劉歡歡，吳采棟，李琪琪，吳興杰，陳 英，沈祥春，魏茂陳, 2*，陶 玲*

2種自乳化遞送系統(tǒng)的制備及其對(duì)斑馬魚(yú)炎癥損傷部位“引藥”作用

劉歡歡1，吳采棟1，李琪琪1，吳興杰1，陳 英1，沈祥春1，魏茂陳1, 2*，陶 玲1*

1. 貴州省特色天然藥物高效利用工程中心，貴州省高等學(xué)校天然藥物藥理與成藥性評(píng)價(jià)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州醫(yī)科大學(xué)天然藥物資源優(yōu)效利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025 2. 貴陽(yáng)新天藥業(yè)股份有限公司貴州，貴州 貴陽(yáng) 550025

以橄欖油和芝麻油分別作為油相進(jìn)行自乳化遞送系統(tǒng)（self-emulsifying drug delivery system，SEDDS）載體構(gòu)建，考察2種SEDDS載體的藥劑學(xué)性能及對(duì)斑馬魚(yú)體內(nèi)炎癥損傷部位遞送差異。初步闡明輔料的“引藥”效應(yīng)，擬為炎癥損傷部位有效遞送材料的選擇和輔料“引藥達(dá)所”提供實(shí)驗(yàn)參考。結(jié)合相轉(zhuǎn)變法和偽三元相圖法篩選乳化劑、助乳化劑、乳化劑與助乳化劑質(zhì)量比（m），星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法（central composite design-response surface methodology，CCD-RSM）優(yōu)化2種SEDDS載體處方；通過(guò)布魯克海文納米粒徑儀測(cè)定2種SEDDS載體的中位徑（50）和ζ電位；利用立體熒光顯微鏡觀(guān)察2種SEDDS載體在斑馬魚(yú)體內(nèi)炎癥損傷部位的遞送差異。2種SEDDS最佳乳化劑和助乳化劑均為聚山梨酯80-無(wú)水乙醇（2∶1），最佳處方油相與m值均為1∶1，滴加適量純水后呈半透明略帶藍(lán)色乳光液體；橄欖油和芝麻油SEDDS最佳處方50分別為（219.36±14.86）、（225.06±13.66）nm，ζ電位分別為（?3.13±0.55）、（3.58±0.10）mV。與正常組比較，2種SEDDS在炎癥損傷斑馬魚(yú)體內(nèi)的總熒光強(qiáng)度具有極顯著性差異（＜0.001），相比于橄欖油SEDDS，芝麻油SEDDS在炎癥損傷部位富集效果更為突出，二者主要分布在心臟和肝臟部位。2種SEDDS載體制備方法簡(jiǎn)單，外觀(guān)良好。闡明油相因素帶來(lái)的遞送差異，可以為不同炎癥損傷部位的有效遞送材料選擇、為輔料發(fā)揮“引藥”作用提供實(shí)驗(yàn)參考。

引藥；炎癥損傷；斑馬魚(yú)；自乳化遞送系統(tǒng)；遞送效應(yīng)；橄欖油；芝麻油；油相；藥劑學(xué)性能；相轉(zhuǎn)變法；偽三元相圖法；星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法

引藥，亦稱(chēng)引經(jīng)藥、藥引、或引經(jīng)報(bào)使，是在中醫(yī)方劑的君、臣、佐、使配伍原則和中藥藥物歸經(jīng)理論基礎(chǔ)上產(chǎn)生和發(fā)展起來(lái)的，主要是指處方中佐使藥可以發(fā)揮“向?qū)А钡淖饔肹1]，改變其他藥物的作用方向和部位，引導(dǎo)諸藥直達(dá)病所，更好地發(fā)揮藥物的治療效應(yīng)[2]，是傳統(tǒng)中藥獨(dú)特的用藥理念，也是“藥輔合一”的重要表現(xiàn)形式之一[3]，如牛膝引藥下行、冰片引藥上行[4]。傳統(tǒng)中藥藥劑學(xué)“藥輔合一”理論認(rèn)為，部分輔料具有藥理活性，可以發(fā)揮一定的治療作用，如蜂蜜在蜜丸中具有黏合、矯味的作用，而在補(bǔ)中益氣丸、二母寧嗽丸、麻仁丸、活血跌打丸中分別發(fā)揮補(bǔ)氣、止咳、通便、止痛的作用。但是輔料的“引藥”作用在傳統(tǒng)中藥藥劑學(xué)理論中的探討尚不多見(jiàn)。

