蘇布道,梁戎,靈小,蘇日娜

慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)是臨床常見的一種由心臟結(jié)構(gòu)或功能異常導(dǎo)致的射血功能受損或心室充盈的臨床綜合征,近年來隨著人口老齡化的持續(xù)發(fā)展和各種心血管疾病患者生存期的延長(zhǎng),CHF發(fā)生率逐年上升,給我國(guó)造成了巨大的公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)[1-3]。左心室重構(gòu)(left ventricular remodeling,LVR)是心力衰竭發(fā)生發(fā)展的病理基礎(chǔ),炎性反應(yīng)在LVR中發(fā)揮重要作用[4-5]。尋找可反映CHF炎性反應(yīng)和LVR的生物標(biāo)志物對(duì)改善患者預(yù)后至關(guān)重要。研究表明,外泌體非編碼RNA能通過調(diào)控炎性反應(yīng)和LVR等參與心力衰竭發(fā)生發(fā)展[6]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,LncRNA)H19是最先被發(fā)現(xiàn)的LncRNA之一,LncRNA H19能促進(jìn)心肌細(xì)胞炎性反應(yīng)[7]。微小RNA(microRNA,miRNA)-214是一種廣泛保守的miRNA,研究報(bào)道m(xù)iR-214能抑制心肌細(xì)胞炎性反應(yīng)[8]?，F(xiàn)分析CHF患者血漿外泌體LncRNA H19、miR-214表達(dá)與炎性因子和左心室重構(gòu)的關(guān)系,報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2020年7月—2022年9月內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院心血管內(nèi)科收治CHF患者120例為CHF組,其中男46例,女74例,年齡43～87(60.93±9.03)歲;病程3～17(10.54±2.64)年;紐約心臟病協(xié)會(huì)(New York Heart Association,NYHA)心功能分級(jí)[9]:Ⅱ級(jí)44例,Ⅲ級(jí)40例,Ⅳ級(jí)36例;誘發(fā)疾病:冠心病54例,擴(kuò)張型心肌病21例,原發(fā)性高血壓45例;合并癥:慢性腎臟病14例,慢性阻塞性肺疾病11例,糖尿病9例,中樞性睡眠呼吸暫停16例。另選取同期醫(yī)院體檢健康志愿者40例為健康對(duì)照組,其中男15例,女25例,年齡39～76(61.52±8.44)歲。2組性別、年齡等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究已經(jīng)獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2020-02-0321),受試者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn):①符合《慢性心力衰竭基層診療指南(2019年)》[10]中CHF診斷標(biāo)準(zhǔn);②年齡≥18歲。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①急性心力衰竭;②先天性心臟疾病;③妊娠及哺乳期婦女;④造血、免疫、神經(jīng)系統(tǒng)損害;⑤合并嚴(yán)重肝腎功能不全、惡性腫瘤。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 血漿外泌體LncRNA H19、miR-214基因表達(dá)檢測(cè):使用枸櫞酸鈉采血管收集受試人員空腹靜脈血3 ml,離心留取血漿置于離心管,再次離心收集上清液保存于離心管,放置于-80℃冰箱凍存。室溫下解凍血漿取1 ml至離心管,經(jīng)緩沖液XBP、XWP、XE 350加入和離心后,孵育再離心收集洗脫液。透射電子顯微鏡(日立高新技術(shù)公司,型號(hào):HT7800)觀察分離所得血漿外泌體(直徑為30～150 nm類圓形雙層膜囊泡)。取血漿外泌體200 μl,Trizol試劑盒(賽默飛世爾科技公司)提取血清總RNA,鑒定純度、濃度合格后,Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司)合成cDNA,反應(yīng)條件:37℃ 1 h、80℃ 5 s。按照SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),反應(yīng)體系共20 μl:cDNA 1 μl、上下游引物各0.5 μl、Universal miRNA qPCR primer 0.5 μl、2×TransStart?Top Green qPCR SurperMix 10 μl、無核酸酶水7.5 μl;反應(yīng)條件:95℃ 90 s(1次),95℃ 30 s、63℃ 30 s、72℃ 15 s(循環(huán)40次)。LncRNA H19以GAPDH為內(nèi)參,miR-214以U6為內(nèi)參,2-ΔΔCT法計(jì)算血漿外泌體LncRNA H19、miR-214相對(duì)表達(dá)量。LncRNA H19正向引物:5′-TCCCAGAACCCACAACATGAA-3′,反向引物:5′-TTCACCTTCCAGAGCCGATTC-3′;GAPDH正向引物:5′-AGCCACATCGCTCAGACAC-3′,反向引物:5′-GCCCAATACGACCAAATCC-3′;miR-214正向引物:5′-CGTGTGCAAATCCATGCAA-3′,反向引物:5′-CGTGTGCAAATCCATGCAA-3′;U6正向引物:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,反向引物:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.3.2 血清炎性因子檢測(cè):患者入院翌日晨和健康對(duì)照組體檢時(shí)采集空腹肘靜脈血3 ml,離心留取上層血清,采用酶聯(lián)免疫吸附法(武漢純度生物科技有限公司)檢測(cè)白介素(interleukin,IL)-1β、IL-6、IL-18、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平。

