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        發(fā)芽綠豆多酚的降血糖作用及對糖尿病小鼠腸道菌群的影響

        2023-08-18 14:48:56沈鑫婷姜秀杰許慶鵬張愛武張東杰
        中國食品學(xué)報 2023年7期
        關(guān)鍵詞:綠豆菌群腸道

        沈鑫婷,姜秀杰,許慶鵬,張愛武,張東杰*

        (1 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品加工研究所 黑龍江省食品加工重點實驗室黑龍江省全谷物營養(yǎng)食品工程技術(shù)研究中心 哈爾濱 150086 2 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 黑龍江 大慶 163000)

        2 型糖尿?。═ype 2 diabetes,T2DM)是代謝性疾病,主要以高血糖和胰島素抵抗為特征[1-2]。T2DM 的大多數(shù)治療干預(yù)都集中在通過刺激胰島素分泌、減少葡萄糖產(chǎn)生或增強胰島素對靶組織的作用來降低血糖水平[3-4]。而近年來許多研究表明,腸道菌群也是參與糖尿病發(fā)生和發(fā)展的一個重要因素,由于腸道微生物群結(jié)構(gòu)和功能上的變化和高血糖、胰島素抵抗等糖尿病表型密切相關(guān),腸道菌群及其相關(guān)代謝產(chǎn)物在血糖代謝、胰島素抵抗以及慢性炎癥等2 型糖尿病的病理生理機制中發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)無論是飲食干預(yù)還是藥物治療,腸道都是調(diào)節(jié)糖尿病的重要場所。對腸道菌群[5]調(diào)節(jié)影響最大的因素是飲食因素,如高脂或高糖飲食,可能導(dǎo)致腸道菌群發(fā)生變化,進而引發(fā)腸道炎癥。T2DM 還存在不同程度的慢性低度炎癥反應(yīng)[6],常伴有炎癥因子,如白細胞介素和腫瘤壞死因子升高。胰島β 細胞的結(jié)構(gòu)和功能受損可能由炎癥因子的釋放所致,甚至導(dǎo)致胰島素分泌和轉(zhuǎn)運發(fā)生障礙[7]。而通過腸道菌群可調(diào)節(jié)代謝疾病的屏障功能和宿主炎癥狀態(tài)。

        綠豆是中國重要的食用豆類作物之一[8]。由于它的纖維成分含量高,糖分含量比較低,因此是糖尿病患者的推薦食物。綠豆的發(fā)芽過程實質(zhì)是綠豆的活化過程。發(fā)芽處理為雜糧加工手段之一,可有效提高谷物的營養(yǎng)價值和生物活性成分含量。大量研究證實綠豆的化學(xué)成分,尤其是多酚具有降低慢性疾病風(fēng)險的健康益處[9-11]。酚類物質(zhì)是植物次生代謝產(chǎn)物,體外和臨床研究均表明[12],多酚能夠調(diào)節(jié)腸道微生物群,有助于腸道健康的積極變化,減少炎癥過程,從而改善全身疾病狀態(tài)。

        本實驗以綠豆為原料,發(fā)芽處理后,經(jīng)提取、純化得到多酚提取物。建立T2DM 小鼠模型,對造模成功的小鼠灌胃不同劑量的多酚提取物,通過空腹血糖值、葡萄糖耐受量、胰島素水平以及炎癥因子和肝臟組織切片的分析,探究發(fā)芽綠豆多酚提取物調(diào)控血糖及抗炎的效果。采用高通量測序技術(shù),探究其對小鼠腸道菌群的影響,以及糖尿病與腸道菌群和炎癥因子間的聯(lián)系。旨在干預(yù)并改善2 型糖尿病,為天然、安全、有效的降糖功能性食品的開發(fā)提供理論參考。

