)的深入，研究［15］發(fā)現(xiàn)STAT3在多種腫瘤中過表達(dá)并持續(xù)激活，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的快速增殖、分化、侵襲等惡性生物學(xué)行為。本研究證實(shí)，缺氧肝癌細(xì)胞來源外泌體中富含miR-432-5p，miR-432-5p以HIF-1α依賴方式裝載進(jìn)入外泌體。富含miR-432-5p外泌體釋放到腫瘤微環(huán)境中后，被巨噬細(xì)胞攝取。miR-432-5p 進(jìn)入到巨噬細(xì)胞后，能夠與SOCS3的3’非翻譯區(qū)結(jié)合，抑制其表達(dá)。SOCS3是SOCS 家族中最重要的成員之一，能夠負(fù)性調(diào)控STAT3的表達(dá)。本研究通過Western blotting證實(shí)，過表達(dá)miR-432-5p抑制巨噬細(xì)胞SOCS3蛋白的表達(dá)，并促進(jìn)STAT3蛋白磷酸化。

綜上所述，本研究證實(shí)了缺氧微環(huán)境促進(jìn)肝癌細(xì)胞釋放外泌體；缺氧肝癌細(xì)胞來源外泌體通過運(yùn)輸miR-432-5p，靶向調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞中SOCS3/STAT3信號(hào)通路，最終實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞極化。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在腫瘤中具有重要作用，靶向腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞有望提高腫瘤化療、免疫治療的療效，成為新的治療方式。目前對(duì)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在臨床治療中的策略了解仍非常有限，本研究為以巨噬細(xì)胞為靶點(diǎn)的臨床治療提供了新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。