王雨珂,田 程,李代龍,許新華

(三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院,湖北 宜昌 443000)

乳腺癌是一種異質(zhì)性疾病,位列全球第2大腫瘤,每年約有220萬新發(fā)病例,68萬死亡病例[1]。目前乳腺癌的治療方法包括手術(shù)、放療、化療、內(nèi)分泌治療、靶向治療和免疫治療[2]。雖然這些治療方法明顯改善了乳腺癌患者的疾病進(jìn)展、復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)、總體生存率,但由于其異質(zhì)性,部分患者療效顯著,部分患者療效卻不明顯。此外,藥物抵抗、腫瘤轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)嚴(yán)重威脅著患者的長期生存狀況。

人類轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究顯示,超過50%的轉(zhuǎn)錄本沒有蛋白編碼能力,長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,LncRNA)在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后及染色體水平調(diào)控基因的表達(dá),影響機(jī)體生理、病理進(jìn)程[3]。LncRNA存在于外泌體、凋亡小體等囊泡結(jié)構(gòu)中,或與某些蛋白結(jié)合分泌至血清、尿液和其他體液中。有研究顯示,LncRNA同源異型盒基因B-AS1(HOXB-AS1)在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)上調(diào),但在乳腺癌組織及乳腺癌細(xì)胞MCF-7、T47-D中的表達(dá)下調(diào)[4-6]。但HOXB-AS1在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用目前仍不清楚。本文旨在探討HOXB-AS1對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖、侵襲、遷移、凋亡的影響,以及對(duì)Akt/mTOR通路介導(dǎo)自噬的影響。

1 研究材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的來源

人乳腺癌MCF-7細(xì)胞于2020年6月20購自中國科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心。

1.1.2 藥品和試劑

MEM培養(yǎng)基(Hyclone);胎牛血清(fatal bovine serun,FBS)(Gibco);青霉素-鏈霉素溶液、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、胰酶細(xì)胞消化液、RIPA裂解液、磷酸酶抑制劑混合物、蛋白酶抑制劑混合物、CCK-8試劑(碧云天);BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、loading buffer、ECL超敏發(fā)光液、RNA提取試劑及逆轉(zhuǎn)錄試劑(Solarbio);SYBR Select Master Mix試劑盒(ThermoFisher Scientific);基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)-2、MMP-9、微管相關(guān)蛋白1A/1B-輕鏈3α(microtubule associated protein 1 light chain 3 alpha,LC3A)、磷酸化蛋白激酶B(phosphor-protein kinase B,p-Akt)、Akt、磷酸化雷帕霉素靶蛋白(phosphor-mammalian target of rapamycin,p-mTOR)、mTOR、糖酵解酶3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase,GAPDH)兔單克隆抗體(CST);p62兔多克隆抗體(abcam);HOXB-AS1過表達(dá)質(zhì)粒(上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司);Lipofectamine 3000(Thermo Fisher Scientific)。

1.2 方法

1.2.1 乳腺癌MCF-7細(xì)胞的培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分組

將MCF-7細(xì)胞置于含有10% FBS的MEM培養(yǎng)基中,在37℃的5% CO2孵育箱中培養(yǎng)。將MCF-7分為對(duì)照組(Con組,n=3)、陰性對(duì)照組(NC組,n=3)和HOXB-AS1過表達(dá)組(HOXB-AS1組,n=3)。使用Lipofectamine 3000將陰性對(duì)照質(zhì)粒和HOXB-AS1分別轉(zhuǎn)染至NC組和HOXB-AS1組的MCF-7細(xì)胞。對(duì)照組的MCF-7細(xì)胞不做處理,NC組和HOXB-AS1組的MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后進(jìn)行其他處理。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖活力

將MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染處理后,接種至96孔板,密度為104個(gè)/孔。然后將MCF-7細(xì)胞放回孵育箱培養(yǎng)24h,加入細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑(CCK-8)10μL/孔,繼續(xù)孵育1h。在450nM處測(cè)定其吸光度(OD)值。