靶向藥物遞送系統(tǒng)（target drug delivery system，TDDS）指的是采用適宜的輔料——“載體”材料，在恰當(dāng)?shù)臅r(shí)機(jī)將適量的藥物更多的引導(dǎo)至病灶部位，從而增加藥物的利用效率，提高療效，降低成本，減少毒副反應(yīng)，與“引藥”的含義不謀而合。近年來(lái)，隨著載體材料性能對(duì)遞送效應(yīng)和藥效協(xié)助作用的影響開(kāi)始受到重視[5-7]，采用現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)技術(shù)挖掘輔料作為“藥輔合一”中“引藥”的深層次內(nèi)涵，對(duì)于促進(jìn)中藥傳統(tǒng)理論現(xiàn)代化發(fā)展具有一定意義。

自乳化遞送系統(tǒng)（self-emulsifying drug delivery system，SEDDS），指含有藥物、表面活性劑和油相的各向同性混合物，可以在臨用前加水或接觸體液后自動(dòng)形成透明或半透明的均相分散體系，中位徑（50）為10～500 nm，還可作為軟膠囊等基礎(chǔ)劑型而倍受關(guān)注[8]。橄欖油（olive oil，OO）來(lái)源于天然、富含不飽和脂肪酸以及大量脂質(zhì)伴隨物，具有抗炎[9]、降血壓[10]、抗癌等功效[11]，是人類(lèi)目前發(fā)現(xiàn)油脂中最適合人體營(yíng)養(yǎng)的油之一，并成為了目前臨床應(yīng)用的脂肪乳劑首選油相之一。芝麻油（sesame oil，SO）是中藥藥劑學(xué)傳統(tǒng)常用的主要油相之一，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，不飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到84%以上，具有抗炎[12]、抗氧化[13]、降血脂[14]等作用，并受到現(xiàn)代乳劑遞送研究的關(guān)注。課題組前期成功制備了多個(gè)以揮發(fā)油為主體的“藥輔合一”SEDDS[15-17]，本研究在前期基礎(chǔ)上，選用橄欖油、芝麻油作為油相，分別進(jìn)行橄欖油自乳化遞送系統(tǒng)（OO@ SEDDS）和芝麻油自乳化遞送系統(tǒng)（SO@SEDDS）2種不含藥空白載體最佳處方的構(gòu)建，考察2種油相因素對(duì)SEDDS在炎性損傷斑馬魚(yú)幼魚(yú)（zebrafish）不同器官的分布差異，擬為后期炎癥損傷的SEDDS油相載體材料提供選擇，為中藥藥劑學(xué)中輔料的“引藥”作用現(xiàn)代延伸提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

KQ3200型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；ME104/02型分析電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UPW型實(shí)驗(yàn)室專(zhuān)用純水儀，成都天莘寧科技有限公司；NanoBrook 90 Plus PALS型納米電位粒度分析儀，美國(guó)布魯克海文有限公司；PLI-100型顯微注射儀，Harvard Apparatus公司；循環(huán)水系統(tǒng)斑馬魚(yú)養(yǎng)殖系統(tǒng)，北京愛(ài)生科技有限公司；SMZ25型體視熒光顯微鏡，日本尼康有限公司。

1.2 試劑

精制橄欖油，批號(hào)210701-2-01，遼寧新興藥業(yè)股份有限公司；芝麻油，批號(hào)MX20210803，浙江田雨山藥用油有限公司；聚山梨酯80（Tween 80，T80），批號(hào)No.1215E013，索萊寶試劑有限公司；聚乙二醇400（PEG 400），批號(hào)20200725，西隴科學(xué)股份有限公司；聚乙二醇-15-羥基硬脂酸酯（HS15），批號(hào)54844856P0，上海協(xié)泰化工有限公司；甘油，批號(hào)20191213，浙江遂昌惠康藥業(yè)有限公司；泊洛沙姆188（F68），批號(hào)WBAK539B，德國(guó)巴斯夫公司；香豆素6，批號(hào)5RP6IML，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，梯希愛(ài)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；無(wú)水乙醇，批號(hào)20200918，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三卡因，批號(hào)J2114551，阿拉丁試劑有限公司；羧甲基纖維素，批號(hào)SLCD2238，美國(guó)Sigma-Aldrich貿(mào)易有限公司；苯基硫脲，德國(guó)默克有限公司；亞甲基藍(lán)，美國(guó)Sigma-Aldrich貿(mào)易有限公司；其他的試劑和化學(xué)品均為分析純。

