鄧安妮，陳 玉，李沁瑤，胥崟崧

( 成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 610075)

支氣管哮喘是兒童期最常見的慢性呼吸道疾病，臨床主要表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的喘息、胸悶、咳嗽或呼氣性呼吸困難，目前發(fā)病原因尚未完全清楚。哮喘遷延不愈可引起氣道重塑、肺功能損傷等，而其重癥急性發(fā)作可迅速發(fā)展為呼吸衰竭甚至危及生命。據(jù)報(bào)道，兒童哮喘的發(fā)病率可能高達(dá)5%[1-2]。重癥哮喘的患病率在成人隨機(jī)樣本中為1.1%，在哮喘人群樣本中的占比為9.5%。與其他哮喘患者相比，重癥哮喘患者有更多的癥狀、更嚴(yán)重的活動受限、心臟病和更高的血液中性粒細(xì)胞水平，且其肺功能也較差[3]。雖然重癥哮喘所占比例不大，但給患者帶來了巨大的身體、精神、情感和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。近年來，大量研究發(fā)現(xiàn)中藥的某些化學(xué)成分在重癥哮喘的防治上療效顯著。提示中醫(yī)藥多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)的整體調(diào)節(jié)作用在對本病進(jìn)行防治方面具有潛在優(yōu)勢。丹參始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，善于活血祛瘀，且祛瘀而不傷正。其活血化瘀通血脈之力較強(qiáng)，可將深伏于肺絡(luò)之瘀血驅(qū)逐于外。中性粒細(xì)胞型哮喘是重癥哮喘的一個重要表型。謝欣辛等[4]的研究表明，丹參可通過抑制補(bǔ)體系統(tǒng)的激活來減輕中性粒細(xì)胞型哮喘小鼠體內(nèi)的炎癥。研究證明，丹參可改善微循環(huán)，提高耐缺氧能力，且具有一定的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗炎作用[5]。本文將利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對丹參治療重癥哮喘的分子機(jī)制進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 篩選丹參的潛在靶點(diǎn)

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中檢索丹參，通過口服生物利用度＞30% 且類藥性＞0.18 篩選成分。丹參成分靶點(diǎn)信息通過 TCMSP 和Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫共同確定，最后通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫規(guī)范靶點(diǎn)信息。

1.2 篩選重癥哮喘的靶點(diǎn)

分別在GeneCards、Drugbank 和TTD 數(shù)據(jù)庫中輸入“severe asthma”，檢索重癥哮喘相關(guān)靶點(diǎn)，通過中位數(shù)評分篩選靶點(diǎn)。

1.3 共同靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)

將丹參對應(yīng)靶點(diǎn)和重癥哮喘的靶點(diǎn)取交集。將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入 String 平臺，得到TSV 文件。將PPI TSV文件導(dǎo)入CytoScape 3.9.0，分析其拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)并以此篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.4 富集分析

利用Metascape 數(shù)據(jù)庫將丹參對重癥哮喘的潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 分析。

1.5 建立中藥-成分-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)

利用Cytoscape 3.9.0 構(gòu)建中藥- 成分- 靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)。連接度、介度和緊密度等拓?fù)鋮?shù)是評價丹參調(diào)治重癥哮喘核心活性成分、核心靶點(diǎn)的主要參考指標(biāo)。

2 結(jié)果

2.1 丹參中的有效成分及其靶點(diǎn)

檢 索TCMSP 數(shù) 據(jù) 庫，利 用OB 和DL 共 篩 選得 到65 種 有 效 成 分。利 用TCMSP 和Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫預(yù)測靶點(diǎn)，在去除重復(fù)值后，共得到與有效成分相關(guān)的潛在作用靶點(diǎn)680 個。

2.2 重癥哮喘的靶點(diǎn)

在Genecards 中通過中位數(shù)評分篩選靶點(diǎn)。同時納入TTD 和Drugbank 獲得的靶點(diǎn)，剔除重復(fù)靶點(diǎn)，最終獲得重癥哮喘的靶點(diǎn)693 個。

2.3 構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)

丹參作用于重癥哮喘的共同靶點(diǎn)有165 個，見圖1。將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入String 平臺，將生物種類設(shè)定為“Homo sapiens”，其余均為默認(rèn)設(shè)置，得到PPI 網(wǎng)絡(luò)，見圖2。利用拓?fù)浞治龊Y選出12 個關(guān)鍵靶基因，詳細(xì)信息見圖3。

圖1 丹參與重癥哮喘重合的靶點(diǎn)韋恩圖

圖2 丹參作用的165 個共同靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

圖3 關(guān)鍵靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)特征參數(shù)

2.4 功能與通路的富集分析

將165 個共同靶點(diǎn)上傳至Metascape 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行KEGG 富集分析，分析提示參與丹參調(diào)治重癥哮喘的主要通路有：PI3K-Akt 信號通路、鈣信號通路、Th17細(xì)胞分化信號通路、HIF-1 信號通路、MAPK 信號通路，見圖4。

圖4 丹參KEGG 通路富集分析氣泡圖

2.5 構(gòu)建中藥-活性化學(xué)成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

利用 Excel 將丹參作用于重癥哮喘的活性化學(xué)成分、靶點(diǎn)建立網(wǎng)絡(luò)和屬性文件，然后導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0 軟件。方形代表基因靶點(diǎn)，三角形代表丹參的有效活性化學(xué)成分，見圖5。以內(nèi)置工具Network Analyzer 得到的參數(shù)作為評價指標(biāo)，篩選出最重要的活性化學(xué)成分和靶點(diǎn)，見圖5、圖6。