        1 材料與方法

        1.1 動物、材料與試劑

        SPF 級C57BL/6 小鼠(18~20 g),雄性,遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司(許可證號:SCXK(遼)2020-0001),本實驗動物處理遵循黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物倫理委員會原則?;A(chǔ)飼料、高脂飼料,南通特洛菲飼料有限公司。

        綠豆,黑龍江省大慶市巴哈西伯綠豆,發(fā)芽綠豆多酚提取物由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院實驗室自制;STZ,美國Sigma 公司;GA-3 血糖試紙,三諾生物有限公司;鹽酸二甲雙胍,上海源葉生物科技有限公司;檢測試劑盒(FINS、TNF-α、IL-6、IL-10、CPR),南京建成生物有限公司;其它化學(xué)試劑均為分析純級。

        1.2 儀器與設(shè)備

        GA-3 血糖儀,三諾生物有限公司;TU-1810紫外-可見分光光度計,北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;酶標儀,中國邁瑞醫(yī)療公司;RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠;高速冷凍離心機,美國Eppendorf 公司。

        1.3 方法

        1.3.1 發(fā)芽綠豆多酚的制備流程 發(fā)芽綠豆多酚的制備[13-16]:挑選新鮮優(yōu)質(zhì)綠豆進行發(fā)芽處理,利用響應(yīng)面優(yōu)化法,確定綠豆最佳的發(fā)芽工藝為:浸泡溫度25 ℃,浸泡時間11 h,發(fā)芽溫度28 ℃,發(fā)芽時間3 d,浸泡液CaCl2濃度2 mmol/L,在此條件下,多酚含量為487.81 mg/100 g。綠豆經(jīng)過發(fā)芽處理,取出沖洗、烘干(40 ℃,鼓風(fēng)干燥箱)、粉碎(過80 目篩)。稱取過篩后的發(fā)芽綠豆粉于燒杯中,根據(jù)1∶26(g/mL)的料液比加入70%的乙醇溶液,經(jīng)過超聲、離心(5 000 r/min,15 min)、取上清液,在45 ℃條件下,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,即得發(fā)芽綠豆多酚粗提物。對多酚粗提物純化(AB-8 大孔樹脂),收集純化后溶液,冷凍干燥,制得綠豆發(fā)芽多酚提取物(Germinated mung bean polyphenol,GMP)。

        1.3.2 2 型糖尿病小鼠模型的建立 SPF 級C57BL/6 雄性小鼠在12 h 明暗交替(8∶00~20∶00),室溫(23±2)℃,相對濕度40%左右且通風(fēng)良好的環(huán)境下,分籠飼養(yǎng),實驗期間均自由飲食、飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后,根據(jù)體質(zhì)量進行隨機分組:正常對照組(n=6)和造模組(n=30),正常組進食基礎(chǔ)飼料、造模組進食高脂飼料。飼養(yǎng)4 周后,禁食12 h,造模組小鼠腹腔注射30 mg/kg bw 的STZ,正常組注射相同體積檸檬酸緩沖液(pH=4)[17-18]。注射72 h 后測定空腹血糖值,并在造模后第7 天檢測空腹血糖水平仍超過11.1 mmol/L 且伴隨表現(xiàn)出“三多一少”特征的小鼠視為造模成功。

        1.3.3 動物分組及給藥方法 造模成功的小鼠隨機分為5 組:模型組(M)、陽性對照組(MET,二甲雙胍,150 mg/kg)、高劑量組(MGPH,150 mg/kg)、中劑量組(MGPM,100 mg/kg)、低劑量組(MGPL,50 mg/kg)。日常飼養(yǎng)期間采取自由飲食、飲水。MET 組以及低、中、高劑量干預(yù)組分別用二甲雙胍水溶液和發(fā)芽綠豆多酚提取物水溶液進行灌胃,正常組(N)和模型組(M)灌胃相同體積的生理鹽水,連續(xù)灌胃5 周。實驗期間,每天觀察動物進食量、精神狀態(tài)、毛發(fā)色澤等,每周按時稱量小鼠體質(zhì)量。

