楊 陽(yáng)，郭 帥，武 婷，馮 超，徐 盛，王記成，張和平

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)蒙古乳品生物技術(shù)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 呼和浩特 010018）

發(fā)酵乳是以生牛乳或復(fù)原乳為原料，經(jīng)巴氏殺菌后添加發(fā)酵劑，在一定條件下發(fā)酵制得對(duì)人體有益的凝乳狀產(chǎn)品。在發(fā)酵過(guò)程中，乳酸菌可產(chǎn)生如乳酸、有機(jī)酸、氨基酸、B 族維生素及酶類等對(duì)人體具有潛在健康作用的代謝物質(zhì)[1]。益生菌（Probiotics）是一類可促進(jìn)宿主腸道內(nèi)微生物菌群生態(tài)平衡，且對(duì)宿主健康或生理功能產(chǎn)生有益作用的活性微生物[2]，又被稱為活菌制劑、生態(tài)制劑和微生態(tài)調(diào)節(jié)劑。目前益生菌主要有兩大類，即乳桿菌類和雙歧桿菌類[3]。

發(fā)酵乳作為益生菌發(fā)揮健康作用的理想載體，展示出發(fā)酵乳和益生菌的雙重益生功效[4]。益生菌發(fā)酵乳（本文指發(fā)酵菌種不含嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌）不僅在益生菌數(shù)量上保持較高水平，而且含有更多的生物活性物質(zhì)[5]。此外，能顯著改善腸道微生態(tài)平衡，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力，降低血清中膽固醇含量，提高機(jī)體抗氧化能力，延緩衰老等[5]。

本試驗(yàn)所選菌株為乳雙歧桿菌V9（Bifidobacterium animalissubsp.V9（V9）、副干酪乳桿菌PC-01（Lacticaseibacillus paracaseiPC-01（PC-01）和植物乳桿菌P-8（Lactiplantibacillus plantarumP-8（P-8）。其中，V9 分離自內(nèi)蒙古自治區(qū)健康蒙古族兒童腸道[6]；PC-01 分離自西藏拉薩地區(qū)當(dāng)雄縣龍仁鄉(xiāng)自然發(fā)酵酸牦牛奶[7]；P-8 分離自內(nèi)蒙古自治區(qū)草原牧民家庭中的自然發(fā)酵酸牛乳[8]。所述菌種對(duì)酸和膽鹽均具有較強(qiáng)的耐受性，同時(shí)具有抗菌、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)作用，是益生菌發(fā)酵乳開(kāi)發(fā)的理想菌株[6-8]。將上述3 株益生菌應(yīng)用于復(fù)合益生菌發(fā)酵牛乳中，對(duì)其發(fā)酵特性、貯藏特性進(jìn)行評(píng)價(jià)，為益生菌發(fā)酵乳制品工業(yè)生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料和設(shè)備

1.1.1 試驗(yàn)菌株 試驗(yàn)所用V9、PC-01 和P-8 直投式發(fā)酵劑均由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。對(duì)照發(fā)酵劑，科漢森（中國(guó)）有限公司，含保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌，依推薦量添加。

1.1.2 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)材料見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)原料表Table 1 List of test materials

1.1.3 試驗(yàn)儀器與設(shè)備 FE28 型pH 計(jì)，梅特勒（上海）有限公司；Brookfield DV-2T 型黏度計(jì)，美國(guó)Brookfield 公司；微流變儀Rheolaser Master，法國(guó)Formulaction 公司；NSC-II A-1200 型無(wú)菌工作臺(tái)，蘇州蘇凈有限公司；SRH60-70 型高壓均質(zhì)機(jī)，上海申鹿均質(zhì)機(jī)有限公司；電熱恒溫水浴鍋，天津知署科技有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，上海恒科技儀器有限公司；日立L-8900 高速氨基酸分析儀，北京華旭世紀(jì)科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵乳的制備 以牛乳和白砂糖為基料制備發(fā)酵乳，將牛乳（94%，V/V）通過(guò)水浴的方式預(yù)熱至65 ℃后，添加白砂糖（60 g/L），65 ℃攪拌15 min 直至完全溶解，于65 ℃，20 Mpa 條件下均質(zhì)，95 ℃殺菌5 min，冷卻至（37±0.5）℃接種發(fā)酵，發(fā)酵完成后進(jìn)行無(wú)菌灌裝，放置于10 ℃條件下儲(chǔ)存28 d，每隔7 d 檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。試驗(yàn)分為2 組，以商業(yè)發(fā)酵劑為對(duì)照組（Fermented milk，F(xiàn)M），試驗(yàn)組為益生菌發(fā)酵乳（PFM），具體接種量見(jiàn)表2。