圖5 丹參治療重癥哮喘的“中藥-活性化學(xué)成分-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

圖6 丹參“中藥-活性化學(xué)成分-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中核心成分及核心靶點(diǎn)特征參數(shù)

3 討論

哮喘屬“哮病”范疇, 重癥哮喘較普通哮喘病情重，其預(yù)后差、易反復(fù)發(fā)作，且對激素治療不敏感，多被現(xiàn)代醫(yī)家歸屬于“虛哮”“頑哮”范疇。重癥哮喘病因復(fù)雜, 病機(jī)多變，多虛實(shí)夾雜，現(xiàn)代醫(yī)家認(rèn)為其病因病機(jī)多與“感受外邪”“氣閉”“痰阻”“血瘀”“臟腑虧虛”等密切相關(guān)[6-7]?！把觥笔侵匕Y哮喘發(fā)生發(fā)展的重要影響因素，丹參為常用的活血化瘀藥，也是從瘀論治哮喘時的常用藥。有研究表明，丹參可通過抑制TGF-β1以及MMP-9 的表達(dá)來改善哮喘氣道重塑[8]。

本研究得到165 個共同靶點(diǎn)以及對應(yīng)的62 種活性成分。其中木犀草素、2- 異丙基-8- 甲基菲-3,4-二酮、紫丹參素C、丹參醇A、丹參新醌D 等活性成分的作用較強(qiáng)。推測上述有效成分可能是丹參調(diào)治重癥哮喘的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。木犀草素是一種黃酮類化合物[9]，能夠減輕哮喘幼鼠的氣道炎癥, 其可能是通過抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶/ 一氧化氮信號途徑來發(fā)揮作用[10]。余潔等[11]的研究表明，木犀草素可抑制哮喘患兒體內(nèi)促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6 的分泌,并通過TLR4/NF-κB 信號通路發(fā)揮抗炎作用。氣道重塑是重癥哮喘的病理學(xué)基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)研究證明，丹參醇A（DA）能夠減輕心臟重塑，改善心臟損傷和心肌膠原體積[12]。ICAM-1 和VEGF 與炎癥細(xì)胞因子及哮喘嚴(yán)重程度密切相關(guān)[13]。雖然關(guān)于丹參核心化學(xué)成分治療重癥哮喘的直接研究較少，但其抗炎、抗血栓形成等作用功效仍被認(rèn)為可作為治療重癥哮喘的有效途徑。本文通過對丹參治療重癥哮喘共同靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，得到PTGS2、AR、ESR1、OPRM1、ADRB2 5 個核心靶點(diǎn)。COX-2（PTGS2）蛋白的升高是以失調(diào)炎癥為代表的呼吸系統(tǒng)疾病病理生物學(xué)改變的關(guān)鍵影響因素[14]。有研究指出，木犀草素能夠減輕哮喘幼鼠的氣道炎癥與其抗氧化應(yīng)激和抑制COX-2 信號通路作用密切相關(guān)[15]。研究表明，較高的支氣管 AR 表達(dá)和較高的雄激素水平有利于哮喘患者肺功能的改善[16]。雌激素主要通過雌激素受體（ER）ERα 和ERβ 發(fā)揮作用，而ERβ 在氣道重塑中發(fā)揮著重要作用，其可作為治療重癥哮喘的潛在靶標(biāo)[17-18]。有研究指出，β2- 受體激動劑可抑制氣道平滑肌增殖及氣道壁的增厚, 從而干預(yù)氣道重塑[19]。研究表明，阻斷PI3KAkt 信號通路可延緩氣道重塑進(jìn)程[20]。MAPK 信號通路在哮喘發(fā)病進(jìn)程中可介導(dǎo)免疫／炎癥細(xì)胞反應(yīng)以及氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞反應(yīng)[21]。T 輔助17（Th17）細(xì)胞在重癥哮喘的發(fā)病機(jī)制中起到重要作用。Yes 相關(guān)蛋白(YAP)/ 缺氧誘導(dǎo)因子-1α (HIF-1 α)/microRNA-182(miR-182)/早期生長反應(yīng) 2 (EGR2) 軸可參與介導(dǎo)哮喘中的 Th17 細(xì)胞分化，影響哮喘的嚴(yán)重程度[22]。有研究[23]表明，抑制IL-17/NF-κB/MAPK 通路可以緩解OVA誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型氣道高反應(yīng)性和氣道炎癥。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法初步闡釋了丹參對重癥哮喘的作用是通過木犀草素、丹參醇A、紫丹參素C 等活性成分作用于PTGS2、AR、ESR1、ADRB2 等核心靶點(diǎn)，并通過PI3K-Akt 信號通路、Th17細(xì)胞分化信號通路、HIF-1 信號通路等與炎癥、免疫等密切相關(guān)的通路來實(shí)現(xiàn)的，這為臨床合理運(yùn)用丹參和相關(guān)新藥的開發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。但本研究未考慮中藥成分的劑量以及煎煮后的化學(xué)成分和活性成分在體內(nèi)的代謝物等因素，故后續(xù)仍需在此基礎(chǔ)上進(jìn)行相關(guān)動物或細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。