張義奎，曹夢茜，李俊麗，王夢洋，趙慧竹，劉變芳

（西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院 陜西楊凌 712100）

酸泡菜的獨特風味和口感的形成是由乳酸菌為主的菌群在厭氧環(huán)境下發(fā)酵而產(chǎn)生的[1]。泡菜經(jīng)過發(fā)酵之后風味得到改善，可以增進人的食欲，營養(yǎng)價值也會提升[2]。產(chǎn)生的口感和風味主要受原料的種類、微生物的種類以及環(huán)境因子的影響[3]。泡菜實際生產(chǎn)過程主要包括：原料選擇→清洗→瀝干→切配→裝壇→注水→封壇→發(fā)酵8 個步驟[3]。如傳統(tǒng)四川泡菜將新鮮的當季蔬菜清洗、瀝水后切成條狀，加入調(diào)味料、純凈水，在密閉條件下常溫發(fā)酵[4]。發(fā)酵所用乳酸菌來自于蔬菜附生菌落或前代泡菜母水。其中，調(diào)味料的加入使泡菜發(fā)酵體系更為復雜，菌種演替也受到影響。自然發(fā)酵泡菜可以避免由于調(diào)味料帶來的不穩(wěn)定因素，通過僅添加食鹽來維持泡菜液的滲透壓，利用蔬菜中存在的天然菌落進行自然發(fā)酵，即可獲得成品泡菜[5]。在自然發(fā)酵環(huán)境下，探究乳酸菌優(yōu)勢菌種的變化情況。

根據(jù)泡菜發(fā)酵過程中優(yōu)勢菌的變化情況，將發(fā)酵過程分為發(fā)酵初期、中期和后期。李文斌等[6]發(fā)現(xiàn)泡菜發(fā)酵初期主要以不抗酸的大腸桿菌和酵母菌占優(yōu)勢作用，產(chǎn)生乳酸[7]、乙醇、二氧化碳和乙酸，當pH 值降到5 左右時，菌群發(fā)生變化，以腸膜明串珠菌等異型乳酸菌發(fā)酵為主，這類乳酸菌可最先適應發(fā)酵環(huán)境并產(chǎn)酸，抑制其它有害菌的生長，環(huán)境中的pH 降低。早期的異型發(fā)酵幾乎不形成風味物質(zhì)，然而會產(chǎn)生一些乙酸，乙酸是具有揮發(fā)性的酸類化合物，可與其它化合物結(jié)合，促進發(fā)酵中、后期泡菜風味物質(zhì)的形成[8]。中期發(fā)酵以乳桿菌和植物乳桿菌為代表的同型乳酸菌發(fā)酵為主，這類乳酸菌會產(chǎn)生大量的乳酸，使泡菜表現(xiàn)微酸性[9]。后期隨著乳酸的大量積累，乳酸菌受到抑制，耐酸性強的酵母和霉菌分解蔬菜中的有機酸，使pH 值回升，腐敗菌大量生長，分解環(huán)境中得蛋白質(zhì)，造成泡菜的腐敗變質(zhì)[10]。

我國蔬菜的種類多種多樣，不同的地區(qū)發(fā)酵的泡菜方法和風味不盡相同，難以統(tǒng)一生產(chǎn)標準以實現(xiàn)工廠化量產(chǎn)。傳統(tǒng)酸白菜制作通常將新鮮白菜經(jīng)過篩選、清洗、切段、添加輔料后再添加鹽水進行發(fā)酵，制得成品[11]。民間泡菜的做法大致相同，在添加鹽水階段常會加入泡菜母水以增加泡菜發(fā)酵起始的發(fā)酵速度，增添風味。而工業(yè)做法是將民間泡菜做法中成分未知的泡菜母水替換成商用發(fā)酵劑，以提高產(chǎn)品穩(wěn)定性，讓泡菜發(fā)酵過程更加安全可控[12]。大多數(shù)傳統(tǒng)生產(chǎn)泡菜的方式主要依靠制作者的經(jīng)驗和乳酸菌的自然發(fā)酵，不僅具有健康隱患，而且發(fā)酵周期長，不利于發(fā)展規(guī)?；a(chǎn)[11]。我國泡菜的工業(yè)化生產(chǎn)起步較晚，缺少包含多種微生物和風味物質(zhì)的復合型發(fā)酵產(chǎn)品。深入研究泡菜在無外界條件影響時僅靠白菜自帶附生菌種在高滲透壓環(huán)境下的演變規(guī)律十分重要。