細(xì)胞增殖活力=(處理孔OD-對(duì)照孔OD)/對(duì)照孔OD×100%。

1.2.3 乳腺癌MCF-7細(xì)胞的遷移實(shí)驗(yàn)

MCF-7細(xì)胞分組處理同1.2.1,將MCF-7細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中,細(xì)胞貼壁后加入絲裂霉素處理。當(dāng)MCF-7細(xì)胞融合達(dá)到90%后,用200μL的移液槍槍頭進(jìn)行細(xì)胞劃痕,磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗,去除漂浮細(xì)胞,然后再無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng),24h后計(jì)算細(xì)胞遷移率。

細(xì)胞遷移率=(0h劃痕寬度-24h劃痕寬度)/0h劃痕寬度×100%。

1.2.4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的侵襲

將0.5%的Matrigel基質(zhì)膠加入Transwell小室中,37℃孵育2h。將MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染處理后,用不含F(xiàn)BS的MEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,取MCF-7細(xì)胞懸液(2×104個(gè)細(xì)胞)接種至Transwell小室上室;然后將含有10% FBS的MEM培養(yǎng)基加入下室中。將MCF-7細(xì)胞繼續(xù)孵育24h后,取出Transwell小室,用95%的乙醇洗滌,并用多聚甲醛固定細(xì)胞。漂洗后用0.5%結(jié)晶紫染色,并用棉簽擦去上室中的細(xì)胞,拍照計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的凋亡

將MCF-7細(xì)胞按105個(gè)/孔接種至6cm培養(yǎng)皿中,轉(zhuǎn)染處理后收集各組MCF-7細(xì)胞。MCF-7細(xì)胞用0.01mol/L的PBS漂洗后,加入1×Binding buffer重懸細(xì)胞。加入Annexin-FITC和PI染色液各5μL混勻,室溫避光孵育10min。在1h內(nèi)使用BD AccuriC6流式細(xì)胞儀采集MCF-7細(xì)胞數(shù)據(jù)。

1.2.6 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MMP-2、MMP-9、自噬及Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

收集Con組、NC組和HOXB-AS1組的MCF-7細(xì)胞,使用RIPA裂解液冰上裂解細(xì)胞提取總蛋白,通過BCA法測(cè)定蛋白濃度,將樣本95℃水浴處理5min變性;取40μg蛋白樣品進(jìn)行8%～10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。濕法轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上,用5%脫脂牛奶室溫封閉1h,加入MMP-2、MMP-9、LC3A、Beclin 1、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR、GAPDH、p62抗體4℃過夜;再加入二抗室溫孵育1h,用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。

1.2.7 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)HOXB-AS1基因的表達(dá)

使用TRIzol提取MCF-7細(xì)胞的總RNA,并進(jìn)行RNA定量。取1μg總RNA使用UEIris Ⅱ RT-PCR System進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄以得到cDNA。利用SYBR Select Master Mix試劑盒在ABI 7900儀器上進(jìn)行實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)實(shí)驗(yàn)。采用2-ΔΔCt計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

引物序列:

HOXB-AS1:5′-GGGGACTCCAGCGAAAT-3′(forward),5′-ACCCGAAGCCCAACCAC-3′(reverse);GAPDH:5′-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′(forward),5′-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′(reverse)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組LncRNA HOXB-AS1相對(duì)表達(dá)量情況

qRT-PCR實(shí)驗(yàn)顯示,乳腺癌MCF-7細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后,Con組的LncRNA HOXB-AS1相對(duì)表達(dá)量為0.15±0.05、NC組為0.13±0.03、HOXB-AS1組為0.75±0.04,HOXB-AS1組的LncRNA HOXB-AS1相對(duì)表達(dá)量顯著高于Con組和NC組(t=16.030,P=0.000),見圖1。

圖1 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MCF-7細(xì)胞中LncRNA HOXB-AS1相對(duì)表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)

