張麗麗,林慧晶,吳明赴,季正華,李曉忠

(1.揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院,江蘇 揚(yáng)州 225000;2.蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院,江蘇 蘇州 215003)

過敏性紫癜(henoch-schonlein purpura,HSP)是一種免疫性血管炎疾病,兒童期最常見[1-2];全年可發(fā)病,且春季多發(fā),男多于女[3]。HSP以皮膚或黏膜下出血、皮膚紫癜(鮮紅或紫紅色)為主要臨床特征,雙下肢和臀部最多見,部分同時存在腹痛、便血、腎損害癥狀及蕁麻疹等多系統(tǒng)疾病[4-5]。HSP屬于良性疾病,具有自限性,病情一般6～8周逐漸緩解,大多數(shù)患兒預(yù)后良好;但該病易反復(fù)發(fā)作,機(jī)體易受免疫應(yīng)答及炎性反應(yīng)損傷而累及腎臟,嚴(yán)重者甚至?xí)l(fā)生急性腎功能衰竭[6]。

HSP發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且尚未明確。相關(guān)研究表明,外周血T淋巴細(xì)胞亞群在其中發(fā)揮了重要作用[7],其為臨床早期治療HSP患兒提供了依據(jù)。既往研究大多是關(guān)于HSP嚴(yán)重程度與輔助性T淋巴細(xì)胞(helper T lymphocytes,Th)變化的關(guān)系,尚未見與調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(regulatory T lymphocytes,Treg)變化的相關(guān)研究。本研究對150例HSP患兒的一般資料和實驗室指標(biāo)進(jìn)行了數(shù)據(jù)分析,以進(jìn)一步明確Th和Treg的變化與HSP嚴(yán)重程度的關(guān)系,為早期干預(yù)治療提供理論參考,從而避免和減緩病情的發(fā)展,改善患兒的預(yù)后。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

選擇2018年1月至2021年1月蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院收治的150例HSP患兒為研究對象,其中男87例,女63例;年齡為5～14歲,平均(9.50±1.40)歲;皮膚型56例,腹型35例,關(guān)節(jié)型17例,腎型24例,混合型18例。根據(jù)HSP癥狀積分[8]將患兒分為輕度組(<33分,50例)、中度組(33～67分,56例)、重度組(>67分,44例)。另選擇同期于門診進(jìn)行體檢的150例健康兒童為對照組,其中男89例,女61例;年齡為5～14歲,平均(9.33±1.74)歲。

納入標(biāo)準(zhǔn):①符合HSP診斷標(biāo)準(zhǔn)[9];②初次發(fā)病;③近2周內(nèi)未使用過激素及其他免疫抑制劑治療。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并嚴(yán)重感染性疾病;②合并其他免疫系統(tǒng)性疾病;③合并心、肝、肺等重要臟器功能障礙。

本研究經(jīng)蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院倫理委員會審批(批準(zhǔn)號:20201112),患兒家屬均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 資料的收集

收集患兒的年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)、HSP類型、過敏原類型、首發(fā)癥狀、皮膚紫癜持續(xù)時間、HSP癥狀積分等臨床資料。

1.2.2 實驗室指標(biāo)的測定

清晨空腹?fàn)顟B(tài)下取肘靜脈血3mL,離心,血清保存于-80℃冰箱待檢。①采用全自動血液分析儀(Sysmex CS-5100)檢測外周血白細(xì)胞計數(shù)(white blood cell count,WBC)、C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)及D-二聚體(D-Dimer,D-D)水平;采用日立7600-010生化分析儀檢測血肌酐(serum creatinine,SCr)水平。②采用酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)雙抗體夾心法檢測樣本血清中白細(xì)胞介素-21(interleukin-21,IL-21)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平。③利用免疫比濁法(儀器ADVIA2400,西門子公司)測定血清中免疫球蛋白A(immunoglobulin A,IgA)、免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)、免疫球蛋白M(immunoglobulin M,IgM)水平。④采用流式細(xì)胞儀(BD公司,美國)分析樣本T淋巴細(xì)胞亞群,分別取CD3-PC5、D8-PE、CD4-PE、CD19-Percp、CD11b-PE、CD5-APC鼠抗人單克隆抗體(BD公司,美國)各10μL,加入肝素抗凝血50μL,混勻后室溫暗處放置20min,分別加入紅細(xì)胞裂解液混勻,在流式細(xì)胞儀上計數(shù)5×104以上細(xì)胞,分別記錄Th(CD3+CD4+)、Treg(CD4+CD25+)的陽性率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組兒童的臨床資料