本研究在白菜中僅添加鹽，22 ℃自然發(fā)酵7 d，用涂布方法記錄發(fā)酵液中菌群變化規(guī)律。采用劃線、涂布、革蘭氏染色、過氧化氫酶試驗、二氧化碳產(chǎn)氣試驗的方法分離泡菜液中的乳酸菌。使用分子生物學16S rRNA 鑒定分離乳酸菌菌株，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，辨別分離菌株的親緣關(guān)系。使用16S rRNA 基因高通量測序?qū)Πl(fā)酵完成的泡菜液進行微生物多樣性分析。為泡菜的深度加工利用與乳酸菌在泡菜發(fā)酵過程中的演變規(guī)律作進一步探索。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白菜，購自陜西省楊凌區(qū)好又多超市。

PCA 瓊脂，海博生物技術(shù)有限公司；MRS 瓊脂，海博生物技術(shù)有限公司；MRS 肉湯、APT 肉湯，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；革蘭氏染液，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；3%過氧化氫溶液，海博生物技術(shù)有限公司；2xTaq PCR Master Mix，近岸蛋白質(zhì)科技有限公司；通用引物1492R 和27F，5kb DNA Ladder 2000，近岸蛋白質(zhì)科技有限公司；瓊脂糖，廈門海晉生物有限公司；凝膠紅DNA染料，笛醫(yī)生物有限公司。

PCA 培養(yǎng)基（用于菌落總數(shù)測定）：胰蛋白胨5.0 g，酵母浸粉2.5 g，葡萄糖1.0 g，瓊脂15.0 g，pH 7.0±0.2，25 ℃。

MRS 瓊脂培養(yǎng)基（用于乳酸菌檢驗與培養(yǎng)）：蛋白胨10.0 g，牛肉粉5.0 g，酵母粉4.0 g，葡萄糖20.0 g，檸檬酸三銨2.0 g，乙酸鈉5.0 g，MgSO40.2 g，MnSO40.05 g，K2HPO42.0 g，吐溫80 1.0 mL，pH 6.5±0.2。

APT 肉湯（用于同型異型乳酸發(fā)酵區(qū)分）：酵母浸粉7.5 g，酪蛋白胨12.5 g，葡萄糖10.0 g，檸檬酸鈉5.0 g，鹽酸硫胺素0.001 g，氯化鈉5.0 g，磷酸氫二鉀5.0 g，氯化錳0.14 g，硫酸鎂0.8 g，亞硫酸鐵0.04 g，吐溫80 0.2 g，pH 6.7±0.2。

MRSS 瓊脂培養(yǎng)基（用于腸膜明串珠菌的篩選培養(yǎng)）：蛋白胨10.0 g，牛肉粉5.0 g，酵母粉4.0 g，葡萄糖50.0 g，檸檬酸三銨2.0 g，乙酸鈉5.0 g，MgSO40.2 g，MnSO40.05 g，K2HPO42.0 g，吐溫80 1.0 mL，pH 6.5±0.2。