表2 菌種接種量Table 2 Inoculation amount of strains

1.2.2 微流變學(xué)參數(shù)變化測(cè)定 利用光學(xué)微流變儀檢測(cè)發(fā)酵乳發(fā)酵期間的凝膠體系穩(wěn)定性。將20 mL 樣品轉(zhuǎn)移至滅菌玻璃瓶中，移至測(cè)定槽中觀測(cè)發(fā)酵過(guò)程中彈性因子（Elastic index，EI）、流動(dòng)因子（Fluidity index，F(xiàn)I）、宏觀黏度因子（Macroscopic viscosity index，MVI）以及固液平衡值（Solid liquid balance，SLB）隨時(shí)間的變化情況。設(shè)置流變儀溫度為37 ℃，每隔1 min 采集1 次數(shù)據(jù)，樣品發(fā)酵結(jié)束后停止測(cè)定，根據(jù)儀器自帶分析軟件獲取相關(guān)流變學(xué)參數(shù)，綜合評(píng)價(jià)發(fā)酵乳微流變特性[9]。

1.2.3 活菌數(shù)的測(cè)定 將制備好的發(fā)酵乳于10℃條件下貯藏28 d，分別在1，7，14，21，28 d 參照國(guó)標(biāo)GB 4789.2-94[10]進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，使用選擇性培養(yǎng)基，分別計(jì)算菌落總數(shù)。

1.2.4 酸度的測(cè)定 pH 值采用梅特勒FE20 型pH 計(jì)測(cè)定，每個(gè)樣品測(cè)定3 次平行并計(jì)算平均值；滴定酸度（TA）按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.239-2016 中規(guī)定的“酚酞指示劑法”進(jìn)行檢測(cè)[11]。具體方法：取5.0 g 發(fā)酵乳樣品，加40 mL 蒸餾水，滴2～3 滴酚酞指示劑（0.5%），充分搖勻后，用0.1 mol/L 的NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至微紅色，30 s 內(nèi)不褪色。記錄消耗NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升數(shù)，每個(gè)樣品測(cè)定3 次平行并計(jì)算平均值。

1.2.5 持水力和黏度的測(cè)定 持水力：準(zhǔn)確稱取20.0 g 發(fā)酵乳樣品，置于有濾紙的漏斗中，室溫靜置2 h 后收集濾液并稱重[12]，按如下公式計(jì)算持水力：

黏度采用BROOKFIELD DV-1 VISCOMETER 型黏度計(jì)4# 轉(zhuǎn)子在常溫下測(cè)定，轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速100 r/min，扭矩10%～100%，測(cè)定時(shí)間30 s。每個(gè)樣品測(cè)定3 次平行并計(jì)算平均值。

1.2.6 發(fā)酵乳中游離氨基酸檢測(cè) 使用日立L-8900 高速氨基酸分析儀進(jìn)行監(jiān)測(cè)，色譜柱：2622#pH 離子交換色譜柱4.5 mm×60 mm。進(jìn)樣量：20 μL，柱溫：57 ℃，流速：衍生試劑0.35 mL/min。緩沖液：0.4 mL/min。

準(zhǔn)確稱取3 g 樣品于15 mL 離心管中，加0.02 mol/L 的鹽酸5 mL，旋渦混勻5 min，超聲提取5 min，避光靜置2 h，4 000×g 離心10 min，準(zhǔn)確取1 mL 上清液，加入1 mL 6%～8%磺基水楊酸，渦旋1 min，避光靜置1 h，15 000×g 離心15 min，取上清液用0.22 μm 的濾膜過(guò)濾上機(jī)測(cè)定。

