屈學斌，廖文力，盧允健，黎燦文，李靄燕

（1.廣州市番禺區(qū)中醫(yī)院，廣東 廣州 511400 ；2.廣州市番禺區(qū)第五人民醫(yī)院，廣東 廣州 511495）

功能性消化不良是臨床上常見的消化系統疾病之一。此病的發(fā)病率較高。據統計，在世界范圍內，功能性消化不良的發(fā)病率達到了20.8%[1]。雖然功能性消化不良不會嚴重威脅患者的生命，但它會嚴重影響患者的生活質量[2]。有研究指出，功能性消化不良的病機主要是脾虛氣滯，中醫(yī)認為氣機失調與胃腸動力紊亂密切相關，而健脾理氣對增強胃動力有顯著作用[3]。香砂六君子湯是健脾理氣方中最有代表性的一種藥方。大量臨床觀察證實，香砂六君子湯治療功能性消化不良在緩解癥狀和降低復發(fā)率方面具有一定優(yōu)勢[4-5]。丁伯龍[6]的研究顯示，香砂六君子湯可通過調控內質網應激信號通路 PERK/eIF2α 來改善胃腸運動障礙，治療脾氣虛證。非藥物治療功能性消化不良，如艾灸治療功能性消化不良的療效顯著，應用前景廣闊，顯示了中醫(yī)治療的獨特優(yōu)勢[7]。溫和的艾灸既能促進胃的運動，調節(jié)胃腸蠕動，又能改變神經細胞的可塑性，調節(jié)相關蛋白和細胞因子的表達；其起效機制較為復雜。相關研究表明，艾灸足三里在治療功能性消化不良方面的臨床療效和安全性優(yōu)于西醫(yī)療法，且在改善患者生活質量方面具有獨特的優(yōu)勢[8]。吳陽陽等[9]發(fā)現，針灸“曲池”和“足三里”可以通過抑制氧化應激和內質網應激來緩解腸道疾病。已有大量研究顯示，持續(xù)的內質網應激可通過P-EIF2α誘導ATF4 的翻譯過程，而ATF4 可導致促凋亡基因CHOP 表達的升高，從而促使細胞死亡[10]。由此可見，PERK/EIF2α 是細胞凋亡或由內質網應激產生自噬的共同途徑[11]。因此，推測香砂六君子湯聯合溫針灸足三里治療功能性消化不良的作用機制可能與內質網應激PERK/eIF2α 通路的調控有關。本研究以內質網應激的PERK-eIF2α 信號路徑為切入點，以大鼠為模型，對大鼠脾胃氣虛型功能性消化不良的調節(jié)機制和治療作用進行了研究。

1 實驗材料及主要試劑、耗材

1.1 大鼠模型建立及分組

選取SPF 級SD 大鼠60 只，在進行實驗前，給予3 d 適應性飼養(yǎng)，然后用隨機數表法分為正常組、模型組、西藥組、中藥組、溫針灸組、聯合組，每組10只。分別用苦味酸在各組實驗大鼠的皮毛上進行標識。除了正常組實驗鼠外，其余5 組實驗鼠根據改進的夾尾刺激法+不規(guī)則喂養(yǎng)+冷生理鹽水灌胃法建立功能性消化不良大鼠模型，即將同組實驗鼠放入同一籠中，用醫(yī)用紗布將長柄金屬鉗端部進行3 ～4 層緊密包裹，將包裹部分鉗夾在實驗鼠尾部后1/3 段，強度以刺激實驗鼠發(fā)出尖叫聲或打斗為宜，每次刺激30 min，每日早晚各1 次；用冷生理鹽水（2 mL）灌胃，每次早晚各1 次；同時，建模期間單日禁食，并在雙日內正常喂食。功能性消化不良大鼠建模成功的標準：實驗大鼠毛發(fā)干枯發(fā)黃、大便溏泄、進食量和體重明顯下降，情緒狀態(tài)由開始時的煩躁不安轉變?yōu)榫癫徽?、活動度減弱，隨機抽取1 只大鼠進行解剖，未發(fā)現其腸胃組織出現器質性病變。具體分組：正常組：10 只SPF級SD 鼠；模型組：10 只功能性消化不良大鼠；西藥組：10 只用多潘立酮藥液進行灌胃治療的功能性消化不良大鼠；中藥組：10 只用香砂六君子湯藥液進行灌胃治療的功能性消化不良大鼠；溫針灸組：10 只采用溫針灸療法進行治療的功能性消化不良大鼠；聯合組：10只聯合應用溫針灸+ 香砂六君子湯灌胃療法進行治療的功能性消化不良大鼠。溫針灸組的治療方法是：將大鼠的四肢固定在手術臺木板上，用電推刀剔除其下肢后關節(jié)外側（腓骨小頭前下方5 mm 處足三里穴區(qū)2 cm×2 cm 的位置）的鼠毛。剃凈后，先用華佗牌毫針直刺足三里穴，深度約為5 mm，以實驗大鼠能夠耐受為度，然后用特制的香煙型艾條在距離足三里穴2.0 cm 處進行懸灸，每次溫針灸15 min，每日一次，連續(xù)治療28 d。聯合組的治療方法是：使用香砂六君子湯（1.5 mL）進行灌胃，每日早晚各一次；溫針灸干預每日早上開展一次，連續(xù)治療28 d。