1.3 動(dòng)物

模式生物野生型斑馬魚(yú)（Wild Type，WT）Tübingen品系，該品系由貴州醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞工程生物醫(yī)藥技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室提供，批件號(hào)為倫審2100182，合格證號(hào)SYXK（黔）2018-0001。

2 方法與結(jié)果

2.1 偽三元相圖的繪制

固定體系質(zhì)量為1 g，乳化劑與助乳化劑質(zhì)量比（m）為2∶1，混勻形成混合乳化劑，取適量的油相與混合乳化劑分別以1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1的質(zhì)量比混合，采用水滴定法進(jìn)行制備，并觀(guān)察乳液的透明度，肉眼觀(guān)察乳液形成透明且易于流動(dòng)分散的低黏度O/W乳液為宜。通過(guò)相轉(zhuǎn)變法繪制偽三元相圖，每一相代表三角形的一邊，相圖中的每一個(gè)角代表該特定組分的100%，最大比值涵蓋在研究范圍內(nèi)，從而精確描繪相圖中形成的相的邊界。用Orgin 9.0軟件繪制偽三元相圖，以乳化區(qū)域面積大小為考察指標(biāo)，進(jìn)行OO@SEDDS、SO@SEDDS最佳處方考察，所有處方重復(fù)3次。

2.2 乳化劑種類(lèi)的考察

固定助乳化劑為無(wú)水乙醇，m值為2∶1，進(jìn)行T80、F68、HS15 3種乳化劑考察。固定體系質(zhì)量為1 g，將油相與m值分別按照1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1的比例稱(chēng)量后，置于EP管中，渦旋混勻，逐滴加入純水，觀(guān)察乳化現(xiàn)象，記錄各相質(zhì)量，進(jìn)行偽三元相圖的繪制。結(jié)果表明，2種自乳化載體成乳區(qū)域面積由大到小依次為T(mén)80＞HS15＞F68，故選擇T80作為乳化劑，結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.3 助乳化劑考察

根據(jù)乳化劑種類(lèi)考察的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，固定乳化劑為T(mén)80，m值為2∶1，進(jìn)行PEG 400、甘油、無(wú)水乙醇3種助乳化劑考察。油相與m分別按1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1比例混合，渦旋混勻，逐滴加入純水，觀(guān)察乳化現(xiàn)象，記錄各相質(zhì)量，進(jìn)行偽三元相圖的繪制。結(jié)果顯示，3種不同助乳化劑成乳區(qū)域面積由大到小依次為無(wú)水乙醇＞甘油＞PEG 400，故選擇無(wú)水乙醇作為助乳化劑，結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.4 不同Km值考察

在上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，以T80為乳化劑，無(wú)水乙醇為助乳化劑，固定總質(zhì)量為1 g，設(shè)置油相與m的比例分別為1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1，m值分別為1∶2、1∶1、2∶1、3∶1，考察不同m值的偽三元相圖乳化面積變化。由偽三元相圖可知，2種SEDDS在不同m值下乳化面積由大到小依次為2∶1＞3∶1＞1∶2＞1∶1。因此選擇m值為2∶1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖3。

2.5 油相與Km比例的選擇

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，2種油相與m值比例在4∶6和5∶5時(shí)乳化效果較好，室溫下靜置不易分層，且考慮到乳化劑用量越少安全性越高，因此確定油相與m值比例為5∶5（圖4）。

2.6 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法（central composite design- response surface methodology，CCD-RSM）優(yōu)化SEDDS處方

