張夢婷，張 穎，張 蘭△，宮成軍

1 遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧 沈陽 110032； 2 遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110032

糖尿病具有高發(fā)病率，糖尿病腎?。╠iabetic kidney disease，DKD）為微血管病變，常見于病程長的糖尿病患者中［1］，其特征在于大量白蛋白尿的漏出，腎臟形態(tài)學改變，因為高血糖破壞了腎臟的血管，導致其功能障礙［2］。目前對DKD進展機制成因的理解大多為代謝失常、血流動力學改變、腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活和氧化應激失衡等。Notch 信號通路在健康人群腎臟中處于抑制狀態(tài)，而在機體代謝失衡進而出現損傷等情況刺激下該信號通路被激活，如高糖等導致腎小管上皮細胞纖維化、足細胞損傷等一系列病理變化［3］。近年來，大量研究表明，DKD 的發(fā)生發(fā)展與Notch 信號通路密切相關，傳統(tǒng)中醫(yī)藥在DKD 防治方面表現出獨特的優(yōu)勢。現就中醫(yī)藥通過干預Notch 信號通路治療DKD進行綜述。

1 Notch信號通路

Notch 信號通路級聯反應高度保守，由Notch受體、配體、下游信號分子等組成［4］。Notch 受體在內質網中合成，并在高爾基體中加工，成熟的Notch 受體由一個Notch 胞外結構域和一個胞內部分（notch intra cellular domain，NICD）組成［5］。在哺乳動物中現已發(fā)現4 種Notch 受體，目前已知對DKD有明顯調控作用的為Notch1。Notch配體有5 種，其中鋸齒狀成員配體（Jagged1）在DKD 的表達中有重要作用。Notch 受體與配體的作用方式為配體與胞外部分結合后誘導產生膜內調節(jié)蛋白，蛋白水解后釋放Notch胞內NICD，轉移到細胞核，組裝成轉錄激活復合物［6］，經3 次酶切作用后，Notch的NICD隨后進入細胞核，與中樞轉錄因子RBP-J 結合并激活轉錄，其中參與的下游信號分子有細胞內效應分子，三者結合后調控下游靶基因發(fā)狀分裂相關增強子（hairy and enhancer of split，Hes1）、細胞內效應器（Hey）的表達，全程無第二信使參與，但它以組織特異性的方式調節(jié)了100多個靶基因的表達［7］。

2 Notch信號通路對DKD的影響

2.1 對足細胞的影響持續(xù)高糖刺激下被激活的Notch 信號通路可增加足細胞凋亡［8-9］，進而導致腎小球濾過膜通透性增高，血漿中大量蛋白濾過［10］。具體影響的分子機制為可表現為足細胞組蛋白表達及細胞自噬的改變。在組蛋白表達方面，主要影響Notch1 和Jagged1。研究發(fā)現，足細胞中轉移抑制性組蛋白H3K27me3 富集在足細胞中Notch 配體Jagged1 的啟動子區(qū)域，通過敲除Jag1 可導致足細胞去分化［11］，而組蛋白Sirt6 主要通過使組蛋白H3K9 脫乙?；瘉硪种芅otch1 轉錄保護足細胞免受損傷［12］。

在足細胞自噬方面主要集中于Notch1 上，以往在自噬中研究較多的是PI3K/AKT、mTOR、AMPK、ROS 等通路［13］。最新研究表明，激活足細胞自噬可能是預防DKD 進展的潛在療法，自噬途徑可抑制Notch 信號通路從而延緩足細胞損傷進程，一項糖尿病小鼠研究發(fā)現，p66Shc（腎小管氧化損傷生物標記物）可調節(jié)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產生和誘導細胞凋亡。而p66Shc 的激活可增強足細胞自噬，其激活途徑為抑制Notch-PTEN-PI3K/Akt/mTOR 通路［14］。1 項關于胰島移植后高糖條件下Notch1 對足細胞影響的體內外實驗中，發(fā)現高度激活的Notch1 抑制了胰島功能細胞對腎損傷和足細胞恢復的療效，而通過抑制Notch1 途徑可下調足細胞凋亡水平，并抑制血管內皮生長因子的表達，但自噬表達沒有得到明顯改善［10］。在中藥治療足細胞自噬方面的研究中，發(fā)現含有葛根素［15］、芒果苷［16］、人參皂苷［17］等成分的中藥均可通過調節(jié)自噬相關通路達到改善DKD的目的。