1.2 主要試劑

于武漢博士德生物工程有限公司采購多聚甲醛溶液；二甲苯、石蠟、蘇木素、伊紅、中性樹膠等購于上海國藥集團化學試劑有限公司；一抗（PERK 單克隆一抗、p-eIF2α 單克隆一抗）、二抗和SDS-PAGE電泳液等購于碧云天生物技術研究所。

2 實驗方法

2.1 測量大鼠的體重、胃排空率

在開始建模當日、建模第7 天、建模成功當日以及干預首日、第7 天、第14 天、第21 天、第28 天的早上7 點用電子秤稱量大鼠的體重。在末次灌胃干預后，實驗大鼠均禁食12 h（無需禁水），然后每只灌胃2 mL 的半固體米糊（將16 g 奶粉、8 g 淀粉、8 g 糖、10 g 羧甲基纖維素鈉、2 g 活性炭、250 mL蒸餾水混合均勻，配制為黑色半固體糊狀物，1 g/mL，放入冰箱冷藏，使用時先恢復室溫）。灌胃30 min 后，使用劑量為0.2 ～0.3 mL/100 g 的10%水合氯醛進行腹腔麻醉。麻醉起效后，將實驗大鼠固定在操作臺上，用酒精對腹部進行消毒，沿腹部正中線剖腹。找到胃部后，用縫合線結扎幽門、賁門，間斷結扎線外側。將胃部摘取下來。利用斷頭法處死大鼠，用電子天秤稱量全胃重。將胃體剪開后，檢測胃內容物；并用冷生理鹽水沖洗干凈，用濾紙擦干，觀察胃黏膜的表面有無潮紅、腫脹、潰瘍、糜爛等病理變化，并用電子秤稱量空胃重量。

2.2 大鼠胃竇組織組織形態(tài)的檢測方法

胃竇組織HE 染色：（1）固定：用眼科剪剪取實驗大鼠幽門上部的胃竇組織，置于含有4%多聚甲醛溶液的刻度管中固定24 h。（2）石蠟包埋：固定好胃竇組織后，進行酒精梯度脫水，依次放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中透明處理10 min。將其浸泡于已加熱溶解的液體石蠟中，并于60℃恒溫箱中浸蠟2 h。用石蠟包埋機包埋胃竇組織。（3）切片：將包埋的石蠟塊切成4 μm 石蠟切片，在溫水中展平，然后將其轉移到載玻片上，烤干待用。（4）染色：對切片進行脫蠟、酒精水化處理，然后將載玻片浸泡到蘇木素中染色5 min，洗滌后再放入0.5%伊紅溶液中復染2 min，用自來水沖洗后再進行脫水、烘干。在載玻片表面滴加中性樹膠，加蓋玻片，用光學顯微鏡觀察胃竇組織黏膜、腺體、肌層、黏膜層等的變化情況。

2.3 免疫組化檢測胃竇組織PERK、p-eIF2α 表達情況

具體方法：（1）抗原修復：切片行常規(guī)脫蠟水化，加入檸檬酸緩沖液中浸泡并加熱修復5 min。（2）封閉：在切片上滴加3% 過氧化氫溶液，避光10 min，再滴加山羊血清封閉，在室溫下孵育10 min。（3）滴加抗體：滴加一抗（PERK 單克隆一抗、p-eIF2α 單克隆一抗），然后滴加二抗，在37℃室溫環(huán)境中孵育15 min。（4）顯色復染：在切片上滴加100 μL 顯色劑顯色3 ～5 min 后用蒸餾水沖洗，并置于陳舊蘇木精溶液中浸泡1 min 復染，最后按照酒精梯度法對切片進行脫水，用中性樹膠封片。