1.3.3 超聲心動(dòng)圖檢查:研究對(duì)象均采用M型彩色多普勒超聲診斷儀(荷蘭飛利浦,型號(hào):EPIQ7)行超聲心動(dòng)圖檢查,參考《超聲心動(dòng)圖評(píng)估心臟收縮和舒張功能臨床應(yīng)用指南》[11]通過雙平面法(改良Simpson)檢測(cè)左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end diastolic diameter,LVEDD)、左心室后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness, LVPWT)、舒張末期室間隔厚度(interventricular septal thickness,IVST),使用體表面積校正左心室質(zhì)量計(jì)算左心室心肌質(zhì)量指數(shù)(left ventricular myocardial mass index, LVMI)。

2 結(jié) 果

2.1 2組血漿外泌體LncRNA H19、miR-214表達(dá)比較 CHF組血漿外泌體LncRNA H19表達(dá)高于健康對(duì)照組,miR-214表達(dá)低于健康對(duì)照組(P<0.01),見表1。

表1 健康對(duì)照組與CHF組血漿外泌體LncRNA H19、miR-214表達(dá)比較

2.2 不同NYHA心功能分級(jí)CHF患者血漿外泌體LncRNA H19、miR-214表達(dá)比較 NYHA心功能分級(jí)Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)CHF患者血漿外泌體LncRNA H19表達(dá)依次升高,miR-214表達(dá)依次降低(P<0.01),見表2。

表2 不同NYHA心功能分級(jí)CHF患者血漿外泌體LncRNA H19、miR-214表達(dá)比較

2.3 2組血清炎性因子和左心室重構(gòu)指標(biāo)比較 CHF組血清IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平高于健康對(duì)照組(P<0.01),見表3。CHF組LVEDD、LVPWT、IVST、LVMI高于健康對(duì)照組(P<0.01),見表4。

表3 健康對(duì)照組與CHF組血清炎性因子水平比較

表4 健康對(duì)照組與CHF組左心室重構(gòu)指標(biāo)比較

2.4 不同NYHA心功能分級(jí)CHF患者血清炎性因子和左心室重構(gòu)指標(biāo)比較 NYHA心功能分級(jí)Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)CHF患者血清IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平依次升高(P<0.01),見表5。NYHA心功能分級(jí)Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)CHF患者LVEDD、LVPWT、IVST、LVMI依次升高(P<0.01),見表6。

表5 不同NYHA心功能分級(jí)CHF患者血清炎性因子水平比較

表6 不同NYHA心功能分級(jí)CHF患者左心室重構(gòu)指標(biāo)比較

2.5 CHF患者血漿外泌體LncRNA H19、miR-214表達(dá)與炎性因子、NYHA心功能分級(jí)和左心室重構(gòu)指標(biāo)的相關(guān)性 經(jīng)StarBase數(shù)據(jù)庫(kù)https://starbase.sysu.edu.cn/預(yù)測(cè),LncRNA H19與miR-214存在互補(bǔ)序列,見圖1。Pearson/Spearman相關(guān)性分析顯示,CHF患者血漿外泌體LncRNA H19與IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α、NYHA心功能分級(jí)、LVEDD、LVPWT、IVST、LVMI呈正相關(guān),與miR-214呈負(fù)相關(guān)(P<0.01);miR-214與IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α、NYHA心功能分級(jí)、LVEDD、LVPWT、IVST、LVMI呈負(fù)相關(guān)(P<0.01),見表7。