1.2.7 感官評(píng)價(jià) 采用評(píng)分測(cè)驗(yàn)法，選擇評(píng)價(jià)指標(biāo)為氣味、滋味、質(zhì)地色澤、口感，對(duì)PFM 組和FM組進(jìn)行對(duì)比評(píng)價(jià)。請(qǐng)10 位有品嘗經(jīng)驗(yàn)、不同性別的專業(yè)人員進(jìn)行評(píng)價(jià)，按照樣品擺放的順序從左至右評(píng)價(jià)員依次品嘗樣品后打分，將所有數(shù)據(jù)求平均值。

表3 感官評(píng)價(jià)表Table 3 Sensory tasting table

1.2.8 數(shù)據(jù)分析 微流變數(shù)據(jù)采用Rheolaser Master 型光學(xué)法微流變分析儀自帶的Smart 軟件進(jìn)行分析；偏最小二乘判別分析（PLS-DA）使用MetaboAnalyst 5.0（https：//www.MetaboAnalyst.ca）進(jìn)行分析；游離氨基酸分析、活菌數(shù)、酸度、黏度和持水力的結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用Origin 2020 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵乳發(fā)酵過(guò)程的微流變學(xué)變化

MS-DWS 微流變技術(shù)主要根據(jù)發(fā)酵乳中微粒運(yùn)動(dòng)和體積變化來(lái)研究其膠凝機(jī)理[5，13]。由于發(fā)酵乳在發(fā)酵過(guò)程中，內(nèi)部環(huán)境酸度會(huì)逐漸下降，導(dǎo)致發(fā)酵乳中固有的聚集體出現(xiàn)不同變化，酪蛋白顆粒結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，最終形成以酪蛋白膠粒為基礎(chǔ)的凝膠結(jié)構(gòu)[14-15]。由圖1 可知，各組發(fā)酵乳的SLB、EI、MVI 和FI 變化趨勢(shì)相同，而各組發(fā)酵乳的這些流變學(xué)特性之間存在一定差異。

圖1 發(fā)酵過(guò)程的微流變學(xué)變化Fig.1 Microrheological changes during fermentation

SLB 表示產(chǎn)品偏向固態(tài)或液態(tài)的與時(shí)間對(duì)應(yīng)的函數(shù)關(guān)系。當(dāng)發(fā)酵乳的SLB 變化范圍在0～0.5之間，表現(xiàn)出彈性模量，偏向于固態(tài)質(zhì)地；在0.5～1.0 之間，則表現(xiàn)出黏性模量，偏向于液態(tài)質(zhì)地[16-17]。如圖1 所示，PMF 組和FM 組的SLB 最初起伏較大，PMF 組在發(fā)酵前期SLB 處于波動(dòng)狀態(tài)，13.5 h后SLB 恢復(fù)為較低值并出現(xiàn)拐點(diǎn)，隨后逐漸增加直至發(fā)酵結(jié)束，結(jié)束時(shí)間為17 h，其彈性模量偏向于液態(tài)；FM 組的SLB 在發(fā)酵前期3.5 h 恢復(fù)為較低值，隨后逐漸增加直至發(fā)酵結(jié)束，結(jié)束時(shí)間為5.5 h，其彈性模量偏向于固態(tài)。PMF 組的SLBpH=4.6略高于FM 組，且達(dá)到凝膠點(diǎn)（SLB=0.5）所需時(shí)間更長(zhǎng)。