2.4 Westernblot 檢測胃竇組織PERK、p-eIF2α、elF2α 蛋白相對表達量

具體步驟：（1）提取胃竇組織總蛋白：取適量胃竇組織，稱取其重量。按照1 mg 胃竇組織添加10 μL RIPA 裂解液的比例在EP 管中加入胃竇組織和裂解液，再添加PMSF（RIPA 裂解液:PMSF=100:1）。用組織剪剪碎胃竇組織，并用超聲波細胞破碎儀打碎組織，隨后將組織放在冰上裂解30 min，并進行低溫離心處理，吸取上清液，即得胃竇組織總蛋白標本。（2）檢測濃度：應用 Nanodrop 2000 分光光度計測量胃竇組織總蛋白質的濃度及其液體量。（3）SDS-PAGE 電泳：應用8% SDS-PAGE 分離膠配制PERK 分離膠，應 用12% 分 離 膠 配 制 p-eIF2α、elF2α、Tubulin分離膠，勻速緩慢注入玻璃板間隙中。然后制作 5%PERK、p-eIF2α、elF2α、Tubulin 濃縮膠，于分離膠上方的玻璃板間隙緩慢注入濃縮膠。最后上樣進行電泳操作。（4）轉膜：應用濕轉法對 PERK 蛋白進行轉膜，應用半干轉法對 p-eIF2α、elF2α、Tubulin蛋白進行轉膜。（5）封閉和雜交：取出 PVDF 膜，將其浸泡到5%脫脂奶粉封閉液中，常溫封閉1 h。然后，加入相應的一抗工作液（PERK、p-eIF2α、elF2α為目的蛋白，Tubulin 為內參蛋白），4℃孵育24 h。經 TBST 沖洗后，加入二抗，室溫孵育 2 h，用 TBST洗滌。（6）檢測：應用 Odyssey 掃膜儀掃膜，通過Odyssey 軟件進行定量分析，檢測條帶的灰度值。

3 實驗結果

3.1 實驗大鼠體重

在實驗第14 天、實驗第28 天，與正常組相比，模型組的體重均較小，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組相比，西藥組、中藥組、溫針灸組和聯合組的體重均較大，差異有統計學意義（P＜0.05）；與中藥組、溫針灸組相比，西藥組、聯合組的體重均較大，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 大鼠實驗不同天數的體重變化

3.2 實驗大鼠的胃排空率

根據下述公式計算胃排空率；胃排空率=[1-（全胃重- 空胃重）/ 所灌米糊重量]×100%。與正常組相比，模型組的胃排空率較低，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組相比，西藥組、中藥組、溫針灸組和聯合組的胃排空率均較高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與西藥組、中藥組、溫針灸組相比，聯合組的胃排空率較高，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 實驗大鼠的胃排空率（%，± s）

表1 實驗大鼠的胃排空率（%，± s）

分組 胃排空率 顯著性正常組 61.71±5.95模型組 40.02±7 01 與正常組比, P=0.004西藥組 55.18±6.90 與模型組比, P=0.021中藥組 53.33±4.25 與模型組比, P=0.018溫針灸組 56.25±9.51 與模型組比, P=0.011聯合組 63.86±4.67 與模型組比, P=0.003

3.3 胃竇組織形態(tài)學比較

由圖2 可以看出，正常組和聯合組的腺體排列規(guī)則，存在少量嗜酸性粒細胞、中性粒細胞及淋巴細胞；模型組可觀察到：少量嗜酸性粒細胞、大量淋巴細胞及中性粒細胞，腺體呈現不規(guī)則排列，其余則無明顯異常；西藥組、中藥組和溫針灸組可以觀察到：腺體排列尚規(guī)則，可見少量淋巴細胞、中性粒細胞，以及個別嗜酸性粒細胞，炎性細胞浸潤較模型組減輕。

圖2 組織病理學染色圖（×200）

3.4 免疫組化檢測胃竇組織PERK、p-eIF2α 表達情況

通過免疫組化檢測胃竇組織 PERK、p-eIF2α 表達情況，如圖3 和圖4 所示：與正常組比較，模型組大鼠胃竇組織的PERK、p-eIF2α 著色顯著降低；與模型組相比，西藥組、中藥組、溫針灸組、聯合組均表現為PERK、p-eIF2α 著色顯著增多。

圖3 免疫組化檢測胃竇組織 PERK 表達情況

圖4 免疫組化檢測胃竇組織 p-eIF2α 表達情況

3.5 Westernblot 檢測胃竇組織PERK、p-eIF2α、elF2α 蛋白相對表達量

由圖5 和圖6 可知，與正常組比較，模型組大鼠胃竇組織的PERK、p-eIF2α 蛋白表達顯著降低，eIF2α 蛋白表達升高；與模型組相比，西藥組、中藥組、溫針灸組、聯合組均表現為 PERK、p-eIF2α 蛋白表達顯著升高，eIF2α 蛋白表達降低，差異均具有統計學意義（* 表示P＜0.05 ；** 表示P＜0.001）。

圖5 Western blot 檢測大鼠胃竇組織PERK、p-eIF2α、elF2α蛋白相對表達量

圖6 Western blot 檢測大鼠胃竇組織PERK、p-eIF2α 蛋白相對表達量

4 結論

本研究發(fā)現溫針灸足三里+ 香砂六君子湯可以有效治療脾胃氣虛型功能性消化不良可能與其調節(jié)內質網應激PERK-eIF2α-ATF4 信號通路的作用有關。p-eIF2α 可誘發(fā)ATF4 的翻譯過程，促凋亡基因CHOP 通過ATF4 可上調其表達水平，進而可導致細胞死亡。上述研究結論為針藥治療功能性消化不良提供了堅實的理論基礎。