輕度組、中度組、重度組、對照組兒童的年齡、性別、BMI比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性,見表1。

表1 各組兒童臨床資料的比較

2.2 不同病情程度HSP患兒的臨床癥狀

輕度組、中度組、重度組患兒皮膚紫癜持續(xù)時間>28d的比例比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),隨著HSP病情的加重,患兒皮膚紫癜持續(xù)時間>28d的比例有所增高;不同病情程度患兒HSP類型、過敏原類型(吸入性和食入性)及首發(fā)癥狀的比例比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表2。

2.3 各組兒童的實驗室指標(biāo)

輕度組、中度組、重度組、對照組兒童的WBC、CRP、D-D、IgA、CD3+CD4+、CD4+CD25+、IL-21、TGF-β1及TNF-α水平比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),隨著HSP病情的加重,WBC、CRP、D-D、IgA、TGF-β1及TNF-α水平均有所升高,而CD3+CD4+、CD4+CD25+及IL-21水平均有所降低,組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);輕度組、中度組、重度組、對照組兒童的SCr、IgG、IgM水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表3。

表3 各組兒童實驗室指標(biāo)的比較

2.4 曲線擬合及閾值效應(yīng)分析

在調(diào)整年齡、性別、BMI后,經(jīng)曲線擬合發(fā)現(xiàn),隨著CD3+CD4+和CD4+CD25+水平的升高,HSP癥狀積分呈下降趨勢,見圖1。在曲線擬合的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步進(jìn)行閾值效應(yīng)分析發(fā)現(xiàn),當(dāng)CD3+CD4+>37.3%時,隨著CD3+CD4+水平升高,HSP癥狀積分未受影響,其OR=1.000(95%CI:0.991～1.015,P=0.368),當(dāng)CD3+CD4+<37.3%時,隨著CD3+CD4+水平升高,HSP癥狀積分呈下降趨勢,其OR=0.962(95%CI:0.947～0.977,P<0.001);當(dāng)CD4+CD25+>10.2%時,隨著CD4+CD25+水平升高,HSP癥狀積分未受影響,其OR=1.000(95%CI:0.998～1.003,P=0.347),當(dāng)CD4+CD25+<10.2%時,隨著CD4+CD25+水平升高,HSP癥狀積分呈下降趨勢,其OR=0.976(95%CI:0.953～0.998,P<0.001)。

圖1 CD3+CD4+、CD4+CD25+與HSP癥狀積分的曲線擬合分析

2.5 影響HSP加重的多因素Logistic回歸分析

以前述分析中(表1～表3)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)的各項指標(biāo)為自變量,以重度HSP為因變量,納入LASSO模型進(jìn)行分析,最佳λ值通過交叉驗證法選擇,折疊10次。以λ的對數(shù)值為下方橫坐標(biāo),以進(jìn)入模型的非零系數(shù)變量的個數(shù)為上方橫坐標(biāo),以標(biāo)準(zhǔn)誤為縱坐標(biāo),然后利用標(biāo)準(zhǔn)誤最小的λ值篩選用于構(gòu)建LASSO回歸模型的因素,見圖2A;自變量系數(shù)隨λ值變化,λ值越大,模型壓縮程度越大,進(jìn)入模型的自變量個數(shù)越少,模型的選擇功能越強(qiáng),見圖2B。本研究選擇λ值為0.009時性能最優(yōu)且納入變量最少,此時納入的變量包括CRP、D-D、IgA、CD3+CD4+、CD4+CD25+、IL-21、TGF-β1及TNF-α。

注:A圖為LASSO模型中最佳λ值的判定使用10折交叉驗證和最小準(zhǔn)則;B圖為患兒臨床特征的LASSO模型系數(shù)曲線。

以LASSO模型分析中篩選出的8個非零特征預(yù)測因子為自變量,以重度HSP為因變量,進(jìn)行多因素Logistic回歸分析,結(jié)果顯示,CRP>12.4mg/L、D-D>3.4mg/L、IgA>2.3g/L、TGF-β1≥6.5pg/mL及TNF-α≥14.5pg/mL均為發(fā)生重度HSP的獨立危險因素(P<0.05);CD3+CD4+≥32%、CD4+CD25+≥7%及IL-21≥23.1pg/mL均為獨立保護(hù)因素(P<0.05),見表4、表5。