1.2 儀器與設(shè)備

Motic B 顯微鏡，麥克奧迪實業(yè)集團有限公司；2720 熱循環(huán)儀，Life Technologies；JY600C 電泳儀，北京君意東方電泳設(shè)備公司；JY04S-3C 紫外透射儀，北京君意東方電泳設(shè)備公司；JY-SPCT凝膠電泳槽，北京君意東方電泳設(shè)備公司；MX-S渦旋混勻器、S1010E 微型旋轉(zhuǎn)離心機，美國賽洛捷克公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 酸泡菜的制作 戴上潔凈手套，切掉新鮮大白菜根部，除去腐爛外層葉片、病變及破損組織，保留完整的白菜組織。先用自來水沖洗所有器具，再用純凈水沖洗2 次。將白菜從中間切成兩半，再切成約5 cm 長的小塊。稱量大白菜的質(zhì)量，按質(zhì)量比2.5%稱取食鹽，將鹽與大白菜混勻。放入滅菌的廣口瓶中，約占總體積的80%。罐裝后輕輕按壓將空氣擠出，避免破壞白菜的組織，用蓋子密封。將泡菜罐子放入22 ℃培養(yǎng)箱發(fā)酵。

在泡菜發(fā)酵的第0，1，3，5，7 天用微量取樣器吸取250 μL 泡菜液放入無菌eppendorf 管中，保存?zhèn)溆茫瑱z測相關(guān)指標。首先用槍頭吸取少量備用泡菜原液樣品，用pH 計測定泡菜液pH 值。

1.3.2 乳酸菌數(shù)與細菌總數(shù)檢測 取l00 μL 泡菜液加到900 μL 無菌生理鹽水中，做系列梯度稀釋。選取10-4～10-7稀釋度的稀釋液100 μL 涂布于PCA 平板，37 ℃培養(yǎng)48 h，選取菌落數(shù)適宜的平板（30～300）計數(shù)，統(tǒng)計菌落總數(shù)。選取10-1～10-3稀釋度的稀釋液100 μL 涂布于MRS 平板，37 ℃培養(yǎng)48 h，選取菌落數(shù)適宜的平板（30～300）計數(shù)，統(tǒng)計乳酸菌數(shù)。

1.3.3 乳酸菌的分離純化 用接種環(huán)取泡菜原液（未稀釋）在MRS 平板上連續(xù)劃線分離乳酸菌單菌落，37 ℃培養(yǎng)48 h。

選取劃線培養(yǎng)的MRS 平板和1.3.2 節(jié)中涂布的MRS 平板，觀察其優(yōu)勢菌落。挑取優(yōu)勢菌落進行革蘭氏染色，同時檢測其過氧化氫酶，經(jīng)初步篩選疑似乳酸菌。用無菌牙簽挑去少量細胞于載玻片上，滴加30%過氧化氫1 滴，觀察是否產(chǎn)生氣泡。產(chǎn)氣飽者為過氧化氫酶陽性，不產(chǎn)氣泡的為過氧化氫酶陰性。

選擇革蘭氏染色陽性，同時過氧化氫酶陰性的初篩疑似乳酸菌株，在MRS 平板上劃線純化為單菌落。將純化后的菌株編號，將含20%（體積分數(shù)）甘油的MRS 肉湯-80 ℃保存，備用。

1.3.4 腸膜明串珠菌分離純化 用接種環(huán)取泡菜原液（未稀釋）在MRSS 平板上連續(xù)劃線分離乳酸菌單菌落，37 ℃培養(yǎng)48 h。利用腸膜明串珠菌在MRSS 培養(yǎng)基上菌落特點為粗大、光滑、黏稠的特性，48 h 培養(yǎng)后分離MRSS 培養(yǎng)基上具有該特點的菌株，按照1.3.3 節(jié)所述方法分離純化為單菌落。將純化的菌株編號，使用體積分數(shù)20%的甘油保存在MRS 肉湯中，儲存在-80 ℃冰箱中備用。

1.3.5 疑似乳酸菌生化鑒定 對分離菌株進行革蘭氏染色，在顯微鏡下確定所有挑選菌株的形態(tài)，以及是否為革蘭氏陽性菌。同時選用30%過氧化氫溶液做觸酶試驗。不產(chǎn)生氣泡為過氧化氫酶陰性，符合乳酸菌菌落的特征。為了對篩選菌株的分離產(chǎn)物進行分類，做二氧化碳發(fā)酵試驗，將無菌的達勒姆管倒置在滅菌試管中，加入10 mL APT 肉湯，將候選菌接種到APT 肉湯中，培養(yǎng)48 h 后觀察小管內(nèi)是否產(chǎn)生氣泡。