MVI 作為直接反映黏性模量的時(shí)間函數(shù)，可以顯示出發(fā)酵乳的黏度變化[16-17]。由圖1 可知，PMF 組和FM 組的MVI 變化趨勢(shì)是一個(gè)多級(jí)過(guò)程，PMF 組發(fā)酵前期13 h 和FM 組發(fā)酵前期3.5 h 時(shí)樣品黏度無(wú)明顯變化，處于低黏度的初始停滯階段；隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，樣品黏度迅速上升，進(jìn)入黏度快速變化階段；隨后，各發(fā)酵乳樣品MVI分別在17 h 和5.5 h 時(shí)上升至最大值，進(jìn)入高黏度階段，此時(shí)的發(fā)酵乳形成了較為穩(wěn)定的凝膠體系[15]。而PMF 組在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，相比于FM 組具有更穩(wěn)定的凝膠體系。

EI 作為直接反映彈性模量的時(shí)間函數(shù)，可以快速、簡(jiǎn)便地表征一個(gè)樣品的凝膠硬度。EI 值與凝膠彈性變化呈正比，EI 值越大，凝膠結(jié)構(gòu)越強(qiáng)，樣品越穩(wěn)定[18-19]。如圖1 所示，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，PMF 組和FM 組的EI 值明顯升高，PMF 組在發(fā)酵0～13 h 內(nèi)保持穩(wěn)定，F(xiàn)M 組在發(fā)酵0～3 h 內(nèi)保持穩(wěn)定，兩者均無(wú)明顯差異，此時(shí)酸乳中酪蛋白還未形成凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。當(dāng)PMF 組發(fā)酵13 h，F(xiàn)M 組發(fā)酵3 h 后，EI 值出現(xiàn)拐點(diǎn)，達(dá)到凝膠點(diǎn)；由于發(fā)酵乳中酪蛋白完全解離并迅速聚集形成凝膠結(jié)構(gòu)，EI 值明顯升高且達(dá)到最大值[20]。隨后，二者的EI值略微下降，而FM 組的EI 值最大，說(shuō)明添加益生菌后的發(fā)酵乳其彈性有一定程度的下降。

FI 變化能表征發(fā)酵乳的流動(dòng)性，反映發(fā)酵乳中微觀粒子的運(yùn)動(dòng)快慢，F(xiàn)I 值越大則樣品流動(dòng)性越強(qiáng)[21]。其中高流動(dòng)因子（約10 Hz）為液態(tài)性質(zhì)，低流動(dòng)因子（約10-2Hz）為固態(tài)性質(zhì)。結(jié)合圖1 中流動(dòng)因子的變化趨勢(shì)可知，在發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵乳樣品的FI 變化可以分為3 個(gè)階段。PMF 組在發(fā)酵前期（0～13 h），F(xiàn)I 值處于波動(dòng)狀態(tài)，樣品處于相對(duì)穩(wěn)定的高流動(dòng)性狀態(tài)；隨后出現(xiàn)拐點(diǎn)，流動(dòng)性快速下降，發(fā)酵乳初步形成較為穩(wěn)定的凝膠結(jié)構(gòu)，進(jìn)入低流動(dòng)性階段。而FM 組與PMF 組流動(dòng)因子的變化趨勢(shì)相同，且FM 組從相對(duì)穩(wěn)定的高流動(dòng)性狀態(tài)變?yōu)榈土鲃?dòng)狀態(tài)所需時(shí)間為5.5 h。

綜上所述，在發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)，PFM 組的MVI 值大于FM 組，表現(xiàn)出高黏性因子的特征，有利于益生菌發(fā)酵乳形成穩(wěn)定的凝膠結(jié)構(gòu)；PFM 組的SLB值大于FM 組，表現(xiàn)出高固液平衡值的特征，說(shuō)明添加益生菌后的發(fā)酵乳黏彈性更大，有利于產(chǎn)品的穩(wěn)定；PFM 組的EI 值小于PFM 組，表現(xiàn)出低彈性因子的特征，說(shuō)明益生菌發(fā)酵乳的彈性較低；PFM 組的FI 值小于FM 組，表現(xiàn)出低流動(dòng)狀態(tài)的特征，說(shuō)明益生菌發(fā)酵乳具有更高的黏性液體特征。