        1.3.4 空腹血糖值測定及口服葡萄糖耐受實驗每周按時禁食12 h,測定空腹血糖值(FBG)。在最后一次灌胃結(jié)束后,小鼠禁食6 h,灌胃25%的葡萄糖溶液(2 g/kg bw),測定灌胃0,30,60,90,120 min 的血糖值,根據(jù)公式(1)計算血糖曲線下面積(AUC),并通過曲線下面積表達葡萄糖耐受量(OGTT)的變化。

        1.3.5 血清指標檢測 實驗結(jié)束時,小鼠禁食12 h,用乙醚麻醉,眼球取血,室溫下靜置30 min,低溫高速離心機3 500 r/min 離心10 min,取血清。采用ELISA 法進行指標檢測。

        胰島素抵抗的穩(wěn)態(tài)模型評估(HOMA-IR)根據(jù)公式(2)計算:

        1.3.6 肝組織的病理切片觀察 取部分固定在4%多聚甲醛中新鮮的肝臟組織,進行石蠟包埋、切片(厚度約為4 μm)、染色、水洗、封片處理,自然晾干,用電子顯微鏡觀察組織變化,拍照記錄。

        1.3.7 腸道菌群檢測 取小鼠糞便樣品收集在密封的無菌塑料管中。采樣后立即用液氮將糞便冷凍,并保存在-80 ℃下。對糞便進行DNA 的提取、PCR 擴增、測序。

        1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

        用SPSS 26.0 對實驗結(jié)果進行分析處理,組間兩兩比較用ANOVA 方差分析法。P<0.05 表示有統(tǒng)計學(xué)顯著差異,P<0.01 表示有極顯著性差異。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 GMP 對糖尿病小鼠一般體征的影響

        實驗期間,觀察發(fā)現(xiàn)正常組小鼠精神狀態(tài)良好,毛發(fā)光滑,實驗前、后的進食量、飲水量比較穩(wěn)定,體質(zhì)量逐漸增長。糖尿病模型組小鼠精神比較萎靡,毛發(fā)暗淡無光澤,實驗前、后對比出現(xiàn)了“三多一少”的癥狀。陽性對照組和GMP 各劑量干預(yù)組小鼠體質(zhì)量下降幅度減少,精神狀態(tài)也有所好轉(zhuǎn)。如表1 所示,造模成功后,模型組小鼠的體質(zhì)量和正常組小鼠相比顯著下降(P<0.01);實驗結(jié)束時,與模型組對比,GMPM 組、GMPH 組和MET組小鼠的體質(zhì)量都顯著增加。

        表1 GMP 對小鼠體質(zhì)量的影響(,n=6)Table 1 Effect of GMP on body weight of mice(,n=6)

        表1 GMP 對小鼠體質(zhì)量的影響(,n=6)Table 1 Effect of GMP on body weight of mice(,n=6)

        注:##.表示模型組與正常組比較差異極顯著(P<0.01);*.表示各組與模型組比較差異顯著(P<0.05);**.表示各組與模型組比較差異極顯著(P<0.01),下同。

        2.2 GMP 對糖尿病小鼠空腹血糖及口服葡萄糖耐量的影響

        由表2 可知,正常組小鼠空腹血糖濃度比較穩(wěn)定,模型組小鼠的空腹血糖濃度在造模成功后呈逐漸上升的趨勢;與模型組相比,在干預(yù)第4 周時,中、高劑量組空腹血糖均極顯著低于模型組;在實驗結(jié)束時,低、中、高劑量組的空腹血糖濃度表現(xiàn)出極顯著低于模型組(P<0.01)。測定結(jié)果表明,GMP 可以改善T2DM 小鼠干預(yù)期間的血糖水平,各劑量干預(yù)組中以高劑量組的多酚溶液效果最佳。

        表2 GMP 對小鼠血糖的影響(,n=6)Table 2 Effect of GMP on blood glucose in mice(,n=6)