圖1 LncRNA H19與miR-214互補(bǔ)序列示意圖

表7 CHF患者血漿外泌體LncRNA H19、miR-214表達(dá)與NYHA心功能分級(jí)、炎性因子和左心室重構(gòu)指標(biāo)的相關(guān)性

2.6 血漿外泌體LncRNA H19、miR-214預(yù)測(cè)CHF患者發(fā)生左心室重構(gòu)的效能 繪制血漿LncRNA H19、miR-214預(yù)測(cè)CHF患者發(fā)生左心室重構(gòu)的ROC曲線,并計(jì)算AUC。結(jié)果顯示,血漿外泌體LncRNA H19、miR-214及二者聯(lián)合預(yù)測(cè)左心室重構(gòu)的AUC分別為0.780、0.779、0.877,二者聯(lián)合的AUC高于單項(xiàng)預(yù)測(cè)(Z=3.026、3.114,P=0.003、0.002),見表8、圖2。

圖2 LncRNA H19、miR-214預(yù)測(cè)CHF患者發(fā)生左心室重構(gòu)的ROC曲線

表8 LncRNA H19、miR-214預(yù)測(cè)CHF患者發(fā)生左心室重構(gòu)的效能比較

3 討 論

CHF是所有心血管疾病的必然終點(diǎn),主要因原發(fā)性心肌損害和異常引起,盡管近年來在其預(yù)防、診療和綜合管理等領(lǐng)域取得較大進(jìn)展,心臟再同步治療等治療技術(shù)和“新四聯(lián)”藥物被應(yīng)用于CHF治療,但CHF再住院率和病死率仍然居高不下[12-13]。目前臨床已普遍使用B型鈉尿肽或N末端B型利鈉肽前體診斷CHF和評(píng)估其病情、預(yù)后,但二者易受到性別、年齡、肥胖、腎功能、藥物、貧血等多種因素影響[14],還需尋找新的生物標(biāo)志物。

左心室重構(gòu)是CHF發(fā)生發(fā)展和決定病情、預(yù)后的病理基礎(chǔ),其過程涉及炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞纖維化等諸多機(jī)制,炎性反應(yīng)能通過促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡促進(jìn)左心室重構(gòu)[4-5]。IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α是臨床常用的炎性因子指標(biāo)。目前臨床主要通過超聲心動(dòng)圖評(píng)估左心室重構(gòu),左心室重構(gòu)后表現(xiàn)為L(zhǎng)VEDD、LVPWT、IVST、LVMI升高[4,11]。本研究結(jié)果顯示,與健康對(duì)照組比較,CHF組血清IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平和LVEDD、LVPWT、IVST、LVMI升高,說明CHF患者存在明顯的炎性反應(yīng)和左心室重構(gòu),符合CHF患者病理變化。結(jié)果還顯示,NYHA心功能分級(jí)Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)CHF患者血清IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平和LVEDD、LVPWT、IVST、LVMI依次升高,說明CHF患者隨著病情加重,炎性反應(yīng)和左心室重構(gòu)會(huì)進(jìn)一步加重。

外泌體是來源于多種細(xì)胞的一種直徑30～150 nm的囊泡,能通過運(yùn)載脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、非編碼RNA等物質(zhì)傳遞細(xì)胞和組織間的信息,其內(nèi)攜帶的多種遺傳物質(zhì)能通過自分泌和旁分泌途徑被細(xì)胞、組織、器官吸收,參與多種病理生理過程[15]。近年研究表明,非編碼RNA能通過調(diào)控炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞纖維化等諸多機(jī)制參與左心室重構(gòu)過程[16]。LncRNA H19是最早被證實(shí)的腫瘤相關(guān)LncRNA[17]。近年研究發(fā)現(xiàn),LncRNA H19還參與其他疾病過程,Wang等[18]研究報(bào)道,LncRNA H19在心肌細(xì)胞代謝紊亂中發(fā)揮至關(guān)重要的作用,與心臟功能密切相關(guān)。Luo等[19]研究報(bào)道,敲低或抑制LncRNA H19能減少心肌細(xì)胞炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá),抑制心肌細(xì)胞缺血/再灌注后炎性反應(yīng)和凋亡。Tang等[20]研究報(bào)道,抑制LncRNA H19能減少糖尿病大鼠心肌細(xì)胞炎性反應(yīng)和凋亡,促進(jìn)大鼠心功能改善。上述研究表明,LncRNA H19與心肌細(xì)胞炎性反應(yīng)和凋亡密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示,CHF患者血漿外泌體LncRNA H19表達(dá)上調(diào),并隨著NYHA心功能分級(jí)增加而上調(diào),說明血漿外泌體LncRNA H19表達(dá)上調(diào)參與CHF發(fā)生發(fā)展。結(jié)果還顯示,CHF患者血漿外泌體LncRNA H19與IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α、LVEDD、LVPWT、IVST、LVMI呈正相關(guān),說明血漿外泌體LncRNA H19高表達(dá)與CHF炎性反應(yīng)和左心室重構(gòu)有關(guān)。最近Choong等[21]研究也報(bào)道,下調(diào)LncRNA H19能抑制小鼠心肌梗死后左心室重構(gòu)。