表4 多因素Logistic回歸分析賦值表

表5 多因素Logistic回歸分析

2.6 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建

將前述影響發(fā)生重度HSP的獨立危險因素作為輸入層納入BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型,采用反復(fù)交叉驗證確定隱含層節(jié)點數(shù),當(dāng)隱含層節(jié)點數(shù)為4時,交叉驗證的均方根誤差最小,見圖3;以HSP嚴(yán)重程度作為輸出層,構(gòu)建BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型,見圖4。對BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型變量重要性評分進(jìn)行排序,其中CRP(0.160分)、D-D(0.154分)、CD3+CD4+(0.135分)、CD4+CD25+(0.130分)對模型分類的貢獻(xiàn)度較高,IgA(0.100分)、IL-21(0.096分)、TGF-β1(0.114分)、TNF-α(0.111分)也能在一定程度上影響模型的分類結(jié)果。

圖3 交叉驗證確定隱含層節(jié)點數(shù)

圖4 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型

2.7 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的評價

2.7.1 模型區(qū)分度的評價

采用Bootstrap自抽樣法進(jìn)行內(nèi)部驗證,結(jié)果顯示,該預(yù)測模型C-index為0.801(95%CI:0.714～0.888),ROC曲線下面積為0.820(95%CI:0.731～0.909),P<0.05,表明該預(yù)測模型的區(qū)分度尚可,見圖5。

圖5 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的ROC曲線

2.7.2 模型校準(zhǔn)度的評價

繪制預(yù)測模型的校準(zhǔn)曲線,結(jié)果顯示,模型預(yù)測重度HSP發(fā)生概率與實際概率擬合度良好,Hosmer-Lemeshow擬合優(yōu)度檢驗結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),表明該預(yù)測模型的準(zhǔn)確度較高,見圖6。

圖6 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的校準(zhǔn)曲線

2.7.3 模型有效性的評價

預(yù)測模型的DCA曲線閾值概率為0.01～0.92,凈獲益率>0,表明其有效性較好,安全可靠,實用性強(qiáng),見圖7。

圖7 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的DCA曲線

3 討論

HSP發(fā)病呈全球性,不同區(qū)域和種族存在差異,學(xué)齡期高發(fā),6～10歲的兒童約占90%[10-11]。近年來,HSP發(fā)病率逐年上升,首發(fā)癥狀一般為皮膚紫癜,嚴(yán)重的可引起各系統(tǒng)并發(fā)癥[12]。目前,臨床大多依靠患兒的臨床癥狀和體征進(jìn)行診療,以及判斷疾病的活動性,尚缺乏明確性的實驗室診斷指標(biāo)。因此,對于不典型癥狀者,易因誤診而延誤病情。隨著研究的深入,大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為HSP發(fā)病涉及T淋巴細(xì)胞亞群、細(xì)胞因子、凝血機(jī)制和炎性因子異常等情況,但主要發(fā)病機(jī)制仍是免疫應(yīng)答介導(dǎo)的血管炎[13-14]。

3.1 HSP患兒的機(jī)體免疫和體液功能分析

相關(guān)研究表明,HSP發(fā)病與人類白細(xì)胞抗原和家庭性地中?；蛎芮邢嚓P(guān),帶有上述基因的兒童,一旦受到致病因子侵襲,便會造成呼吸及黏膜系統(tǒng)損傷,激活T淋巴細(xì)胞亞群,進(jìn)一步導(dǎo)致機(jī)體免疫和體液功能發(fā)生紊亂[15]。T淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫的核心部分,在抗原物質(zhì)刺激下,可引起T淋巴細(xì)胞亞群失衡加重、免疫功能紊亂及組織炎性因子分泌失衡,產(chǎn)生相應(yīng)抗體,使得血清中免疫球蛋白水平升高[16]。本研究顯示,隨著HSP患兒病情加重,IgA、TGF-β1、TNF-α水平均升高,IL-21水平降低,表明HSP病情加重,機(jī)體細(xì)胞和體液免疫系統(tǒng)紊亂。抗原進(jìn)入黏膜,激發(fā)黏膜免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫反應(yīng),從而使IgA增多。血清中清除IgA的可能機(jī)制為,肝細(xì)胞表面的脫唾液酸糖蛋白受體特異性識別并結(jié)合半乳糖基可清除IgA分子,而其低糖基化使得脫唾液酸糖蛋白受體減少,導(dǎo)致IgA增加。免疫系統(tǒng)紊亂使得組織炎性介質(zhì)分泌失控,TNF-α為促炎性因子,參與發(fā)病過程,可能是HSP病理損傷的重要因素之一;TGF-β1為抑炎性因子,發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用,二者相互制約和調(diào)節(jié);而IL-21水平下降,表明T淋巴細(xì)胞分泌IL-21受到抑制,但I(xiàn)L-21分泌不足的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

