張麗,何燕,馬祖文（新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院,新疆 烏魯木齊 830000）

板藍(lán)根來源于十字花科植物菘藍(lán)的根，在流感等感染性疾病的治療中較為常用，具有確切的臨床療效[1]?，F(xiàn)版《中國藥典》定性板藍(lán)根質(zhì)量控制的依據(jù)主要為精氨酸薄層鑒別，但板藍(lán)根具有復(fù)雜的化學(xué)成分，缺乏明確的藥效物質(zhì)，在其質(zhì)量控制中，精氨酸鑒別意義不大[2]。在中藥質(zhì)量研究中，將中藥質(zhì)量生物控制模式建立起來已經(jīng)成為發(fā)展趨勢，特別是一些中藥品種，測定含量時(shí)缺乏指標(biāo)性成分，將生物活性檢測方法建立起來能夠?qū)ΜF(xiàn)有質(zhì)控水平進(jìn)行完善并使其提升[3]。要想使中藥質(zhì)量生物控制得以實(shí)現(xiàn)，關(guān)鍵是要將生物活性測定方法優(yōu)化并建立起來，并保證其與藥品檢定要求相符，和藥效相關(guān)[4]。本文研究了中藥板藍(lán)根基于抗病毒活性檢測的質(zhì)量控制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與材料

1.1 藥材與試劑 板藍(lán)根藥材來源于十字花科植物菘藍(lán)的干燥根。NA底物。

1.2 主要儀器 熒光酶標(biāo)檢測儀（FLUOstar OPTIMA，BMG公司），熒光酶標(biāo)板（96孔，COSTAR公司），V型微量板（96孔，姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司）。

1.3 細(xì)胞系、病毒株與NA 1%紅細(xì)胞：用PBS與兔紅細(xì)胞制作1%紅細(xì)胞混懸液，保存在4℃的溫度下備用；流感病毒：A/PR8/34；NA制備：培養(yǎng)細(xì)胞，接種病毒，將濾除細(xì)胞的病毒液取出，滅活，除菌過濾后分裝，作為NA原液保存在-70℃的溫度下。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 板藍(lán)根紅細(xì)胞凝集活性測定方法

2.1.1 供試品溶液制備 將本品粉末取出，過三號篩，精密稱定，放置于圓底燒瓶中，精密量取10倍量乙醇溶液加入其中，將重量稱定，加熱回流40min，放冷，然后將重量稱定，用乙醇將減失的重量補(bǔ)足，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液，水浴蒸干，用PBS溶解殘?jiān)〕錾锨逡?，除菌過濾。直接用PBS溶解陽性對照藥，制成1mg/ml初濃度。

2.1.2 測定法 在V形微量板（96孔）上用PBS兩倍系列稀釋供試品溶液，每個(gè)供試品溶液做兩排，每孔加入50μl，將50μl PBS加入到每排最后1孔中，將其設(shè)定為陰性對照。然后將50μl 1%紅細(xì)胞混懸液加入到每個(gè)孔中，以輕柔的動(dòng)作對微量板進(jìn)行拍打30s，混勻，在4℃的溫度下靜置2h，對結(jié)果進(jìn)行觀察。

2.1.3 結(jié)果判定 在白色背景上放置微量板，比較供試品孔和陰性對照孔，陽性（+）判定標(biāo)準(zhǔn)為紅細(xì)胞沒有全部在底部沉積，一些在孔壁上附著，或有一層紅細(xì)胞均勻附著在孔壁上；陰性（-）判定標(biāo)準(zhǔn)為紅細(xì)胞在底部沉積成一規(guī)則的圓點(diǎn)，沒有紅細(xì)胞附著在孔壁。本品效價(jià)為供試品出現(xiàn)陽性的最高稀釋倍數(shù)。

2.2 板藍(lán)根紅細(xì)胞凝集活性和抗病毒活性相關(guān)性實(shí)驗(yàn)

2.2.1 板藍(lán)根抑制NA活性的測定 依據(jù)已建立的板藍(lán)根抑制NA活性測定步驟與方法測定。

2.2.2 數(shù)據(jù)處理 板藍(lán)根對NA抑制活性的反應(yīng)抑制率計(jì)算公式為：（I）=（酶活性對照熒光-樣品作用后熒光）/（酶活性對照熒光-背景熒光）×100%。

2.2.3 相關(guān)性統(tǒng)計(jì)方法 將自變量、應(yīng)變量分別設(shè)定為NA抑制活性、紅細(xì)胞聚集效價(jià)，將統(tǒng)計(jì)分析樣品設(shè)定為上述20份藥材，運(yùn)用直線相關(guān)分析方法對兩種方法檢測結(jié)果的相關(guān)性進(jìn)行考察。采用SAS 8.12統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算直線相關(guān)分析。

3 結(jié)果

3.1 板藍(lán)根對紅細(xì)胞的凝集活性觀察 將供試品溶液制備出來，組成成分為三批板藍(lán)根樣品與陽性對照藥PHA-p，檢測紅細(xì)胞凝集活性，反應(yīng)前后分別在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)板藍(lán)根和陽性對照藥對紅細(xì)胞的凝集活性均顯著。