2.2 發(fā)酵結(jié)束時(shí)游離氨基酸的含量

在PFM 組和發(fā)酵初始（0 h）共檢測(cè)出14 種游離氨基酸，分別是蘇氨酸（THR）、異亮氨酸（ILE）、亮氨酸（LEU）、賴氨酸（LYS）、苯丙氨酸（PHE）、纈氨酸（VAL）、天門冬氨酸（ASP）、絲氨酸（SER）、丙氨酸（ALA）、脯氨酸（PRO）、谷氨酸（GLU）、甘氨酸（GLY）、酪氨酸（TYR）和精氨酸（ARG）。對(duì)其進(jìn)行總體分析，生成了游離氨基酸聚類熱圖（圖2）。PFM 組相比于原奶，其THR、ILE、LEU、LYS、PHE、VAL、ASP、SER、ALA、PRO 和ARG 的含量均顯著升高；而GLU、GLY 和TYR 的含量均下降。

圖2 聚類分析樣品中游離氨基酸代謝物差異Fig.2 Cluster analysis of free amino acid metabolites in samples

如圖3 所示，利用PLS-DA 對(duì)其差異代謝物進(jìn)行區(qū)分。R2Y 和Q2 分別為擬合優(yōu)度和預(yù)測(cè)能力參數(shù)，驗(yàn)證PLS-DA 模型的準(zhǔn)確性和可預(yù)測(cè)性。R2Y 定義為模型解釋的數(shù)據(jù)中方差的比例，表示擬合的優(yōu)度；Q2 定義為模型可預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)中的方差比例，表示預(yù)測(cè)能力。R2Y 和Q2 大于或等于0.5的模型被認(rèn)為適合于識(shí)別分析。該模型中R2Y 和Q2 值分別為0.997 和0.994，表明該模型具有較好的準(zhǔn)確性和可預(yù)測(cè)性。結(jié)果顯示，共有9 種游離氨基酸同時(shí)滿足P 值＜0.05 和VIP 值＞1。PFM 組游離氨基酸含量顯著升高的有PHE 為0.93 mg/kg，VAL 為3.3 mg/kg，ALA 為22.6 mg/kg，LYS 為12.6 mg/kg，THR 為3.8 mg/kg，SER 為3.5 mg/kg，PRO為35.4 mg/kg，LEU 為5.4 mg/kg；游離氨基酸含量顯著下降的有TYR，F(xiàn)M 組含量為0.6 mg/kg，PFM組含量為0.06 mg/kg。

圖3 VIP 游離氨基酸的PLS-DA 圖Fig.3 The PLS-DA diagram of VIP free amino acids

氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，其種類和數(shù)量是考察食品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)之一。氨基酸類型與含量是影響發(fā)酵乳風(fēng)味的因素之一[22]，進(jìn)而影響人體健康，其主要來(lái)源于發(fā)酵乳發(fā)酵過(guò)程中蛋白質(zhì)分解[23]、三羧酸循環(huán)（TCA 循環(huán)）[24]以及糖酵解途徑（EMP 途徑）[25]。根據(jù)圖4 可知，蛋白質(zhì)分解為多肽，在肽酶的作用下分解為L(zhǎng)EU、VAL和PHE。LEU、VAL 屬于支鏈氨基酸，LEU 能更快的分解，轉(zhuǎn)化為葡萄糖，防止肌肉損傷[26]，而VAL作為肌肉代謝和協(xié)調(diào)所必需，在保持身體氮平衡上具有重要的作用[27]；PHE 屬于芳香族氨基酸，對(duì)發(fā)酵乳滋味具有重要的作用，使得發(fā)酵乳的香味更加濃郁[28]。PRO 通過(guò)TCA 循環(huán)，由α-酮戊二酸催化還原形成；LYS 和THR 通過(guò)TCA 循環(huán)，以草酰乙酸為碳架合成。PRO 產(chǎn)生的代謝物具有花香，與發(fā)酵乳風(fēng)味密切相關(guān)[29]；LYS 作為人體的必需氨基酸之一，起到調(diào)節(jié)人體代謝平衡，增進(jìn)食欲，促進(jìn)幼兒發(fā)育等作用[30]；THR 能夠促進(jìn)血紅蛋白合成，增進(jìn)食欲，促進(jìn)生長(zhǎng)[31]。ALA 通過(guò)糖酵解途徑，由丙酮酸衍生而來(lái)，可為機(jī)體提供碳骨架、氮，以及能量等[32]；而SER 在糖酵解途徑中，以3-磷酸甘油酸為碳架合成，作為一種功能性氨基酸，在調(diào)控機(jī)體免疫功能、微生態(tài)平衡等方面發(fā)揮重要作用[33]。