        表2 GMP 對小鼠血糖的影響(,n=6)Table 2 Effect of GMP on blood glucose in mice(,n=6)

        糖耐量即機體對葡萄糖的耐受情況,判斷干預(yù)后胰島β 細胞對血液中血糖調(diào)節(jié)能力的強弱。血糖曲線下面積(AUC)反映的是人體利用和清除葡萄糖的程度,當AUC 增大則說明機體對葡萄糖的耐受能力下降,反之能力升高。如表3 所示,N組的血糖值隨著時間的延長變化平緩,M 組小鼠血糖在前30 min 內(nèi)迅速升高,在達到峰值后呈下降趨勢,而血糖值一直較高。各劑量干預(yù)組的血糖值在60 min 后出現(xiàn)緩慢下降的趨勢,均未恢復(fù)到初始血糖值。根據(jù)AUC 顯示,M 組顯著高于N 組(P<0.01),與M 組相比,各劑量干預(yù)組和陽性對照組呈現(xiàn)顯著性降低(P<0.01)。結(jié)果表明,GMP 可以在一定程度上提高T2DM 小鼠的糖耐量,而且從恢復(fù)程度上看,高劑量組的效果較好。

        表3 發(fā)芽綠豆多酚對小鼠糖耐量的影響Table 3 Effects of germinated mung bean polyphenols on glucose tolerance in mice

        2.3 GMP 對糖尿病小鼠胰島素水平及胰島素抵抗指數(shù)的影響

        胰島素是胰島β 細胞分泌的、唯一能夠降低血糖的激素,對調(diào)節(jié)血糖有重要影響。如圖1 所示,與正常組比較,模型組的胰島素水平和HOMA-IR 指數(shù)顯著升高(P<0.01);與模型組相比,陽性對照組胰島素水平明顯降低(P<0.05),多酚提取物各劑量干預(yù)組顯著降低了HOMA-IR 指數(shù)水平(P≤0.01),而胰島素水平雖有下降,但無顯著性差異。表明發(fā)芽綠豆多酚提取物可以增加2 型糖尿病小鼠的胰島素敏感性,降低胰島素抵抗。

        圖1 GMP 對糖尿病小鼠胰島素水平及胰島素抵抗指數(shù)的影響Fig.1 Effect of GMP on insulin level and insulin resistance index in diabetic mice

        2.4 GMP 對糖尿病小鼠的炎癥反應(yīng)

        GMP 對T2DM 小鼠炎癥反應(yīng)的影響如圖2所示,與正常組相比,模型組小鼠血清中IL-6 從227.37 ng/L 上升到309.25 ng/L,顯著升高了36%;TNF-α 從44.22 ng/L 升高到81.64 ng/L,顯著升高了84.62%;C 反應(yīng)蛋白(CRP)從27.84 μg/mL 升高到47.68 μg/mL,顯著升高了71.26%;IL-10 顯著降低了37.54%。CRP 是一種非特異的炎癥標志物,由肝細胞所合成,其合成的最重要的調(diào)節(jié)因子是IL-6 和TNF-α,其升高的程度反映了炎癥組織的大小和活動性。當C 反應(yīng)蛋白值為10~50 mg/L時,表示輕度炎癥。說明與正常組相比,模型組出現(xiàn)了炎癥反應(yīng)。