為了更好的評(píng)價(jià)OO@SEDDS、SO@SEDDS的處方，在偽三元相圖篩選基礎(chǔ)上，選擇對(duì)SEDDS性質(zhì)影響較顯著的油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)（1）和m值（2）作為考察因素，以中位徑（）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采取CCD-RSM優(yōu)化法[18]，對(duì)處方進(jìn)行優(yōu)化。經(jīng)前期實(shí)驗(yàn)考察得知，油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)在20%～80%，m為2∶1時(shí)有利于自乳化體系的形成和穩(wěn)定，成乳效果較好，故將油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)的范圍設(shè)置為20%～80%，m的范圍設(shè)為1∶1～3∶1。使用Design Expert軟件對(duì)各成分進(jìn)行多元線(xiàn)性回歸和二項(xiàng)式的擬合，并遵循擬合方程繪制表達(dá)各指標(biāo)與各成分之間關(guān)系的三維效應(yīng)面圖，根據(jù)曲線(xiàn)圖進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。設(shè)計(jì)2因素與5水平CCD-RSM實(shí)驗(yàn)，OO@SEDDS、SO@ SEDDS的CCD-RSM實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表1、2。分別得到2種SEDDS的擬合方程如下：OO@ SEDDS50＝217.60＋213.431＋42.582＋113.1312＋217.6812＋66.1722，2＝0.948 0，＝0.000 2；SO@SEDDS50＝217.32＋134.971－28.562＋23.1212＋97.8712＋8.8122，2＝0.922 6，＝0.000 9。

圖1 不同乳化劑偽三元相圖

圖2 不同助乳化劑偽三元相圖

圖3 不同Km值偽三元相圖

圖4 不同油相與Km值比例圖片

由上述方程可知，2種SEDDS的50均符合多元線(xiàn)性方程，非線(xiàn)性擬合效果良好，相關(guān)系數(shù)均較高，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.7 CCD-RSM分析

在2種SEDDS中，油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)50的影響較大，均呈正比關(guān)系；在OO@SEDDS中，m與50呈正比關(guān)系，而在SO@SEDDS中，m與50呈反比關(guān)系。通過(guò)軟件預(yù)測(cè)、擬合方程及三維效應(yīng)面圖綜合分析，以50為考察指標(biāo)，得到理論最佳處方為油相50.0%，m＝2∶1，即油50%、T80 33.3%、無(wú)水乙醇16.7%，結(jié)果見(jiàn)圖5。

表1 OO@SEDDS的CCD-RSM實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果(, n = 3)

表2 SO@SEDDS的CCD-RSM實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果(, n = 3)

2.8 處方驗(yàn)證

按照最優(yōu)處方，分別精密稱(chēng)取橄欖油或芝麻油500.0 mg，T80 333.3 mg，無(wú)水乙醇166.7 mg，同法平行制備3批SEDDS?；靹蚝笾鸬渭尤爰兯?0 mL，得半透明略帶藍(lán)色乳光的OO@SEDDS、SO@ SEDDS。預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的偏差結(jié)果表明，最優(yōu)處方50的真實(shí)值與預(yù)測(cè)值之間沒(méi)有顯著差異，且指標(biāo)的相對(duì)誤差［相對(duì)誤差＝(預(yù)測(cè)值－實(shí)測(cè)值)/預(yù)測(cè)值］均較小。結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)所應(yīng)用的CCD-RSM擬合方程預(yù)測(cè)效果良好。結(jié)果見(jiàn)表3。

圖5 D50的三維效應(yīng)面圖

表3 Design-Expert 8.0.6預(yù)測(cè)D50實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值(, n = 3)

2.9 最佳處方的確定

綜上所述，OO@SEDDS和SO@SEDDS分別得到的最佳處方：乳化劑均為T(mén)80（33.3%），助乳化劑為無(wú)水乙醇（16.7%），m＝2∶1，油相與m值比例為1∶1。

2.10 外觀(guān)形態(tài)

將制備得到的OO@SEDDS、SO@SEDDS用蒸餾水適量稀釋后，觀(guān)察外觀(guān)及流動(dòng)性。制備所得的OO@SEDDS和SO@SEDDS稀釋后呈半透明狀，帶有淡藍(lán)色乳光，流動(dòng)性良好，具有丁達(dá)爾效應(yīng)，如圖6所示。

2.11 D50和ζ電位

分別將OO@SEDDS、SO@SEDDS用蒸餾水適量稀釋后，測(cè)定50和ζ電位。50和ζ電位的測(cè)定結(jié)果表明，OO@SEDDS的50為（219.36±14.86）nm，ζ電位為（?3.13±0.55）mV；SO@SEDDS的50為（225.06±13.66）nm，ζ電位為（3.58±0.1）mV。結(jié)果如圖7所示。

圖6 2種自乳化載體外觀(guān)(A)、丁達(dá)爾效應(yīng)(B)和TEM結(jié)果(C)

圖7 2種自乳化載體的D50(A)與ζ電位(B)