1.3.6 乳酸菌16S rRNA 鑒定與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建樣品DNA 按照生工試劑盒說明書進行提取，使用細菌16S rRNA 基因通用引物27F（5AACT GAGTTTGATCCTGGCTC-3’）和1492R（5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’），通過PCR擴增分離菌株的16S rRNA 基因的可變區(qū)，凝膠電泳分析PCR 產(chǎn)物。PCR 條件：95 ℃預變性6 min，在94 ℃下變性30 s，在55 ℃下退火30 s，72℃延伸2 min，循環(huán)30 次，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存?zhèn)溆?。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，在紫外投射儀中照膠并保存圖片，PCR 產(chǎn)物送至熱默爾生物科技公司（中國西安）測序。對測序結(jié)果手動校準完成后與NCBI 上GenBank 數(shù)據(jù)庫中的已知序列進行同源性比對分析（Basic Local Alignment Search Tool，http//blast.ncbi.nlm.nih.Gov/ Blast.cgi）。參照叢敏等[13]方法，使用Mega X 程序，通過臨近相連法編輯，建立系統(tǒng)發(fā)育樹，并用bootstrap 檢驗系統(tǒng)發(fā)育樹，自展數(shù)（Boot Strap）為1 000。

1.3.7 酸泡菜產(chǎn)品的微生物多樣性分析 取發(fā)酵7 d 的泡菜液，采用高通量測序檢測微生物多樣性。驗證發(fā)酵7 d 后泡菜液環(huán)境中微生物群體在各屬水平上的數(shù)目和頻率分布差異，揭示泡菜液中菌群結(jié)構(gòu)與功能的聯(lián)系。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析 泡菜制作設(shè)置4 組平行，pH 的測定重復3 次，PCA 平板與MRS 平板菌落計數(shù)重復3 次，物種豐度算法采用RDP classifier 對OTU聚類進行比對，采用Excel、Graphpad prism 8.0 及Origin 2019b 進行圖表繪制與數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH、菌落總數(shù)與乳酸菌數(shù)量變化

泡菜自然發(fā)酵過程中pH、菌落數(shù)量與乳酸菌數(shù)量變化如圖1 所示。7 d 內(nèi)泡菜液pH 值從初始6.0 降到第7 天的4.2，屬正常發(fā)酵蔬菜的pH 范疇[14]。在發(fā)酵初期（0～1d）pH 值降低不顯著，這是由于泡菜罐中的高滲透壓使白菜組織液滲出，為泡菜組織中附著的菌落提供了生長環(huán)境，包括乳酸菌在內(nèi)的各種菌類的生長繁殖。此時乳酸菌還不是體系中的優(yōu)勢菌種，發(fā)酵啟動速度較慢。第1～3 天泡菜液pH 值下降顯著，乳酸菌數(shù)量從第1天的6.62 lg（CFU/mL）上升到第3 天的7.45 lg（CFU/mL），說明乳酸菌在第1～3 天生長迅速，菌落總量略微下降，發(fā)酵已啟動。3 d 后，乳酸菌發(fā)酵不斷產(chǎn)生乳酸，導致pH 值下降，為乳酸菌的生長提供了適宜的環(huán)境條件，同時抑制了雜菌生長，乳酸菌數(shù)量大幅增加。之后幾天，乳酸菌占據(jù)泡菜汁中的絕大部分，其總數(shù)約為7.86 lg（CFU/mL），菌落總數(shù)先增后降，從9.11 lg（CFU/mL）降到8.65 lg（CFU/mL）。

圖1 泡菜發(fā)酵過程中pH、菌落總數(shù)、乳酸菌數(shù)量變化Fig.1 The changes in pH，viable counts of LAB and total viable bacterial counts in kimchi during fermentation