2.2 對腎纖維化的影響主要集中于Notch1、snail1、Jagged1 和Hes1 上，目前已經證明Notch通路（及其轉錄因子snail1）為DKD介導腎臟上皮-間質轉化（extracellular matrix secretion，EMT）和纖維化不可或缺的調節(jié)分子［18］，其中snail1在DKD 中起著促進腎小管上皮細胞轉化和激活Notch 通路的中介作用。在1 項對DKD 患者腎小球內皮細胞實驗中，發(fā)現si-Numb 轉染后內吞銜接蛋白可以抑制Notch1和Hes1的高表達從而逆轉由高糖觸發(fā)的EMT過程［19］。在DKD模型KKAY小鼠中，通過TGF-β1/smad 誘導EMT 時，Jagged1 和Hes1 的表達明顯上調［20］，而Notch2 和Notch4 受體也參與其中［21］。在線粒體中，Notch 可通過抑制線粒體轉錄因子A（transcription factor A，mitochondrial，Tfam），調節(jié)腎小管上皮去分化和增殖，而Tfam 的表達增加可以挽救TGF-β1/Jagged1/Notch2 誘導的代謝缺陷和下游纖維化變化。由此可見TGF-β1/smad途徑可能為Notch信號通路的上游活化分子［22］。

2.3 抑制Notch 通路的治療效應目前，DKD 的治療多以控糖、控壓、減少尿蛋白為主。研究證明，降糖藥如格列喹酮［21］、降壓藥如纈沙坦［23］等均可通過抑制Notch通路而保護腎臟。

Notch 抑制劑的使用可延緩足細胞損傷進程、改善腎臟上皮細胞EMT以及纖維化，如γ-分泌酶 抑 制 劑DAPT［24］、鋅 轉 運 家 族 成 員SLC39A7（ZIP7）［25］。有實驗將HMGA2 基因與DAPT 相對比，發(fā)現HMGA2 基因表達能抑制Notch 通路中Notch1、Hes1的表達，同時上調Bcl-2和下調Bax，效果優(yōu)于單用DAPT。以上說明，Notch 抑制劑的使用能延緩腎臟損傷進程，證明抑制Notch 通路可為臨床治療DKD提供新的借鑒［26］。

在miRNA 方面，WEI 等［27］通過DKD 大鼠實驗發(fā)現在高糖條件下miR-145-5p 可以通過抑制Notch通路的激活來減弱足細胞凋亡，主要通過對NICD及Hes1 和Hey1 的抑制而實現。miR-135a 可通過調節(jié)Notch、NICD、和Hes1 的表達延緩DKD 大鼠腎纖維化［28］。其他miRNA 還有如miR-124a［29］、miR-146a［30］、miR-34a［31］等，作用機制均為抑制Notch通路及其下游靶基因而發(fā)揮護腎作用。

3 防治DKD中醫(yī)藥與Notch信號通路的關系

3.1 中藥單體丹參中二萜醌能抑制高糖干預的腎小管上皮細胞（human kidney 2，HK-2）分泌a-平滑肌肌動蛋白（a-smooth muscle actin，a-SMA）等合成，同時增高E-鈣黏蛋白（E-Cadherin，E-cad）表達；在丹參酮Ⅱa聯合DAPT用藥后，發(fā)現對大鼠腎組織Notch/Jagged 相關蛋白表達亦有抑制作用，且呈現出量效關系［32-33］。實驗發(fā)現，小檗堿通過抑制DKD 模型輕度肥胖型2 型糖尿病小鼠Notch 通路下游的鋅指轉錄抑制因子（snail）、Jagged1 和Hes1的表達，延緩糖尿病腎病進展［20］。雷公藤甲素具有極強的護腎抗炎效果，可以通過抑制高糖干預的腎小球系膜細胞中Notch1 受體，阻斷下游靶基因NICD、Hes1 和Hey 的表達，同時PDK1/AKT/MTOR 相關通路亦有下降，而miR-137-3P 的表達卻增高，作用靶點為減輕HRMCS 細胞外基質（extracellular matrix，ECM）積聚［34］。近年來研究發(fā)現，其亦有干預足細胞自噬及凋亡的作用［35］。天花粉凝集素是天花粉的活性成分，在STZ誘導的糖尿病大鼠中發(fā)現其可阻斷巨噬細胞向M1型的極化，有助于增加足細胞的增殖潛力，作用機理為抑制Notch1、NICD和Hes1的表達來增加M2巨噬細胞比例從而減輕腎臟結構和功能的惡化［36］。

3.2 中藥提取物研究發(fā)現，百令膠囊水提物有護腎作用，在高糖刺激腎小球系膜細胞（HBZY-1）后細胞出現異常增殖，而加入百令水提液后可減輕高糖誘導的系膜細胞增殖，HBZY-1中Notch1、Jagged1、Hes1 和mRNA 表達出現顯著下調，同時TGF-β和細胞外基質FN合成、mRNA和蛋白表達均顯著降低［37］。