2.2 各組HOXB-AS1對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的影響

MCF-7細(xì)胞經(jīng)HOXB-AS1處理24h后,CCK-8法檢測(cè)顯示,Con組的MCF-7細(xì)胞活力為(100.00±9.13)%、NC組為(100.00±2.94)%、HOXB-AS1組為(60.50±5.72)%,HOXB-AS1組的MCF-7細(xì)胞活力顯著低于Con組和NC組(t=7.428,P=0.000),見圖2。

圖2 CCK-8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染HOXB-AS1后MCF-7細(xì)胞增殖活力的統(tǒng)計(jì)

2.3 各組HOXB-AS1對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞遷移和侵襲的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)顯示,轉(zhuǎn)染HOXB-AS1后,Con組的劃痕愈合速度為(61.00±3.61)%、NC組為(59.83±2.26)%、HOXB-AS1組為(39.03±3.61)%,HOXB-AS1組的劃痕愈合速度顯著低于Con組和NC組(t=16.090,P=0.002),即MCF-7細(xì)胞遷移能力減弱,見圖3。

注:A圖為各組劃痕實(shí)驗(yàn);B圖為各組遷移率的統(tǒng)計(jì)。

Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)顯示,轉(zhuǎn)染HOXB-AS1后下調(diào)了MCF-7細(xì)胞遷移標(biāo)志蛋白MMP-2和MMP-9的表達(dá),見圖4。

Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)顯示,轉(zhuǎn)染HOXB-AS1后,Con組的MCF-7細(xì)胞侵襲數(shù)為(343.36±20.82)個(gè)、NC組為(316.00±29.46)個(gè)、HOXB-AS1組為(105.02±15.00)個(gè),HOXB-AS1組的MCF-7細(xì)胞侵襲數(shù)顯著低于Con組和NC組(t=16.093,P=0.000),見圖5。

注:A圖為Transwell實(shí)驗(yàn);B圖為MCF-7侵襲細(xì)胞數(shù)的統(tǒng)計(jì)。

2.4 各組HOXB-AS1對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示,轉(zhuǎn)染HOXB-AS1后,Con組的MCF-7細(xì)胞凋亡率為(93.47±4.72)%、NC組為(90.67±7.37)%、HOXB-AS1組為(31.33±2.59)%,HOXB-AS1組的MCF-7細(xì)胞凋亡率顯著低于Con組和NC組(t=19.992,P=0.000),見圖6,圖中Annexin V+/PI+為晚期凋亡細(xì)胞或壞死細(xì)胞;Annexin V+/PI-為早期凋亡細(xì)胞。

注:A圖為流式細(xì)胞檢測(cè);B圖為MCF-7細(xì)胞凋亡的統(tǒng)計(jì)。

2.5 HOXB-AS1對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的Akt/mTOR介導(dǎo)自噬信號(hào)通路的影響

采用Western blot法檢測(cè)HOXB-AS1對(duì)MCF-7細(xì)胞的Akt/mTOR信號(hào)通路的影響,結(jié)果顯示,HOXB-AS1組的LC3B顯著高于Con組和NC組,HOXB-AS1組的p62顯著低于Con組和NC組,HOXB-AS1組的Beclin 1顯著高于Con組和NC組,HOXB-AS1組的p-Akt顯著低于Con組和NC組,HOXB-AS1組的p-mTOR顯著低于Con組和NC組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);HOXB-AS1組的Akt、mTOR與Con組和NC組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1、圖7。

表1 Con組和NC組及HOXB-AS1組Western blot法檢測(cè)各指標(biāo)的比較

圖7 Western blot法檢測(cè)HOXB-AS1對(duì)MCF-7細(xì)胞的Akt/mTOR信號(hào)通路的影響

HOXB-AS1降低了p-Akt(Con組為1.49±0.19,HOXB-AS1組為0.89±0.23)、p-mTOR(Con組為1.26±0.12,HOXB-AS1組為0.45±0.19)蛋白的表達(dá),上調(diào)了自噬相關(guān)蛋白Beclin 1(Con組為0.43±0.11,HOXB-AS1組為1.09±0.22)、LC3B(Con組為1.06±0.18,HOXB-AS1組為1.75±0.16)的表達(dá),下調(diào)了自噬相關(guān)蛋白p62(Con組為2.06±0.16,HOXB-AS1組為1.68±0.23)的表達(dá),增強(qiáng)了MCF-7細(xì)胞的自噬活性。