2.2 乳酸菌的形態(tài)學鑒定結(jié)果

對泡菜液樣品在MRS 平板上多次劃線，得到單菌落，進行過氧化氫酶試驗與革蘭氏染色。選出過氧化氫酶陰性，即不產(chǎn)氣泡的菌落，編號并保存在體積分數(shù)為20%的甘油管中，置于-20 ℃冰箱中保存。對分離菌株進行二氧化碳產(chǎn)氣試驗，產(chǎn)CO2的分離株為異型乳酸發(fā)酵乳酸菌，不產(chǎn)CO2的分離株為同型乳酸發(fā)酵乳酸菌。表1 列出發(fā)酵0～7 d，從泡菜液中分離的27 株分離菌株的生理生化特性鑒定結(jié)果，圖1 為分離菌株的顯微鏡油鏡觀察圖。

表1 分離乳酸菌生理生化鑒定結(jié)果Table 1 Physiological and biochemical identification of isolated lactic acid bacteria

由分離株的CO2產(chǎn)氣試驗結(jié)果可知分離株中異型乳酸發(fā)酵乳酸菌占比較高。22 個分離株組成主要有融合魏斯氏菌、腸膜明串珠菌、檸檬明串珠菌和乳酸乳球菌。乳酸乳球菌作為異型發(fā)酵的乳酸菌，在無氧條件下從葡萄糖中產(chǎn)生乳酸、乙醇和二氧化碳[15]。同型乳酸發(fā)酵乳酸菌由5 個分離株組成，不能利用葡萄糖產(chǎn)生氣體，主要產(chǎn)物為乳酸。測試CO2發(fā)現(xiàn)，第0 天全部為產(chǎn)氣的異型發(fā)酵菌株，第1 天出現(xiàn)不產(chǎn)氣的同型發(fā)酵菌株。整個發(fā)酵過程中，主要由異型發(fā)酵的菌株占主導地位，促進泡菜的發(fā)酵進程。異型乳酸發(fā)酵在發(fā)酵初始階段可快速改變發(fā)酵環(huán)境，使同型乳酸菌快速繁殖。

2.3 分離菌株分子生物學鑒定結(jié)果

參照竇芳嬌等[16]的方法采用細菌通用引物EU27F 和1492R 對分離菌株的宏基因組DNA 進行擴增。將測得的序列通過16S rDNA 序列分析并在NCBI 網(wǎng)站中BLAST，與GenBank 數(shù)據(jù)庫中已知菌株序列進行比對，結(jié)果見表2。

表2 乳酸菌16S rRNA 序列相似性比對Table 2 Comparison of 16S rRNA sequence similarity of lactic acid bacteria

27 株分離株的比對結(jié)果相似度均高于98%，可以判斷屬于對應的屬。這些主導泡菜發(fā)酵的乳酸菌有腸膜明串珠菌、彎曲乳桿菌、戊糖片球菌、檸檬明串珠菌、融合魏斯氏菌、賀氏明串珠球菌。

由表2 可知，第0 天以魏氏菌為主導發(fā)酵泡菜，第1 天乳酸乳球菌開始增加，逐漸成為主導泡菜發(fā)酵的菌株，第5 天明串珠菌開始增多。這與張其圣等[17]的研究結(jié)果一致，在泡菜的早期發(fā)酵階段，具有異型發(fā)酵特點的大腸桿菌和酵母菌占主導地位。文獻[15]，[18]，[19]報道在泡菜發(fā)酵的前期和中期，腸膜明串珠菌等異型發(fā)酵的菌株占主導。當發(fā)酵液的pH 值較低時，在泡菜發(fā)酵后期，具有兼性或同型發(fā)酵特性的乳酸桿菌占主導地位，明串珠菌逐漸消失。Xiong 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，腸膜明串珠菌能加快泡菜發(fā)酵進程，第5 天該菌消失。夏姣等[21]研究表明，腸膜明串珠菌在泡菜發(fā)酵的第7天消失。腸膜明串珠菌不耐酸，在發(fā)酵后期乳酸大量產(chǎn)生，使環(huán)境pH 值降到不適宜明串珠菌生存，其數(shù)量減少。發(fā)酵第3 天和第5 天分離出彎曲乳桿菌，該菌不僅能在pH 3～10 的環(huán)境中生長，還能產(chǎn)生細菌素，抑制泡菜汁中革蘭氏陽性腐敗菌的生長[22]，延長泡菜保質(zhì)期。

