沈 艷，李文花，龍密密，譚玉潔

（1.六盤水市人民醫(yī)院檢驗科，貴州 六盤水 553000；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院臨床檢驗中心，貴州 貴陽 550004）

糖代謝異常（GM）是機體葡萄糖代謝出現(xiàn)異常的一類疾病，包括糖尿?。―M）前期和DM。DM 的發(fā)生與遺傳、環(huán)境及自身免疫等多種因素有關(guān)，但其具體病因目前尚未明確。近年來的研究表明，DM 是以高血糖為主要特征的低度炎癥性疾病[1]，而炎癥的發(fā)生與機體免疫狀態(tài)密切相關(guān)，已有文獻(xiàn)報道DM 的發(fā)生與免疫功能紊亂有關(guān)[2-3]。Th17 細(xì)胞是一種不同于Th1、Th2 的新型CD4+T 細(xì)胞，在各種傳染性疾病、癌癥和許多自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。Treg 細(xì)胞是一種具有免疫調(diào)節(jié)功能的免疫抑制性T 細(xì)胞，與多種免疫性疾病的發(fā)病機制或免疫狀態(tài)密切相關(guān)，在維持機體免疫穩(wěn)態(tài)和調(diào)控免疫應(yīng)答方面發(fā)揮著重要作用。Treg 細(xì)胞分泌的轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）細(xì)胞因子可促進(jìn)Th17 細(xì)胞的分化，提示Th17 細(xì)胞與Treg 細(xì)胞的分化存在密切的聯(lián)系。Th17細(xì)胞與Treg 細(xì)胞之間處于動態(tài)平衡狀態(tài)，若這種平衡狀態(tài)被打破則易發(fā)生炎癥及自身免疫性疾病。目前，DM 中關(guān)于Treg 細(xì)胞的研究尚存在爭議。本研究擬通過觀察GM 患者外周血Th17 細(xì)胞和Treg 細(xì)胞數(shù)量的變化，探討GM 時機體免疫功能及其平衡調(diào)節(jié)的變化情況，明晰相關(guān)免疫細(xì)胞在GM 發(fā)生發(fā)展中的作用，以期為GM 的發(fā)生機制及治療策略研究提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院門診及住院部的GM患者78 例為研究對象，其中男45 例，女33 例，年齡11 ～75 歲，平均年齡（47.53±15.68）歲。在這些患者中，有T1DM 患者18 例，DM 前期患者20 例，T2DM 初診患者20 例，T2DM 伴并發(fā)癥患者20 例。GM 分類符合1999 年世界衛(wèi)生組織（WHO）糖尿病專家委員會提出的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。對照組為我院同期健康體檢者20 例，其中男8 例，女12 例，年齡28 ～79 歲，平均年齡（46.15±13.44）歲。健康體檢者與GM 患者的性別及年齡相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 儀器與試劑

CD4-FITC、CD25-PE-Cy?7、IL-17A-PE、A-Fluor 647-CD127（均為鼠抗人），同型對照FITC Mouse IgG1，κ Isotype Control RUO、Alexa Fluor?647 Mouse IgG1 κ Isotype Control RUO、PE Mouse IgG1，κ Isotype Control RUO、PE-Cy ?7 Mouse IgG1 κ Isotype Control RUO，刺激劑+ 蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑，均為美國BD 公司生產(chǎn)。FACS Canto Ⅱ流式細(xì)胞儀由BD 公司制造。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集 所有研究對象均隔夜禁食8 ～12 h，采集清晨空腹靜脈血2 mL，置于EDTA-K2 真空抗凝采血管內(nèi)，混勻后于室溫下保存，用于檢測Treg 細(xì)胞和Th17 細(xì)胞的表達(dá)。

1.3.2 Treg 細(xì) 胞 檢 測 取CD4-FITC、A-Fluor 647-CD127 各5 μL、CD25-PE-Cy?7 1.25 μL，加 入50 μL EDTA-K2 抗凝血，震蕩混勻后于室溫下避光孵育30 min。加入溶血素1 mL，震蕩混勻后于室溫下溶血5 min，然后再置于37 ℃恒溫水浴箱中溶

血5 min。待血融透后，加入3 mL PBS，震蕩混勻后用低速離心機以1500 r/min 的轉(zhuǎn)速離心5 min，洗滌兩次，加入0.3 mL PBS 重懸細(xì)胞，混勻后上機檢測。收集20 000 個淋巴細(xì)胞，采用Flowj0 7.6 軟件分析CD4+CD25+CD127low 細(xì)胞占CD4+T 細(xì)胞的百分比（Treg/CD4+T%）。

