張 洋，陳 萌，張虹璽

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院,遼寧 沈陽 110042

功能性便秘（functional constipation，F(xiàn)C）是指排除腸管器質(zhì)性病變、全身系統(tǒng)性疾病及藥物等繼發(fā)性因素所致的慢性便秘［1］。隨著現(xiàn)代人們生活節(jié)奏的不斷加快、飲食習(xí)慣的改變，運動量的下降，其發(fā)病率逐年增加，并成為最常見的胃腸道疾病之一［2］，它會對個人的生活質(zhì)量產(chǎn)生重大影響，并造成沉重的經(jīng)濟負擔(dān)［3］。便秘的發(fā)病機制較為復(fù)雜，目前尚未明確，可能與情緒、飲食、遺傳等多方面因素有關(guān)［4-6］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)針對FC 的治療手段較為單一，主要通過補充膳食纖維、應(yīng)用滲透性瀉藥和5-羥色胺受體激動劑來治療，但療效并不理想［7］。越來越多的患者開始尋求中醫(yī)藥治療并取得良好的療效。麻子仁丸出自《傷寒論》，又名脾約丸，用來治療“小便頻數(shù)，大便硬”等癥狀［8-9］，其具有清熱潤腸、益氣通便的作用［10］。組方在小承氣湯基礎(chǔ)上加火麻仁、杏仁、芍藥并減少藥物用量，雖然臨床效果顯著但是作用機制不明確，因此本研究旨在結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)探討麻子仁丸治療功能性便秘的作用機制。

1 資料與方法

1.1 基因收集及篩選

1.1.1 麻子仁丸活性成分及靶點收集 分別以“火麻仁”“大黃”“枳實”“厚樸”“苦杏仁”“白芍”為關(guān)鍵詞，在TCMSP（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫中檢索麻子仁丸中所有組方成分的活性成分。再設(shè)定“生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18，半衰期（half-life，HL）≥4”為篩選條件篩選出符合要求的有效活性成分并獲得相應(yīng)的靶點。通過Uniprot（https：//www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫獲得蛋白名稱。

1.1.2 FC 相關(guān)基因收集及潛在靶點預(yù)測 在GeneCards（htths：//www.genecards.org 數(shù)據(jù)庫中以“functional constipation”為關(guān)鍵詞檢索“功能性便秘”的相關(guān)基因。使用R 3.6.3 程序取麻子仁丸有效活性成分作用靶點和FC 相關(guān)基因的交集靶點，并獲得韋恩圖。

1.2 有效活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將獲取的交集靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件中構(gòu)建有效活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，計算Degree值，篩選出Degree值較高的有效活性成分用于分子對接。

1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將獲取的交集基因?qū)隨TRING 數(shù)據(jù)庫中生成PPI 網(wǎng)絡(luò)（https：//string-db.org/）來明確潛在靶點間的相互作用，再通過Cytoscape 3.7.2 軟件進行PPI網(wǎng)絡(luò)可視化調(diào)節(jié)。計算各節(jié)點平均Degree 值獲取核心靶點。

1.4 GO富集分析和KEGG富集分析基于Bioconductor數(shù)據(jù)庫（http：//www.bioconductor.org/）通過R3.6.3 對潛在靶點進行GO 和KEGG 富集分析，并取富集程度最高的前20 名進行可視化構(gòu)建，通過了解生物過程及信號通路過程分析麻子仁丸治療功能型便秘可能的作用機制。

1.5 分子對接通過RCSB PDB數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）獲取Degree值排名前5的核心靶點的3D結(jié)構(gòu)，再由TCMSP數(shù)據(jù)庫及文獻中查找并下載麻子仁丸Degree值排名前5的有效活性成分、枸櫞酸莫沙必利和乳果糖的3D結(jié)構(gòu)。將獲取的核心靶點3D結(jié)構(gòu)導(dǎo)入PyMOL 1.7.2.1軟件進行清除配體、去水、加氫等操作，應(yīng)用AutoDockTools 1.5.6軟件將蛋白和化合物轉(zhuǎn)換為pdbqt格式文件，最后利用Autodock Vina 1.1.2軟件進行分子對接。