3.2 方法學(xué)驗(yàn)證

3.2.1 供試品溶液穩(wěn)定性 將同批板藍(lán)根粉末取出，制備供試品溶液，避光密封保存，在0h、4h、8h、12h、24h時(shí)分別測定凝集活性，RSD=5.8%，發(fā)現(xiàn)供試品溶液24h內(nèi)凝集活性在避光密封保存條件下具有良好的穩(wěn)定性。

3.2.2 重復(fù)性 將6份供試品溶液分別制備出來，RSD=7.0%，表明該方法具有良好的重復(fù)性。

3.2.3 中間精密度 為了對改變實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部條件影響測定結(jié)果的情況進(jìn)行考察，相同實(shí)驗(yàn)室不同實(shí)驗(yàn)人員與不同工作日的RSD=9.9%，表明不同實(shí)驗(yàn)人員之間具有良好的中間精密度，該方法具有良好的日間精密度。

3.2.4 重現(xiàn)性 多個(gè)實(shí)驗(yàn)室對同一樣品具有較小的測定結(jié)果變異，RSD=7.9%，表明方法具有良好的重現(xiàn)性。

3.3 板藍(lán)根紅細(xì)胞凝集活性和其抗病毒藥理作用的相關(guān)性驗(yàn)證 檢測20批板藍(lán)根藥材的紅細(xì)胞凝集活性，并檢測其對流感病毒NA活性的抑制作用，進(jìn)行相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)板藍(lán)根紅細(xì)胞凝集效價(jià)和其抑制流感病毒NA活性之間相關(guān)性顯著（r=0.83，P＜0.01），兩種測定方法的結(jié)果具有較為一致的變化趨勢。檢測板藍(lán)根紅細(xì)胞凝集活性能夠和板藍(lán)根抗流感病毒的藥理作用較好關(guān)聯(lián)。

4 討論

板藍(lán)根的主要藥效作用為抗病毒，雞胚培養(yǎng)法及臨床試驗(yàn)等均證實(shí)，紅細(xì)胞凝集活性和其抗病毒作用呈顯著的正相關(guān)關(guān)系[5]。本研究結(jié)果表明，板藍(lán)根和陽性對照藥對紅細(xì)胞的凝集活性均顯著。供試品溶液24h內(nèi)凝集活性在避光密封保存條件下具有良好的穩(wěn)定性。方法具有良好的重復(fù)性、日間精密度以及良好的重現(xiàn)性。板藍(lán)根紅細(xì)胞凝集效價(jià)和其抑制流感病毒NA活性之間相關(guān)性顯著（r=0.83，P＜0.01），兩種測定方法的結(jié)果具有較為一致的變化趨勢。板藍(lán)根紅細(xì)胞凝集活性檢測與板藍(lán)根抗流感病毒的藥理作用有較強(qiáng)的相關(guān)性，說明板藍(lán)根基于紅細(xì)胞凝集活性測定的質(zhì)量生物鑒定方法能夠?qū)ΜF(xiàn)行板藍(lán)根質(zhì)量控制水平進(jìn)行補(bǔ)充與完善，同時(shí)也為缺乏合適化學(xué)檢測指標(biāo)的中藥質(zhì)量控制提供思路與技術(shù)支持。

從理論上來說，如果藥理學(xué)方法可量化，那么其就能夠在檢測中藥生物活性中應(yīng)用，但是雞胚培養(yǎng)法、細(xì)胞保護(hù)實(shí)驗(yàn)等抗病毒藥理實(shí)驗(yàn)在定量化、安全性、可操作性等方面很難使藥品檢定的要求得到有效滿足[6]。本研究所建立的板藍(lán)根凝集活性測定方法具備定量、簡便易行等優(yōu)勢，在控制板藍(lán)根質(zhì)量、評價(jià)其品質(zhì)過程中具有一定優(yōu)勢與可行性。中藥品質(zhì)鑒定的生物測定方法的補(bǔ)充、完善提高了現(xiàn)有的中藥質(zhì)量，且并沒有取代現(xiàn)有方法。如果中藥品種缺乏清晰的藥效成分與適宜的化學(xué)測定指標(biāo)，那么就應(yīng)該將生物測定的方法重點(diǎn)發(fā)展起來。如果中藥品種能夠?qū)⒒瘜W(xué)成分闡明，化學(xué)指標(biāo)能夠關(guān)聯(lián)藥效，那么可以采用以化學(xué)測定為主的質(zhì)控方式。針對不同中藥采取具有不同側(cè)重點(diǎn)的常規(guī)檢測+生物測定+化學(xué)測定三位一體的方法與模式，從而共同為中藥質(zhì)量把關(guān)。

綜上所述，研究中所建立的方法和板藍(lán)根抗流感病毒的藥效相關(guān)，進(jìn)而可區(qū)分與評價(jià)不同樣品的品質(zhì)，適用性較好，值得推廣。