圖4 差異氨基酸代謝途徑Fig.4 The metabolism pathway of amino acids

2.3 發(fā)酵乳貯藏過(guò)程的活菌數(shù)變化

乳酸菌活菌數(shù)可直接影響發(fā)酵乳的品質(zhì)、特性及口感[34]。如圖5 所示，PFM 組乳酸桿菌和雙歧桿菌活菌數(shù)均有所下降，28 d 結(jié)束時(shí)乳酸桿菌活菌數(shù)達(dá)2.4×108CFU/mL（P＜0.05）、雙歧桿菌活菌數(shù)達(dá)3.9×107CFU/mL（P＜0.01）。總體分析，PFM 組活菌數(shù)下降可能是由于發(fā)酵乳酸度升高抑制乳酸菌生長(zhǎng)，使乳酸菌總數(shù)減少。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 19302-2010 規(guī)定[35]，發(fā)酵乳中乳酸菌活菌數(shù)應(yīng)在106CFU/mL 以上，而本試驗(yàn)菌株在貯藏期間活菌數(shù)均維持在108CFU/mL 以上。

圖5 貯藏過(guò)程的活菌數(shù)變化Fig.5 Changes of viable cell counts during storage

2.4 發(fā)酵乳貯藏過(guò)程的酸度變化

發(fā)酵乳酸度的變化由圖6 可知，在貯藏前期（1～7 d），PFM 組和FM 組pH 值均明顯下降，滴定酸度的變化趨勢(shì)與之相反。這是由于在貯藏初期，菌種生長(zhǎng)代謝能力旺盛，在α-半乳糖苷酶作用下，繼續(xù)分解剩余碳水化合物產(chǎn)酸，導(dǎo)致酸度增加幅度較大[36]，隨貯藏期的延長(zhǎng)，菌種代謝受到抑制，pH 值和TA 值變化趨勢(shì)逐漸平緩[37]。PMF 組pH 值在7 d 內(nèi)由貯藏1 d 的4.46 下降到4.15，隨后保持在4.0 左右，28 d 達(dá)3.97；FM 組pH 值在7 d 內(nèi)由貯藏1 d 的4.28 下降到4.04，隨后保持在4.0 左右，28 d 達(dá)3.96。各組發(fā)酵乳滴定酸度在貯藏期間均呈上升趨勢(shì)，在貯藏1～7 d，PMF 組滴定酸度由84°T 上升到110°T，ΔpH=26°T；FM 組由91°T 上升到100°T，ΔTA=9°T；貯藏后期二者趨于平穩(wěn)，最終都保持在108°T 左右，組間無(wú)顯著差異。

圖6 貯藏過(guò)程的酸度變化Fig.6 Changes of acidity during storage

2.5 發(fā)酵乳貯藏過(guò)程的黏度和持水力變化

黏度的產(chǎn)生是由于發(fā)酵乳中菌體持續(xù)產(chǎn)酸使pH 值下降到酪蛋白凝固點(diǎn)，同時(shí)菌體不斷分泌黏多糖，最終使發(fā)酵乳呈現(xiàn)均一黏稠狀態(tài)[38]。如圖7所示，在28 d 貯藏期間內(nèi)黏度變化趨勢(shì)為PFM 組先增大后減小，14 d 時(shí)達(dá)到最大值726 mPa·s，這可能與所選益生菌完成發(fā)酵后依舊保持較高活性，胞外多糖繼續(xù)積累所致[39]。隨著貯藏期繼續(xù)延長(zhǎng)，PFM 組黏度開(kāi)始下降，可能是由于貯藏過(guò)程中，菌體持續(xù)產(chǎn)酸，導(dǎo)致發(fā)酵乳中乳酸含量增加到一定濃度時(shí)，使菌體代謝受到抑制，乳酸生成速度下降，限制黏度繼續(xù)上升[40]；而FM 組則呈持續(xù)下降趨勢(shì)，由1 d 的1 002 mPa·s，下降到260 mPa·s。