2 結(jié)果

2.1 活性成分篩選及靶點預(yù)測在TCMPS 數(shù)據(jù)庫中檢索麻子仁丸中的藥物6味，共獲得541種活性成分。本研究選擇OB≥30%，DL≥0.18，HL≥4作為篩選條件。其中OB 可以反映藥物被吸收進入人體循環(huán)的藥量比例，DL 為類藥性指化合物與已知藥物的相似性，HL 為半衰期體現(xiàn)了活性成分的作用時間。經(jīng)過上述篩選最終收集到57 個有效活性成分（枳實和火麻仁共有成分1 個，苦杏仁和白芍共有成分一個，大黃和白芍共有成分1 個，火麻仁、苦杏仁和白芍共有成分1 個，火麻仁和苦杏仁共有成分2 個）。其中較重要的有效成分有l(wèi)u‐teolin、kaempferol、arachidonic acid 等。進一步在TCMPS 數(shù)據(jù)庫中檢索麻子仁丸中的6 味藥物的作用靶點共獲得5001 個，使用UniProt 數(shù)據(jù)庫將靶基因蛋白名稱轉(zhuǎn)換為基因名稱，篩選、去重后得到有效活性成分作用靶點167 個。在Gene Cards 數(shù)據(jù)庫中以“functional constipation”為關(guān)鍵詞檢索功能型便秘的相關(guān)靶點，共獲得4948個FC相關(guān)靶點基因。

2.2 構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖并提取核心蛋白基于STRING 數(shù)據(jù)庫，將篩選出的135 個交集基因使用Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建成蛋白質(zhì)互作可視化網(wǎng)絡(luò)圖，共135 個節(jié)點和2033 條邊，平均度值30.1。每個靶點間連線代表靶點間的相互作用，Degree 值代表該靶點在網(wǎng)絡(luò)中的重要性，Degree值越高連線數(shù)越多。根據(jù)Degree 值排序篩選出30 個核心靶點蛋白，其中前5 名的靶點為AKT1、IL-6、MAPK3、VEGFA、CASP3。見圖1。

圖1 核心靶點蛋白

2.3 構(gòu)建有效活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖將篩選出的活性成分有效作用靶點與FC 靶點取交集處理，篩選出共同的靶點，得到135 個交集基因，制作韋恩（Venn）圖。運用Cytoscape 3.7.2 軟件進行有效活性成分-靶點可視化網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建。見圖2。

2.4 分子對接應(yīng)用 AutoDock Vina 1.1.2軟件對木犀草素Luteolin、山柰酚Kaempferol、花生四烯酸Arachidonic Acid、柚皮素Naringenin、川陳皮素Nobiletin和AKT1、IL-6、MAPK3、VEGFA、CASP3進行分子對接分析。一般認為結(jié)合能≤-5.0 KJ/MOL 表示有效成分與靶點間結(jié)合能力較強，發(fā)生作用的可能性大［10］。對接結(jié)果表明麻子仁丸中的中藥活性成分普遍與FC 的關(guān)鍵靶點具有較好的結(jié)合力，其中犀草素、山柰酚、川陳皮素與AKT1、IL-6 結(jié)合力最好，陽性對照組枸櫞酸莫沙必利、乳果糖與相應(yīng)靶點結(jié)合力相近。見圖3，表1。

圖3 分子對接分析圖

2.5 有效靶點GO分析及KEGG通路富集分析在Bioconductor 數(shù)據(jù)庫基礎(chǔ)上通過R 語言3.6.3 設(shè)定“P=0.05，Q=0.05”將135 個有效交集潛在靶點進行GO 和KEGG 富集分析，并提取顯著性前20 條目制作條形圖。GO 分析結(jié)果共獲取條目154 個，其中顯示富集最多的為10個，麻子仁丸治療FC可能與直接配體調(diào)節(jié)序列特異性DNA 結(jié)合、磷酸酶結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合、酰胺結(jié)合、類固醇結(jié)合、肽結(jié)合、受體下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物過程有關(guān)。KEGG分析共獲得175 條信號傳導(dǎo)通路，其中有16 條富集顯著性較高的結(jié)果，包括：AGE-RAGE、TNF、IL-17、PI3K-AKT 等信號通路，除以上信號通路外還可能和乙型肝炎、前列腺癌、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、丙型肝炎、弓形蟲病、鉑類耐藥、人巨細胞病毒感染、膀胱癌、胰腺癌、內(nèi)分泌抵抗、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥等疾病有關(guān)。見圖4—5。

