賀曉文，邊競

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，沈陽 110001）

阿爾茨海默病 （Alzheimer’s disease，AD） 又稱為老人失智癥、老年癡呆癥、腦退化癥，是最常見的神經(jīng)退行性疾病。目前，AD已成為世界上最常見的癡呆類型之一。且隨著世界老齡化人口增加，AD發(fā)病率逐年上升。由于AD暫無有效的防治手段，給患者家庭和社會均帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，找到AD的發(fā)病原因并尋找有效的預(yù)防手段尤其重要［1］。

AD的病因不明，其主要病理特征為神經(jīng)元內(nèi)tau蛋白過度磷酸化形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)和胞外剪切生成的以β淀粉樣蛋白 （amyloid β-protein，Aβ）沉積形成的老年斑［2-3］。大量研究結(jié)果顯示，炎癥反應(yīng)是AD發(fā)病的主要原因之一，腦內(nèi)沉積的Aβ可通過與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞上的受體結(jié)合，激活星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，釋放大量炎性細(xì)胞因子和趨化因子，炎性細(xì)胞因子包括NOD樣受體蛋白3 （NOD-like receptor protein 3，NLRP3）、腫瘤壞死因子-α （tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素 （interleukin，IL） -6和IL-1β等。這些炎性細(xì)胞因子可進(jìn)一步促進(jìn)淀粉樣前體蛋白 （amyloid precursor protein，APP） 向淀粉樣蛋白剪切途徑進(jìn)行，促使Aβ生成增多，最終形成惡性循環(huán)，加快AD的進(jìn)程［4-5］。

近年來，針對AD的治療藥物越來越多，主要包括膽堿酯酶抑制劑 （多奈哌齊等）、谷氨酸受體拮抗劑 （美金剛） 以及甘露特納，但是這些藥物都無法達(dá)到預(yù)期的治療效果，且存在潛在的不良反應(yīng)［6-7］。鼠尾草酸 （carnosic acid，CA） 主要存在于鼠尾草和迷迭香等植物中，具有抗炎、抗氧化和抗菌等作用［8-10］。研究［11］發(fā)現(xiàn)，CA能夠抑制多種皮膚炎癥，且對人體無毒。此外，CA能夠通過降低TNF-α的表達(dá)，抑制細(xì)胞內(nèi)炎癥反應(yīng)［12］。因此，CA可能具有廣泛的抗炎作用。然而，CA能否通過降低神經(jīng)炎癥反應(yīng)減少Aβ生成和沉積數(shù)量，進(jìn)而延緩AD的病理進(jìn)程，尚未見報道。因此，本研究通過給予AD小鼠CA，研究CA對AD的影響，并探索其是否可以通過核因子κB （nuclear factor-κB，NF-κB） 抑制小鼠大腦皮層免疫炎癥反應(yīng)，從而改善AD小鼠的認(rèn)知功能障礙，最終延緩AD的發(fā)病進(jìn)程。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品和試劑盒：CA，購自中國MedChemExpress公司；NLRP3、TNF-α、IL-6、IL-1β、NF-κB、p-NF-κB、Aβ抗體、β-actin、二抗、Alexa Fluor 555標(biāo)記的熒光二抗，購自美國Cell Signaling Technology公司。IL-1β、IL-6和TNF-α的ELISA試劑盒，購自美國Abcam公司。

1.1.2 儀器：Morris水迷宮，購自中國安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司；激光共聚焦顯微鏡，購自日本尼康公司；酶標(biāo)儀，購自美國伯騰儀器有限公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動物和分組：5月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠（AD模型） 18只，購自北京華阜康生物科技有限公司，體質(zhì)量25～28 g。將18只小鼠分為對照組和CA組，每組9只。CA組：腹腔注射CA （20 mg·kg-1·d-1），連續(xù)注射2個月；對照組：腹腔注射相同體積的生理鹽水，連續(xù)注射2個月。