圖7 貯藏過(guò)程的黏度和持水力變化Fig.7 Changes of viscosity and water holding capacity during storage

持水力是評(píng)價(jià)發(fā)酵乳產(chǎn)品品質(zhì)的重要指標(biāo)，持水能力的強(qiáng)弱，乳清析出的多少以及發(fā)酵乳的組織狀態(tài)都影響產(chǎn)品感官及風(fēng)味保留[41]。如圖7所示，在28 d 的貯藏期內(nèi)，PFM 組和FM 組持水力均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。這可能是因?yàn)樵诎l(fā)酵乳貯藏期間菌種不斷代謝需要水的參與[42]，也可能與發(fā)酵乳貯藏過(guò)程中，較低的pH 值破壞了凝膠體的結(jié)構(gòu)有關(guān)。在貯藏期間1～14 d 內(nèi)兩組持水力下降幅度最快，PFM 組由1 d 的63.85%下降至58.8%，F(xiàn)M 組由1 d 的67.45%下降至58.85%，隨后二者有所回升。在貯藏28 d 后，PFM 組持水力下降至59.6%，F(xiàn)M 組下降至57.42%?？傮w分析，PFM 組在貯藏期間內(nèi)持水力普遍高于FM 組，組間無(wú)顯著差異。

2.6 發(fā)酵乳貯藏過(guò)程的感官品質(zhì)變化

分別將PFM 組和FM 組樣品在1，7，14，21，28 d 時(shí)進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，評(píng)分結(jié)果如圖8 所示：兩組在貯藏期間其感官評(píng)價(jià)得分均有顯著下降（P＜0.01）。貯藏開(kāi)始時(shí)，PFM 組相比于FM 組得分較高（P＜0.05），狀態(tài)光滑細(xì)膩，香氣濃郁，具有醇香的酸奶味；在10 ℃，1～7 d 貯藏期間，兩組樣品得分呈上升趨勢(shì)，這可能是由于在此期間樣品黏度較高，持水力較好，有利于發(fā)酵乳樣品風(fēng)味保留。在7～28 d 兩組樣品感官評(píng)分整體出現(xiàn)下降趨勢(shì)，貯藏結(jié)束時(shí)PFM 組得分87.0 分，F(xiàn)M 組得分84.1分。整體上，PFM 組在10 ℃，28 d 的貯藏期間內(nèi)滋味、氣味、質(zhì)地、色澤以及口感均優(yōu)于FM 組。

圖8 貯藏期間感官評(píng)分結(jié)果Fig.8 Sensory score results during storage

3 結(jié)論

益生菌乳雙歧桿菌V9（Bifidobacterium animalis subsp.V9）、副干酪乳桿菌（Lacticaseibacillus paracaseiPC-01）和植物乳桿菌P-8（Lactiplantibacillus plantarumP-8）復(fù)合發(fā)酵牛乳具有較好的流變學(xué)特性，利于發(fā)酵乳形成緊密的凝膠網(wǎng)絡(luò)。發(fā)酵乳中游離PHE、VAL、ALA、LYS、THR、SER、PRO 和LEU 含量顯著升高，各檢測(cè)指標(biāo)在10 ℃期間均有較好的穩(wěn)定性，全貯藏期內(nèi)活菌數(shù)高于108CFU/mL，具有組織狀態(tài)細(xì)膩和感官得分高的特點(diǎn)。因此，所述研究可為益生菌發(fā)酵乳產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供思路，對(duì)益生菌在功能性乳制品中的應(yīng)用具有重要意義。