1.3.3 Th17 細(xì)胞檢測 用人淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個核細(xì)胞（PBMC），加入PBS 至1 mL，重懸細(xì)胞，混勻備用。取24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入1 mL含10%FBS 的1640 培養(yǎng)基，然后加入上述制備好的細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，用移液槍吹打混勻，再加入2 μL 刺激劑+蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑，吹打混勻，置于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)刺激6 ～8 h。加入PBS，以1500 r/min 的轉(zhuǎn)速離心5 min，洗滌兩次，加入10 μL 的CD4-FITC，4 ℃下避光孵育30 min。加入PBS，以1500 r/min 的轉(zhuǎn)速離心5 min，洗滌2次，加入固定/ 破膜洗液1 mL，顛倒混勻，4 ℃下避光孵育1 h。加入固定/ 破膜洗液1 mL，以1500 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，洗滌2 次；加入10 μL IL-17APE，4 ℃下避光孵育50 min。加入固定/破膜洗液1 mL，以1500 r/min 的轉(zhuǎn)速離心5 min，洗滌2 次，加入300 μL的PBS 重懸細(xì)胞，上機檢測。每管收集20 000 個淋巴細(xì)胞，采用Flowj0 7.6 軟件分析CD4+IL-17A+細(xì)胞占CD4+T 細(xì)胞的百分比（Th17/CD4+T%）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 GM 組外周血Treg、Th17 細(xì)胞及Treg/Th17的對比

與NC 組比較，GM 組的Treg/Th17 降低，Treg和Th17 細(xì)胞均升高（P＜0.05）。詳見表1。

表1 GM 組外周血Treg、Th17 細(xì)胞及Treg/Th17 的對比（± s）

表1 GM 組外周血Treg、Th17 細(xì)胞及Treg/Th17 的對比（± s）

注：**與NC 組比較，P ＜0.01。

組別 Treg 細(xì)胞（%）Th17 細(xì)胞（%）Treg/Th17 GM 組（n=78）4.67±1.04** 1.49±0.38** 3.28±0.96**NC 組（n=20）3.62±0.64 0.83±0.19 4.54±1.19

2.2 不同病程GM 患者外周血Treg、Th17 細(xì)胞及Treg/Th17 的對比

與NC 組比較，不同病程（DM 前期、T2DM 初診、T2DM 伴并發(fā)癥）GM 組的Treg 和Th17 細(xì)胞均升高（除DM 前期組的Treg 細(xì)胞），Treg/Th17 均降低（P＜0.05），且隨著病程進(jìn)展，Treg 和Th17 細(xì)胞逐漸增加，Treg/Th17 逐漸降低，其中以T2DM 伴并發(fā)癥組最為明顯。詳見表2。

表2 不同病程GM 患者外周血Treg、Th17 細(xì)胞及Treg/Th17的對比（± s）

表2 不同病程GM 患者外周血Treg、Th17 細(xì)胞及Treg/Th17的對比（± s）

注：**組間比較，P ＜0.01；a 與NC 組比較，P ＜0.05；b 與DM 前期組比較，P ＜0.05 ；c 與T2DM 初診組比較，P ＜0.05。

組別 Treg 細(xì)胞（%）Th17 細(xì)胞（%）Treg/Th17 DM 前期（n=20）4.10±0.79 1.14±0.17a 3.69±0.92a T2DM 初診（n=20）4.38±0.75a 1.41±0.22ab 3.22±0.94a T2DM 伴并發(fā)癥（n=20）5.21±1.30abc 1.78±0.23abc 2.96±0.78ab NC 組F 值P 值4.54±1.19 10.047 0.000**3.62±0.64 10.777 0.002**0.83±0.19 78.104 0.000**

2.3 不同類型GM 患者外周血Treg、Th17 細(xì)胞及Treg/Th17 的對比

與NC 組比較，T1DM 組和T2DM 組的Treg 和Th17細(xì)胞均升高，Treg/Th17 均降低（P＜0.05）。詳見表3。

表3 不同類型GM 患者外周血Treg、Th17 細(xì)胞及Treg/Th17的對比（± s）

表3 不同類型GM 患者外周血Treg、Th17 細(xì)胞及Treg/Th17的對比（± s）

注：**組間比較，P ＜0.01 ；a 與NC 組比較，P ＜0.05。

組別 Treg 細(xì)胞（%）Th17 細(xì)胞（%）Treg/Th17 T1DM 組（n=18）5.04±0.85a 1.65±0.46a 3.27±1.08a T2DM 組（n=40）4.80±1.13a 1.60±0.29a 3.09±0.86a NC 組（n=20）F 值P 值3.62±0.64 12.963 0.000**0.83±0.19 45.492 0.000**4.54±1.19 14.380 0.000**