3.3 中藥復方江丹等［38］發(fā)現，益氣升清方可減輕DKD 大鼠24 h 尿微量白蛋白排泄，機制為抑制Notch通路中Notch1、Jagged1以及上游TGF-β1的高表達。局灶節(jié)段性腎小球硬化（focal segmental glomerulo sclerosis，FSGS）為足細胞損傷典型表現。尚懿純等［39］在對左腎切除加阿霉素注射法誘發(fā)SD大鼠FSGS模型地研究中發(fā)現，腎蘇Ⅱ方可能通過調控Notch-P53 通路抑制足細胞損傷及凋亡速度，緩解FSGS大鼠病情惡化。榛花消腎安膠囊可有效下調DKD 大鼠腎臟Notch1、Jagged1、NICD、Hes1的表達，使足細胞相關蛋白表達Synaptopodin上調、TRPC6 下調而保護足細胞，檢測發(fā)現血清肌酐（serum creatinine，Scr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、24 h 尿蛋白定量均顯著降低［40］。樸松蘭等［41］亦發(fā)現，解毒通絡保腎膠囊降低蛋白尿可能與對足細胞的保護有關，這種保護作用可能是通過對Notch1和NICD的抑制而實現。楊冠男等［42］對糖尿病KKAY 小鼠使用糖腎寧膠囊進行實驗發(fā)現，小鼠腎臟組織中E-cad 蛋白含量升高，a-SMA 蛋白含量減低，同時Jaggeg1、Notch1、Hes1、snail1 表達顯著下降，檢測發(fā)現Scr、BUN 及24 h 尿蛋白定量均降低，腎臟間質纖維化得到改善。周雪梅等［43-44］研究發(fā)現，丹蛭降糖膠囊可以降低采取左腎切除聯合鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）誘 導 的DKD 模 型 大 鼠 中Notch 通路和CD34、CD144 表達水平，參與血管內皮損傷的修復；在腎小管上皮細胞胞質中，Hes1的表達也得到了一定程度的抑制；檢測發(fā)現24 h尿蛋白定量也得到一定程度改善。研究發(fā)現，由黃芪、田七、當歸、大黃等組成的益腎活血方可上調miR-126/VEGF-Notch 水平，促進腎臟小血管修復［45］。劉利飛等［46］研究發(fā)現，化瘀通絡類中藥組能夠抑制DKD 大鼠Notch 通路Notch1、Jagged1、Hes1 和Hey1 表達，這可能是其減少尿蛋白排泄、減輕腎臟損傷的作用機制之一，同時檢測發(fā)現血清BUN、Scr 及尿酸的水平也得到有效降低。中醫(yī)藥通過Notch通路作用方式見表1。

表1 中醫(yī)藥通過Notch通路作用方式

4 小結

根據上述中醫(yī)藥治療DKD 的對比，我們發(fā)現中醫(yī)藥通過抑制Notch 通路治療DKD 主要集中于Notch1、Jagged1、NICD及下游靶基因Hes1和Hey1上，上游信號分子可能與轉化生長因子β/重組人蛋白（transforming growth factor-β，TGF-β/smad）有關。在蛋白表達調控上，可下調腎臟組織a-SMA、TRPC6，上調E-cad及足細胞相關表達蛋白等，減少ECM積聚、促進足細胞損傷修復和減輕腎臟纖維化，從而改善腎小球濾過膜的穩(wěn)定性以及腎小管、間質硬化進程，延緩DKD 向終末期腎病的轉變。

在目前的研究中，首先，中醫(yī)藥通過Notch 通路治療DKD的研究大多處于基因、轉錄及影響蛋白表達上，且研究靶點主要集中于Notch1、Jagged1和下游表達，而國外對于DKD 除Notch1 外的其他Notch 通路中的足細胞自噬、組蛋白表達、高通量測序等相關研究也已純熟，故我們今后可以開展更深層次的探索性研究，尋找中醫(yī)藥作用于Notch通路治療DKD的更精確調控機制。再者，目前通過Notch 通路治療DKD 的研究大多局限于一條通路上，與其他通路的調控聯系研究較少，上游除TGF-β/smad 外是否還有其他通路參與調控如NF-KB、mTOR、ROS 等，他們之間是如何協(xié)同或拮抗作用以及于此形成的復雜網絡關系，值得我們進一步挖掘，從而更好地從分子層面更立體的闡述中醫(yī)藥治療DKD 的原理。最后，在信號通路的中醫(yī)理論研究方面，信號通路屬于中醫(yī)理論的哪一類，如何用中醫(yī)基礎理論解釋這種干預信號通路治療疾病的現象，更好地使現代研究手段、分子生物學理論與中醫(yī)經典理論相結合，更好地服務于臨床，需要我們進一步的探索和研究。