3 討論

3.1 HOXB-AS1與乳腺癌的關(guān)系

編碼轉(zhuǎn)錄因子的同源異形盒(homeobox,HOX)基因是生物體內(nèi)重要的發(fā)育調(diào)控基因家族。HOX基因高度保守,編碼一類轉(zhuǎn)錄因子,在胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要調(diào)控作用,哺乳動(dòng)物HOX家族有A、B、C、D亞族,HOXB-AS1為A亞族的一個(gè)亞型[7]。研究發(fā)現(xiàn)HOXB-AS1在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)上調(diào),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移[5-6]。但HOXB-AS1在乳腺癌組織及乳腺癌MCF-7、T-47D細(xì)胞中的表達(dá)顯著下調(diào)[4]。HOXB-AS1在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用目前仍不清楚。

本研究顯示,上調(diào)HOXB-AS1的表達(dá),乳腺癌MCF-7細(xì)胞的活力顯著降低,MMP-2、MMP-9的表達(dá)水平顯著下降,細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量顯著降低。MMP-2和MMP-9可以降解細(xì)胞外基質(zhì),與細(xì)胞的遷移、侵襲相關(guān)。此外,流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示,HOXB-AS1高表達(dá)促進(jìn)了MCF-7細(xì)胞的凋亡。這說明HOXB-AS1可抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移及促進(jìn)凋亡。

3.2 HOXB-AS1與乳腺癌MCF-7細(xì)胞自噬的關(guān)系

自噬是受損、變性或衰老的蛋白質(zhì)及細(xì)胞器被溶酶體降解的過程。自噬標(biāo)志物如Beclin 1影響著自噬囊泡的成核過程;LC3B在自噬體的延伸和成熟中發(fā)揮著重要作用;p62作為腳手架蛋白將泛素化蛋白運(yùn)輸至自噬體。自噬在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用,Beclin 1是一種腫瘤抑制因子,在乳腺癌中的表達(dá)降低,與有絲分裂有關(guān)[8]。本研究結(jié)果顯示,HOXB-AS1促進(jìn)了Beclin 1的表達(dá)。LC3B與自噬小體的數(shù)量正相關(guān);p62是一種多聚泛素化蛋白包含LC3B相互作用序列和泛素化結(jié)合位點(diǎn),將泛素化底物和其結(jié)合蛋白運(yùn)輸至自噬體降解,因此,自噬過程中p62和LC3B的表達(dá)水平呈相反的趨勢(shì)[9]。轉(zhuǎn)染HOXB-AS1后,LC3B表達(dá)水平上調(diào),p62表達(dá)下調(diào)。這說明HOXB-AS1誘導(dǎo)了乳腺癌MCF-7細(xì)胞的自噬。

3.3 Akt/mTOR通路與乳腺癌MCF-7細(xì)胞的關(guān)系

Akt/mTOR通路在諸多腫瘤中被激活,抑制該通路導(dǎo)致細(xì)胞活力降低及促進(jìn)細(xì)胞死亡(包括凋亡和自噬)[10]。本研究顯示,HOXB-AS1降低了p-Akt和p-mTOR的表達(dá),抑制了Akt/mTOR通路的活化,誘導(dǎo)了MCF-7細(xì)胞發(fā)生明顯的凋亡和自噬。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)HOXB-AS1通過Akt-mTOR通路介導(dǎo)了MCF-7細(xì)胞的凋亡和自噬,抑制其增殖、侵襲、遷移及促進(jìn)凋亡。LncRNA是MCF-7細(xì)胞中信號(hào)通路的重要調(diào)節(jié)因子,包括mRNA的穩(wěn)定及運(yùn)輸及miRNA的表達(dá)[11]。HOXB-AS1如何作用于下游靶點(diǎn)影響MCF-7細(xì)胞的死亡仍需進(jìn)一步的研究探討。