3 討論

Treg 細(xì)胞能分泌多種具有免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞因子，抑制效應(yīng)T 細(xì)胞的免疫應(yīng)答，與多種免疫性疾病的發(fā)病機制或免疫狀態(tài)密切相關(guān)，在維持機體免疫穩(wěn)態(tài)和調(diào)控免疫應(yīng)答方面具有重要作用。Th17 細(xì)胞是一種不同于Th1、Th2 的新型CD4+T 細(xì)胞，主要分泌白細(xì)胞介素-17（IL-17），受轉(zhuǎn)錄因子RORrt 的分化調(diào)控，在各種傳染性疾病、癌癥和許多自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。本研究中對所有研究對象均進(jìn)行外周血Treg 細(xì)胞和Th17 細(xì)胞檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GM 組的Treg 細(xì)胞和Th17 細(xì)胞均升高，Treg/Th17 比值降低。國內(nèi)外相關(guān)研究指出，Th17 細(xì)胞在DM 中表達(dá)上升，增加的Th17 細(xì)胞可分泌效應(yīng)因子，調(diào)節(jié)許多致炎因子的表達(dá)，從而引起DM 患者的胰島β 細(xì)胞損害和死亡[4]。Treg 細(xì)胞在DM 的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，DM 患者體內(nèi)的Treg 細(xì)胞存在數(shù)量或功能的缺陷。據(jù)報道，Treg 細(xì)胞對機體的免疫保護(hù)機制減弱可增強慢性炎癥的刺激及增加炎性因子的分泌，導(dǎo)致胰島素敏感性進(jìn)一步減弱，引起DM 的發(fā)生發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，Treg 細(xì)胞在DM 的發(fā)病初期就會增加。也有研究發(fā)現(xiàn)，T1DM 患者體內(nèi)的Treg 細(xì)胞表達(dá)高于對照組?，F(xiàn)階段，關(guān)于Treg 細(xì)胞的研究尚存在爭議，可能與地區(qū)差異或研究人群異質(zhì)性有關(guān)。本文數(shù)據(jù)顯示，GM 患者的Treg 細(xì)胞和Th17 細(xì)胞均隨病程進(jìn)展而逐漸增加，Treg/Th17 比值逐漸降低，其中以T2DM 伴并發(fā)癥者最為明顯。Th17 細(xì)胞在DM 前期就開始增加，而Treg 細(xì)胞在T2DM 初診時才開始增加。Hotamisligil 于1993 年首次在肥胖小鼠的脂肪組織中發(fā)現(xiàn)炎癥因子與DM 的發(fā)生有關(guān)。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，在DM 發(fā)病前數(shù)年，患者體內(nèi)就有炎癥反應(yīng)增強的跡象，而當(dāng)DM 伴并發(fā)癥時，這種炎癥反應(yīng)有所增強[5]。本研究中通過觀察不同類型的DM 患者，我們還發(fā)現(xiàn)T1DM 組和T2DM 組的Treg 細(xì)胞和Th17 細(xì)胞均明顯增加，提示Treg 細(xì)胞和Th17 細(xì)胞參與了T1DM 和T2DM 的發(fā)病機制。Th17 細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子導(dǎo)致炎癥反應(yīng)放大，引起胰島β 細(xì)胞損害和死亡，最終導(dǎo)致DM 的發(fā)生[6]；Treg 細(xì)胞與效應(yīng)T 細(xì)胞競爭白細(xì)胞介素-2（IL-2），造成效應(yīng)T 細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致機體免疫功能紊亂，誘發(fā)T1DM 等免疫性疾病[7]。Treg 細(xì)胞還可增強慢性炎癥的刺激及增加炎性因子的分泌，導(dǎo)致胰島素敏感性進(jìn)一步減弱，誘發(fā)T2DM。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，T1DM 患者體內(nèi)的Treg 細(xì)胞表達(dá)高于對照組。而Glisic 等[8]發(fā)現(xiàn)，T1DM 患兒的Treg 細(xì)胞中一些相關(guān)細(xì)胞因子低于正常對照組。可見，在病理情況下盡管機體代償增加了Treg 細(xì)胞的數(shù)量，但此類細(xì)胞可能存在功能缺陷，并不能通過調(diào)節(jié)或分泌作用產(chǎn)生相應(yīng)水平的細(xì)胞因子。

綜上所述，GM 的發(fā)生與機體細(xì)胞免疫缺陷及體液免疫過度激活有關(guān)，主要表現(xiàn)為外周血Treg/Th17平衡的異常。GM 患者的Treg 細(xì)胞和Th17 細(xì)胞均隨病程進(jìn)展而逐漸增加，Treg/Th17 逐漸降低，其中以T2DM 伴并發(fā)癥者最為明顯。Th17 細(xì)胞在DM 前期就開始增加，而Treg 細(xì)胞在T2DM 初診時才開始增加。T1DM 和T2DM 患者的Treg 細(xì)胞和Th17 細(xì)胞均明顯增加，提示Treg 細(xì)胞和Th17 細(xì)胞參與了T1DM 和T2DM 的發(fā)病機制。因此，在臨床工作中我們應(yīng)重視T2DM 的發(fā)生與免疫機制的關(guān)系。