2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

將測得的16S rRNA 序列經(jīng)軟件Mallard 1.02 檢測，去除掉異常序列，正常序列通過Gen-Bank 數(shù)據(jù)庫做同源性BLAST 分析及相關(guān)信息檢索[23-24]。對相關(guān)種屬的典型菌株16S rRNA 基因序列用Clustal X 程序進行完全序列比對，用MEGA5.0 軟件中的Neighbor-Joining 法進行1 000次步長計算[25]，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進行微生物多樣性動態(tài)變化分析，結(jié)果見圖3。7 d 發(fā)酵過程中分離的乳酸菌共有5 個分支，與表2 結(jié)果一致，可確定來自5 個乳酸菌屬。其中彎曲乳桿菌有4 株分別在第3，5，7 天的發(fā)酵液中分離得到，系統(tǒng)發(fā)育分析顯示它們?yōu)椴煌?。LAB 0-3、1-2、1-8 BLAST 結(jié)果顯示為同一種，系統(tǒng)發(fā)育分析顯示為不同菌株。兩株片球菌是從第5 和7 天的發(fā)酵液中分離的，同源性較低，不屬于同一個種。第0 天與第1 天分離的乳酸乳桿菌雖來自同一個種，但不是同一株。魏斯氏菌間的同源性低，不屬于同一種，原因可能是魏斯氏菌在白菜樣品附生菌落中數(shù)量較多，因此在發(fā)酵前、中期（0～3 d）的占比較大，易被分離。本次發(fā)酵分離的明串珠菌分別屬于腸膜明串珠菌、賀氏明串珠菌、檸檬明串珠菌、乳酸明串珠菌4 個屬，分布于不同發(fā)酵階段的泡菜液中。

圖3 分離乳酸菌與4 株標準菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Table 3 Phylogenetic tree of lactic acid bacteria isolated with 4 standard strains

2.5 酸白菜微生物多樣性分析

為探究發(fā)酵7 d 后酸泡菜液中的細菌組成，進行微生物多樣性分析。參考安飛宇等[26]的方法并稍作修改。3 組平行酸白菜發(fā)酵液中細菌屬水平分布，如圖4 所示。在發(fā)酵液中共鑒定出16 個已知細菌屬，只有歐文氏菌屬、明串珠菌屬、乳桿菌屬、片球菌屬、魏斯氏菌屬、假單胞菌屬的豐度超過1%。豐度最高的是歐文氏菌屬，達55.3%，是植物中常見的附生菌之一。也有研究表明歐文氏菌會導致腐敗病害，屬腐敗菌[27]。明串珠菌的豐度達到21.1%，腸膜明串珠菌對人和動物均無毒性和致病作用，且具有抗氧化，改善產(chǎn)品風味和拮抗致病菌的能力。研究表明腸膜明串珠菌是發(fā)酵中、后期的優(yōu)勢菌落，代謝產(chǎn)酸能力強，可為植物乳桿菌的生長繁殖創(chuàng)造低pH 值的適宜環(huán)境[28]。乳桿菌屬的豐度為19.2%，與其它文獻報道一致[29]，是主導泡菜發(fā)酵的乳酸菌之一，可存在于低pH 值環(huán)境中，利用葡萄糖和糖水化合物代謝產(chǎn)乳酸，然而，也會促進具有降解有機酸能力的真菌增殖。片球菌屬豐度為2.95%，與其它報道相比略低，乳酸片球菌耐鹽能力較強，可通過代謝果糖、甘露糖等物質(zhì)產(chǎn)有機酸，增強泡菜風味，還能產(chǎn)生胞外多糖[29]。片球菌能合成片球菌素，被廣泛用作天然抑菌劑。魏斯氏菌在發(fā)酵液中也有一定占比，較第1天更低。魏斯氏菌是發(fā)酵工業(yè)的重要乳酸菌，主要存在于新鮮果蔬和發(fā)酵制品中。劉佳琪等[30]的研究表明融合魏斯氏菌具有富產(chǎn)胞外多糖的特性，常用于食品行業(yè)以改善食品的風味、質(zhì)地與營養(yǎng)。魏斯氏菌還具有膽鹽耐受性和抑菌效應，可在動物和人的腸道中定植并發(fā)揮益生功能。結(jié)果表明在乳酸菌中明串珠菌屬與乳桿菌屬的數(shù)量最多，在酸泡菜發(fā)酵中占據(jù)主要地位。片球菌屬在發(fā)酵后期（5 d 后）也占有一定比例。歐文氏菌和假單胞菌作為非益生菌仍有少量存在于7 d 后的泡菜液中，是潛在的食品安全隱患。