1.2 方法

1.2.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)分為3個時期。訓(xùn)練期為2 d，3次/d，每次間隔1 h；可視平臺期為5 d，3次/d，每次間隔1 h；第8天為隱蔽平臺期，移走平臺，記錄小鼠穿越原來平臺位置的次數(shù)。每只小鼠進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 組織取材：10%水合氯醛 （10 g/3 μL） 麻醉小鼠，待小鼠進(jìn)入深度麻醉狀態(tài) （手術(shù)鑷子夾小鼠四肢未見反應(yīng)即可），立刻將小鼠固定于解剖臺上。剖開胸腔并剪去橫膈膜，暴露心臟，在左心室左下角開一個小口，將灌流針由左心室插入主動脈，并用止血鉗固定住針頭，剪開右心耳，立即用0.9% NaCl灌流，灌流4～6 min，至肝臟邊緣無血絲為止。迅速斷頭，剖取小鼠大腦，于冰上一分為二。一部分放入4%多聚甲醛中固定保存，用于免疫組織化學(xué)中的形態(tài)學(xué)檢測；另一部分放入-80 ℃冰箱保存，用于蛋白提取、Western blotting等分子生物學(xué)檢測。

1.2.3 Western blotting：前額皮層組織稱重，加入RIPA裂解液 （內(nèi)含蛋白酶抑制和磷酸酶抑制劑） 后進(jìn)行超聲破碎。破碎后，放置冰上裂解3～4 h，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，吸取上清，進(jìn)行蛋白質(zhì)定量后深度低溫保存，用于Western blotting檢測。10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠，轉(zhuǎn)膜完成后，PVDF膜用2%脫脂牛奶封閉，抗體4 ℃孵育過夜。第2天二抗室溫孵育45 min，洗膜，ECL發(fā)光并顯影。

1.2.4 免疫熒光染色：切片水化后，用羊血清封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜。熒光二抗室溫孵育2 h，PBS漂洗后，防熒光淬滅劑封片，顯微鏡下采集圖像。

1.2.5 ELISA檢測：按照試劑盒操作，測定小鼠皮層中炎性細(xì)胞因子NLRP3、TNF-α、IL-6、IL-1β的含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用Prism7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)用±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CA對AD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的調(diào)控

水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對照組小鼠和CA組小鼠尋找可視平臺的時間無統(tǒng)計學(xué)差異 （P＞ 0.05），說明2組小鼠的運(yùn)動能力和視力無顯著差異。隱蔽平臺實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，CA組小鼠逃避潛伏期明顯縮短 （P＜ 0.05），說明CA可提高小鼠的記憶能力，且可明顯緩解AD小鼠的空間記憶損傷 （P＜0.05）。見圖1。

圖1 CA對AD小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響Fig.1 Effects of carnosic acid on spatial learning and memory abilities of AD mice

2.2 CA對AD小鼠大腦皮層中Aβ沉積數(shù)量和膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響

免疫熒光雙標(biāo)記染色結(jié)果顯示，對照組小鼠的大腦皮層出現(xiàn)大量Aβ老年斑沉積，并且其周圍的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞明顯增多。與對照組相比，CA組小鼠大腦皮層中Aβ老年斑數(shù)量明顯減少，星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞明顯減少。說明CA可能通過抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的活化減少Aβ的生成，進(jìn)而延緩AD的發(fā)病進(jìn)程。見圖2、3。

圖2 皮層中Aβ老年斑沉積和星形膠質(zhì)細(xì)胞的共定位情況Fig.2 The co-localization of Aβ senile plaques and astrocytes in the cortical area

圖3 皮層中Aβ老年斑沉積和小膠質(zhì)細(xì)胞的共定位情況Fig.3 The co-localization of Aβ senile plaques and microglia in the cortical area

2.3 CA對AD小鼠大腦皮層中炎性細(xì)胞因子的影響

ELISA結(jié)果 （圖4） 顯示，與對照組相比，CA組小鼠TNF-α、IL-6和IL-1β蛋白表達(dá)水平明顯降低 （P＜0.05）。Western blotting結(jié)果 （圖5） 進(jìn)一步證實(shí)，與對照組相比，CA組小鼠NLRP3、TNF-α、IL-6和IL-1β的表達(dá)水平明顯降低 （P＜ 0.05），CA抑制NLRP3、TNF-α、IL-6和IL-1β的表達(dá)。說明CA可明顯抑制AD小鼠腦內(nèi)炎癥反應(yīng)。