        圖2 GMP 對糖尿病小鼠炎癥因子的影響Fig.2 Effect of GMP on inflammatory factors in diabetic mice

        與模型組比較,GMP 中、高劑量干預(yù)組的IL-6 質(zhì)量濃度從309.25 ng/L 分別降低至265.83,209.91 ng/L,顯著降低了14.04%,32.12%(P<0.05,P<0.01),低劑量干預(yù)組降低了9%,而無顯著差異。低、中、高劑量干預(yù)組以及陽性對照組的TNFα 質(zhì)量濃度與模型組相比,顯著降低了23.33%,41.18%,35.25%,42.16%(P<0.01);IL-10 質(zhì)量濃度與模型組比,顯著升高了23.02%,35.88%,59.07%,52.15%(P<0.01);中、高劑量干預(yù)組以及陽性對照組的CRP 質(zhì)量濃度與模型組相比,顯著降低了16.97%,48%,51.13%,低劑量干預(yù)組降低了10%,然而無顯著差異。說明GMP 干預(yù)組可以顯著降低IL-6、TNF-α、CPR 的水平,升高IL-10的水平,進而緩解糖尿病引起的炎癥反應(yīng)。

        與模型組對比,動物內(nèi)臟均未出現(xiàn)嚴重損傷情況,說明發(fā)芽綠豆多酚灌胃劑量對動物是安全的。如圖3 所示,N 組的肝組織結(jié)構(gòu)基本正常,未見炎癥細胞浸潤,肝細胞結(jié)構(gòu)飽滿,組織中央靜脈清晰可見,肝竇呈放射狀沿著中央靜脈,紅色箭頭所示為肝竇巨噬細胞。M 組的肝組織結(jié)構(gòu)異常,肝細胞結(jié)構(gòu)疏松,組織可見較多炎癥細胞浸潤(黑色箭頭所示)。MET 組的肝組織未見明顯炎癥細胞浸潤,肝細胞結(jié)構(gòu)飽滿。GMPL 組部分肝細胞輕微水腫,組織可見明顯炎癥細胞浸潤(黑色箭頭所示)。GMPM 組的肝組織結(jié)構(gòu)輕度異常,未見明顯炎癥細胞浸潤,部分肝細胞輕微水腫(黃色箭頭所示)。GMPH 組的肝組織結(jié)構(gòu)基本正常,肝細胞結(jié)構(gòu)飽滿,組織中央靜脈清晰可見,未見明顯炎癥細胞浸潤。

        圖3 GMP 對糖尿病小鼠肝臟炎癥反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of GMP on liver inflammation in diabetic mice

        2.5 GMP 對糖尿病小鼠腸道菌群的影響

        2.5.1 小鼠腸道Alpha 多樣性分析 Alpha 多樣性(Alpha diversity)表示單獨樣品的物種豐度及其物種多樣性,有不同衡量指標。如圖4 所示,模型組的腸道菌群ACE、Chao、Shanon、Simpson 指數(shù)低于正常組,表明了T2DM 小鼠的物種多樣性降低。與模型組相比,GMP 能夠提高腸道菌群的α多樣性指數(shù),抑制腸道菌群豐富度下降的能力,并能增加菌群的物種多樣性。本實驗還統(tǒng)計了覆蓋率,其數(shù)值反映測序結(jié)果是否代表了樣品中微生物的真實情況,覆蓋率越高,則物種被檢測出來的概率越大。說明GMP 干預(yù)可以在一定程度上平衡失調(diào)的腸道菌群。

        圖4 小鼠腸道菌群的α 多樣性指數(shù)Fig.4 Changes of intestinal flora in mice α diversity index

        2.5.2 小鼠腸道微生物物種分類分析 如圖5 所示,對每組在門水平上比較分析,結(jié)果顯示腸道菌群主要有:厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、疣孢菌門(Verrucomicrobia)等。與N 組小鼠對比,M 組小鼠腸道厚壁菌豐度顯著升高,擬桿菌的豐度顯著降低(P<0.01),與M 組比較,多酚提取物干預(yù)后,厚壁菌豐度顯著降低,擬桿菌豐度顯著升高,變形桿菌門相對豐度顯著降低。表明菌株在門水平上的豐度會影響腸道菌群的平衡。