miR-214是一種骨代謝關(guān)鍵調(diào)控的miRNA[22]。近年研究發(fā)現(xiàn),miR-214還參與其他疾病過程,陳貽人等[23]研究報(bào)道,上調(diào)miR-214表達(dá)能抑制脂多糖誘導(dǎo)的IL-1β、IL-6、TNF-α、Bax表達(dá),抑制心肌細(xì)胞炎性反應(yīng)和凋亡。Lan等[24]研究報(bào)道,上調(diào)miR-214表達(dá)能抑制缺氧誘導(dǎo)的IL-1β、IL-6、TNF-α和丙二醛、超氧化物歧化酶表達(dá),抑制心肌細(xì)胞炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激,改善心肌細(xì)胞損傷。上述研究表明,miR-214能通過抑制炎性反應(yīng)改善心肌損傷。同時(shí)Gholaminejad等[25]通過基因集富集分析發(fā)現(xiàn),miR-214在心力衰竭中差異表達(dá),可能是心力衰竭新的標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示,CHF患者血漿外泌體miR-214表達(dá)下調(diào),并隨著NYHA心功能分級(jí)增加而下調(diào),說明血漿外泌體miR-214表達(dá)下調(diào)參與CHF發(fā)生發(fā)展。結(jié)果還顯示,CHF患者血漿外泌體miR-214與IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α、LVEDD、LVPWT、IVST、LVMI呈負(fù)相關(guān),說明血漿外泌體miR-214低表達(dá)與CHF炎性反應(yīng)和左心室重構(gòu)有關(guān)。Du等[26]實(shí)驗(yàn)也報(bào)道,上調(diào)miR-214能抑制心肌梗死后左心室重構(gòu)。

研究表明,LncRNA能通過海綿miRNA調(diào)控相關(guān)病理過程[27]。筆者通過StarBase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),LncRNA H19與miR-214存在互補(bǔ)序列,相關(guān)性分析也發(fā)現(xiàn),LncRNA H19與miR-214在CHF患者血漿外泌體中表達(dá)呈負(fù)相關(guān),提示LncRNA H19與miR-214可能共同通過炎性反應(yīng)和左心室重構(gòu)參與CHF過程。張苡榕等[28]研究也顯示,沉默LncRNA H19能靶向上調(diào)miR-214,抑制心肌細(xì)胞炎性反應(yīng)和凋亡,改善心肌損傷。最后本研究通過繪制ROC曲線分析外泌體LncRNA H19、miR-214表達(dá)對(duì)CHF患者發(fā)生左心室重構(gòu)的效能發(fā)現(xiàn),血漿LncRNA H19、miR-214及二者聯(lián)合預(yù)測(cè)左心室重構(gòu)的AUC分別為0.780、0.779、0.877,二項(xiàng)聯(lián)合的AUC最大,這說明血漿外泌體LncRNA H19、miR-214可能成為CHF患者左心室重構(gòu)的評(píng)估指標(biāo),且二者聯(lián)合檢測(cè)能提升其評(píng)估價(jià)值。

綜上所述,CHF患者血漿外泌體LncRNA H19表達(dá)升高,miR-214表達(dá)降低,二者可能共同影響CHF患者病情嚴(yán)重程度、炎性反應(yīng)和左心室重構(gòu)。但本研究結(jié)果仍需多中心研究驗(yàn)證。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

蘇布道:設(shè)計(jì)研究方案,收集整理數(shù)據(jù),論文撰寫;梁戎:提出研究思路,分析試驗(yàn)數(shù)據(jù),論文審核;靈小:實(shí)施研究過程,資料搜集整理,論文修改;蘇日娜:收集數(shù)據(jù),進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,論文修訂