3.2 HSP患兒的CD3+CD4+和CD4+CD25+水平分析

相關(guān)研究表明,HSP的發(fā)病主要是由機(jī)體免疫功能紊亂所導(dǎo)致,在發(fā)病初期,患者存在顯著的免疫失衡[17]。高婧等[8]研究表明,隨著HSP病情加重,CD3+CD4+水平下降。本研究顯示,隨著HSP病情加重,CD3+CD4+、CD4+CD25+水平均降低,Th(CD3+CD4+)通過釋放細(xì)胞輔助因子促進(jìn)效應(yīng)T細(xì)胞活化,進(jìn)而促使體液及細(xì)胞免疫作用調(diào)節(jié)或增強(qiáng)機(jī)體免疫功能,其減少表明患兒此刻機(jī)體免疫功能降低;Treg(CD4+CD25+)具有免疫抑制和調(diào)節(jié)的功能,是機(jī)體維持自身免疫耐受的重要組成部分,其減少會導(dǎo)致免疫抑制效應(yīng)不足,這可能是HSP發(fā)病初期機(jī)體免疫失衡的重要原因。

3.3 HSP患兒的凝血功能和炎性因子水平分析

本研究顯示,D-D和CRP也是影響患兒病情程度的重要因素。D-D是凝血功能異常的重要指標(biāo),可表明是否存在血栓的形成,對HSP病情的評估具有十分重要的意義。CRP是一種急性時相蛋白,與急性感染、組織損傷、心血管疾病等密切相關(guān);在發(fā)病急性期,血清中CRP水平迅速上升,病情緩解時,其水平又迅速下降,因此其常作為一種疾病活動時篩查指標(biāo)。本研究表明,隨著HSP病情加重,D-D、CRP水平均升高。劉鈞菲等[18]研究顯示,D-D水平越高,HSP病情越重;其表明HSP患兒的血漿D-D水平與疾病發(fā)展密切相關(guān),提示在臨床治療時,醫(yī)護(hù)人員應(yīng)密切監(jiān)測患兒的D-D水平,以判斷病情的進(jìn)展情況。HSP屬毛細(xì)血管變態(tài)反應(yīng)性疾病,炎癥常累及其他器官,如關(guān)節(jié)、腎臟等。當(dāng)HSP病情加重,免疫功能失衡,肝細(xì)胞產(chǎn)生CRP且大量釋放進(jìn)入血液,促進(jìn)炎性因子TNF-α分泌,加強(qiáng)機(jī)體免疫功能。

基于多因素分析結(jié)果,本研究構(gòu)建了BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型,當(dāng)隱含層節(jié)點數(shù)為4時,誤差最小,其中CRP(0.160分)、D-D(0.154分)、CD3+CD4+(0.135分)、CD4+CD25+(0.130分)對模型分類的貢獻(xiàn)度較高。ROC曲線、校準(zhǔn)曲線和DCA曲線顯示,該預(yù)測模型的區(qū)分度及準(zhǔn)確性和有效性均較高。

3.4 本研究的局限性

本研究為回顧性分析,具有一定的局限性,納入病歷數(shù)目較少。但隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展,相信有針對性的前瞻性、大樣本量研究可為臨床治療HSP提供更高級別的醫(yī)學(xué)證據(jù)。

綜上所述,CD3+CD4+、CD4+CD25+水平異常變化與HSP癥狀積分密切相關(guān),隨著患兒HSP病情進(jìn)展,CD3+CD4+、CD4+CD25+水平明顯降低;CRP>12.4mg/L、D-D>3.4mg/L、IgA>2.3g/L、TGF-β1≥6.5pg/mL及TNF-α≥14.5pg/mL均為發(fā)生重度HSP的獨立危險因素,CD3+CD4+≥32%、CD4+CD25+≥7%及IL-21≥23.1pg/mL均為獨立保護(hù)因素。臨床醫(yī)護(hù)人員應(yīng)密切關(guān)注相關(guān)指標(biāo),對HSP患兒做到早發(fā)現(xiàn)、早診治,改善其預(yù)后。