        圖5 腸道菌群門水平分析Fig.5 Analysis of phylum level of intestinal flora in mice

        2.6 血清炎癥因子和腸道菌群與代謝指標的相關(guān)性分析

        用Spearman 相關(guān)分析,血清炎癥因子、腸道菌群與糖代謝指標的相關(guān)性。如圖6 顯示,小鼠的空腹血糖(FBG)與IL-6、TNF-α、CPR、厚壁菌門、變形菌門呈正相關(guān),與IL-10、擬桿菌門呈負相關(guān)。厚壁菌門、變形菌門與IL-6、TNF-α、CPR 呈正相關(guān),與IL-10 呈負相關(guān)。擬桿菌門與IL-6、TNF-α、CPR 呈負相關(guān),與IL-10 呈正相關(guān)。

        圖6 血清炎癥因子和腸道菌群與代謝指標的相關(guān)性分析熱圖Fig.6 Heat map of correlation analysis between serum inflammatory factors,intestinal flora and metabolic indexes

        3 討論

        2 型糖尿病通常被稱為非胰島素依賴型糖尿病,是一種以持續(xù)高血糖診斷為基礎(chǔ)的代謝性疾病[19]。近年來,2 型糖尿病的患病率逐年上升,目前市場上治療糖尿病的常用藥物雖然具有較好的效果,但大多存在一定副作用[20]。因此開發(fā)一種天然、安全、有效的降糖功能性食品,成為當前糖尿病研究的熱點。一項流行病學(xué)研究表明,攝入富含多酚的飲食可以大大降低患糖尿病的風(fēng)險[21]。

        本文探究發(fā)芽綠豆中提取的多酚的降糖效果。在GMP 干預(yù)5 周后,結(jié)果顯示,GMP 可顯著改善T2DM 小鼠的“三多一少”癥狀,降低T2DM小鼠的高血糖和胰島素抵抗,減輕炎癥反應(yīng),并對肝臟組織起到保護或修復(fù)作用。肝臟是參與代謝的關(guān)鍵炎癥器官,參與代謝物的儲存和排泄[22],實驗結(jié)果表明GMP 能修復(fù)小鼠肝細胞溶解、炎癥細胞浸潤現(xiàn)象,使肝損傷情況得到改善。其上述作用的發(fā)揮與腸道菌群的調(diào)節(jié)存在相關(guān)性。GMP 可調(diào)節(jié)糖尿病小鼠門水平上的菌群豐度,厚壁菌門和變形菌門豐度增加,其血糖和炎癥指標水平也越高;擬桿菌門豐度增加,其血糖和炎癥指標水平降低。有研究發(fā)現(xiàn)擬桿菌門具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫的作用,在炎癥小鼠模型的腸道菌群中,擬桿菌門的數(shù)量降低[23-24]。與本實驗結(jié)果一致。近年來有許多動物實驗和臨床試驗表明,多酚可以通過不同機制調(diào)節(jié)腸道中微生物菌群、微生物多樣性以及厚壁菌門與擬桿菌門的比例(F/B)[25-27];并且多酚對葡萄糖代謝有益,可顯著改善機體葡萄糖耐受[28],由于飲食攝入后第1 個接觸的器官是胃腸道,因此腸道可能是多酚發(fā)揮代謝作用的主要場所[29]。而且T2DM 小鼠腸道菌群的物種多樣性、豐度與血糖、炎癥因子水平密切相關(guān)。因此通過調(diào)節(jié)腸道菌群、改善炎癥反應(yīng)來改善T2DM 等代謝性疾病,被認為是目前新的治療策略[30]。

        綜上所述,一定劑量的發(fā)芽綠豆多酚提取物可以顯著改善2 型糖尿病小鼠的血糖水平,同時改善炎癥反應(yīng),并對肝損傷起到一定程度的修復(fù)作用;增加腸道菌群的多樣性,平衡失調(diào)的腸道菌群。結(jié)果表明發(fā)芽綠豆多酚提取物是一種具有潛力和研究價值的天然降糖物質(zhì),在糖尿病治療中具有廣闊前景。

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