圖4 ELISA檢測CA對AD小鼠腦內(nèi)炎性細(xì)胞因子的影響Fig.4 Effects of carnosic acid on inflammatory factors in the brains of AD mice，as detected by ELISA

圖5 Western blotting檢測CA對AD小鼠腦內(nèi)炎性細(xì)胞因子的影響Fig.5 Effects of carnosic acid on inflammatory factors in the brains of AD mice，as detected by Western blotting

2.4 CA通過NF-κB信號通路抑制AD小鼠腦內(nèi)炎性細(xì)胞因子表達(dá)

與對照組相比，CA組p-NF-κB的表達(dá)明顯降低（P＜ 0.05）。說明CA可能通過NF-κB信號通路抑制AD小鼠免疫炎癥反應(yīng)，進(jìn)而改善小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。見圖6。

圖6 CA對AD小鼠腦內(nèi)NF-κB信號通路的影響Fig.6 Effects of carnosic acid on NF-κB signaling in the brains of AD mice

3 討論

Aβ形成過程中伴隨著神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化，產(chǎn)生大量的炎性細(xì)胞因子，包括TNF-α、IL-6和IL-1β等。而小膠質(zhì)細(xì)胞持續(xù)激活削弱了其結(jié)合和吞噬Aβ的能力，并降低Aβ的降解，進(jìn)一步增加Aβ的沉積數(shù)量，加快AD的發(fā)病進(jìn)程。

NF-κB在神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元損傷的細(xì)胞反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。NF-κB通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和免疫應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄來調(diào)節(jié)免疫。在刺激作用下，NF-κB從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，誘導(dǎo)靶基因轉(zhuǎn)錄［13］。重要的是，AD患者死后腦退化細(xì)胞中可見明顯的NF-κB活化。在膠質(zhì)增生過程中，Aβ神經(jīng)毒性依賴于NF-κB［14］。相反，阻斷NF-κB可減輕IL-1β誘導(dǎo)的變性［15］。NF-κB抑制被認(rèn)為是減少神經(jīng)炎癥損傷，從而延緩AD發(fā)病進(jìn)程的潛在靶點(diǎn)。

CA是一種天然化合物，是從迷迭香中分離得到的一種酚類二萜，因其藥理作用而受到越來越多的關(guān)注。研究［9］證實(shí)，CA可逆轉(zhuǎn)Aβ引起的海馬神經(jīng)元損傷，進(jìn)而起到保護(hù)神經(jīng)元的作用。此外，CA可通過抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的炎性細(xì)胞因子，改善AD小鼠的認(rèn)知功能障礙。

本研究檢測了炎性細(xì)胞因子NLRP3、TNF-α、IL-6和IL-1β的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，CA組NLRP3、TNF-α、IL-6和IL-1β蛋白表達(dá)明顯降低，p-NF-κB表達(dá)明顯降低，提示CA可能通過NF-κB信號通路抑制炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，進(jìn)而抑制AD小鼠腦內(nèi)的免疫炎癥反應(yīng)，最終延緩AD的病理進(jìn)程。免疫熒光雙標(biāo)記染色結(jié)果進(jìn)一步揭示，CA可抑制AD小鼠腦內(nèi)Aβ的生成以及減少Aβ的沉積數(shù)量，抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的活化。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，CA改善AD小鼠的認(rèn)知功能障礙，為今后在臨床上CA防治AD提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，CA可通過抑制APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)免疫炎癥反應(yīng)，進(jìn)而減少AD小鼠腦內(nèi)的Aβ沉積數(shù)量，最終改善AD的認(rèn)知功能障礙。本研究為CA今后用于防治AD提供了有力的理論依據(jù)。