圖4 GO富集分析結(jié)果

3 討論

FC 的發(fā)病機制涉及多系統(tǒng)、多學(xué)科，通常病情反復(fù)不易治愈［11］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)一般建議患者在改善飲食和生活習(xí)慣的同時配合促胃腸動力藥物、緩瀉劑等藥物進行治療［12-13］。臨床常用的枸櫞酸莫沙必利是一種5-羥色胺受體激動劑，可以改善胃腸道動力從而促進排便［14］，而乳果糖作為一種滲瀉劑可以吸收水分，刺激腸道蠕動加快排便，美國FDA 批準乳果糖用于治療便秘［15］。上述藥物雖被證實治療FC 有效，但無法從根本上解決問題，還可能產(chǎn)生不良反應(yīng)。中醫(yī)藥在FC 的治療中起到重要的作用，麻子仁丸作為治療便秘的經(jīng)方沿用至今，臨床效果顯著。但由于FC 發(fā)病機制不明確且中醫(yī)藥治療功能型便秘的作用機制無法闡明，因此對于使用中藥治療FC具有諸多不確定性。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法提取出麻子仁丸主要有效成分木犀草素、山柰酚、花生四烯酸、柚皮素、川陳皮素等。通過與FC 靶點取交集的方法預(yù)測出關(guān)鍵靶點，包括AKT1、IL-6、MAPK3、VEGFA、CASP3等。FC 由于排便困難糞便長期留存于腸道中，可能刺激腸黏膜發(fā)生炎癥反應(yīng)，同時腸道內(nèi)毒素?zé)o法排出也易發(fā)生腸道感染，干結(jié)的糞便還可能損傷腸道造成感染［16］。因此FC 患者均出現(xiàn)不同程度包括IL-6 在內(nèi)的炎性因子的升高［17］。FC除引起炎癥反應(yīng)外，還是結(jié)直腸惡性腫瘤的重要發(fā) 病 原 因 之 一［18］，CASP 與 腫 瘤 細 胞 的 凋 亡 有關(guān)［19］。研 究 表 明，AKT、MAPK 等 也 與FC 發(fā) 病 有關(guān)［20-21］。木犀草素、山柰酚、花生四烯酸、川陳皮素均具有消炎、抗菌等作用［22-24］。柚皮素可以通過調(diào)節(jié)結(jié)腸平滑肌細胞收縮產(chǎn)生通便作用［25］。麻子仁丸中的有效成分可能通過抗炎、預(yù)防腫瘤、調(diào)節(jié)腸道平滑肌細胞等作用調(diào)控AKT1、IL-6、MAPK3、VEGFA、CASP3 等達到治療FC 的目的。將重要的有效成分與預(yù)測的關(guān)鍵靶點進行分子對接處理發(fā)現(xiàn)，有效成分與關(guān)鍵靶點均有較強的結(jié)合力，且與陽性對照枸櫞酸莫沙必利、乳果糖相近。說明木犀草素、山柰酚、川陳皮素等與FC 關(guān)鍵靶點結(jié)合力較好，可能對于治療FC 起到重要作用。KEGG 富集分析結(jié)果顯示麻子仁丸可能通過AGERAGE 信號通路激活PI3K-Akt 通路影響AKT1 等靶點［26］，還可能作用于IL-17 信號通路調(diào)控IL-6、MAPK1 等，AKT1、IL-6、MAPK1 等靶點可能通過TNF信號進行通路調(diào)節(jié)［27］。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)對麻子仁丸的有效活性成分和作用靶點進行篩選。得出結(jié)果：麻子仁丸的主要有效成分木犀草素、山柰酚、花生四烯酸、柚皮素、川陳皮素等，可能通過AGE-RAGE、TNF、IL-17、PI3K-Akt 等信號通路調(diào)節(jié)直接配體調(diào)節(jié)序列特異性DNA 結(jié)合、磷酸酶結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合等生物過程調(diào)控AKT1、IL-6、MAPK3、VEGFA、CASP3 等核心蛋白，發(fā)揮抑制炎性反應(yīng)、防止病情惡化、治療FC的作用。