圖4 3 個樣品在屬水平上的細菌組成Fig.4 The bacterial composition of three samples at genus

3 討論與結(jié)論

經(jīng)7 d 的自然發(fā)酵，泡菜液中的pH 值由初始6.0 降到4.15，乳酸菌的數(shù)量由4.65 lg（CFU/mL）增至7.86 lg（CFU/mL），菌落總數(shù)先增后降，由9.11 lg（CFU/mL）降到8.65 lg（CFU/mL），變化趨勢與Zhang 等[31]的報道一致。這是由于乳酸菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量的乳酸，營造了適合自身生長的環(huán)境，抑制了雜菌生長，導致菌落總數(shù)的變化。通過革蘭氏染色、過氧化氫酶試驗、二氧化碳試驗以及16S rRNA 測序成功鑒定出27 株白菜中自然攜帶的乳酸菌，其中10 株明串珠菌，7 株魏斯氏菌，4 株乳酸乳球菌，4 株彎曲乳桿菌和2株戊糖片球菌。

與目前市場在售的酸泡菜相比，自然發(fā)酵酸泡菜發(fā)酵7 d 后pH 值（4.15）在泡菜的正常pH 值（3.5～4.5）范圍內(nèi)[14，32]。在益生菌組成方面，市售泡菜中除了戊糖片球菌、腸膜明串珠菌和魏斯氏菌外，植物乳桿菌也占有很大的比例，然而，植物乳桿菌在本試驗中占比不高，可能的原因是自然發(fā)酵酸泡菜由于前期乳酸菌數(shù)量少，啟動慢，沒能及時抑制雜菌的生長，發(fā)酵7 d 后仍未到達適宜植物乳桿菌生長的pH。在早期（3 d 前）發(fā)酵階段，魏斯氏菌占主導地位，是泡菜發(fā)酵過程中的主要菌種，在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生各種酸和酶，增加泡菜的風味，而腸膜明串珠菌在保持泡菜獨特風味和口味以及良好的品質(zhì)方面有著重要作用[33]。

對發(fā)酵7 d 后的泡菜液進行微生物多樣性分析表明，雖然自然發(fā)酵泡菜中益生菌占比不低，但是仍存在數(shù)量很高的腸桿菌，如歐文氏菌一類在土壤中普遍存活的非益生菌。參考以往對白菜附生菌落的研究，腸球菌目的歐文氏菌屬是白菜的附生菌，數(shù)量在3～3.5 lg（CFU/g）范圍。自然發(fā)酵泡菜中若乳酸菌起始繁殖不夠快，則會導致附生菌落如歐文氏菌假單胞菌等雜菌生長繁殖不受限，進而導致pH 降低速度慢，泡菜品質(zhì)不高等問題，也會導致傳統(tǒng)發(fā)酵酸泡菜存在潛在食品安全問題[34]。