2.12 穩(wěn)定性考察

使用DLS分析儀分別測(cè)定2種SEDDS與pH值為7.4的PBS和含有10%胎牛血清的溶液孵育0、2、4、6、8、12、24 h后，監(jiān)測(cè)2種SEDDS的粒徑大小和ζ電位變化。結(jié)果證明2種SEDDS在pH值為7.4的PBS和10%胎牛血清的溶液中24 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性，表明它們適用于靜脈注射。結(jié)果如表4、5所示。

表4 2種自乳化遞送系統(tǒng)的PBS穩(wěn)定性(, n = 3)

表5 2種自乳化遞送系統(tǒng)的10%血清穩(wěn)定性(, n = 3)

2.13 斑馬魚(yú)飼養(yǎng)及繁育

魚(yú)房飼養(yǎng)系統(tǒng)為北京愛(ài)生斑馬魚(yú)養(yǎng)殖系統(tǒng)，養(yǎng)殖水溫為26～29℃，pH值為7.0～7.5，電導(dǎo)率為500～550 μS/cm，光周期為12 L∶12 D（12 h光照，12 h黑暗）。斑馬魚(yú)通常1 d喂養(yǎng)2次，配種時(shí)需提前將雌魚(yú)與雄魚(yú)的比例設(shè)為1∶1或2∶1，用擋板隔開(kāi)，待第2天早上光照后，拔去擋板。收集魚(yú)卵并轉(zhuǎn)入胚胎水中，培養(yǎng)6 h后，用含PTU的胚胎水進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)3～5 d后，選擇狀態(tài)良好、大小基本相近的斑馬魚(yú)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.14 2種自乳化載體毒性范圍考察

為了選擇合適的給藥質(zhì)量濃度，首先檢測(cè)了2種自乳化遞送系統(tǒng)對(duì)斑馬魚(yú)的毒性。將受精后35 d的野生型斑馬魚(yú)，利用顯微注射儀分別以尾靜脈注射給予2.0、1.0、0.5 mg/mL的OO@SEDDS、SO@SEDDS，注射劑量為3 nL。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，給予相應(yīng)體積的PBS，每個(gè)組各使用30只斑馬魚(yú)幼體。將注射后的魚(yú)單獨(dú)放入培養(yǎng)孔板中，每條魚(yú)加入2 mL胚胎水?？疾煸?8 ℃下24 h內(nèi)的存活狀態(tài)，計(jì)算死亡數(shù)，考慮致死和亞致死表型，例如水腫、畸形和血流微弱。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，在0.5、1.0 mg/mL孵育24 h后，斑馬魚(yú)心率穩(wěn)定，血流正常，表明2種SEDDS對(duì)斑馬魚(yú)沒(méi)有明顯的毒性[19]，而在2.0 mg/mL下，OO@SEDDS、SO@SEDDS組死亡率分別為76.67%和86.67%，與對(duì)照組比較具有顯著性差異（＜0.05），并伴有部分心臟增大、畸形和弱血流量。表明這2種SEDDS在低于1.0 mg/mL質(zhì)量濃度下對(duì)斑馬魚(yú)并未造成明顯損傷，較為安全，結(jié)果見(jiàn)表6。

2.15 炎癥模型的制備

卵黃囊注射脂多糖（lipopolysaccharide，LPS，0.5 mg/mL）2 nL，造模12 h，利用三卡因進(jìn)行麻醉后，在立體熒光顯微鏡觀(guān)察結(jié)果顯示，斑馬魚(yú)幼魚(yú)出現(xiàn)椎體彎曲、心臟出血、心包腫大、卵黃皺縮，說(shuō)明LPS所致炎性斑馬魚(yú)幼體模型構(gòu)建成功，如圖8所示。

表6 2種SEDDS對(duì)斑馬魚(yú)毒性(, n = 30)

與對(duì)照組比較：P＜0.05

*< 0.05control group

圖8 LPS炎癥組和對(duì)照組斑馬魚(yú)幼體模型的表型比較

2.16 斑馬魚(yú)的體內(nèi)生物分布

將含熒光染料香豆素6的OO@SEDDS和SO@ SEDDS分別通過(guò)尾靜脈注射到正常和LPS致炎癥斑馬魚(yú)體內(nèi)。每組10只。給藥后，將幼魚(yú)在經(jīng)三卡因麻醉后，放置在瓊脂糖支架，使用立體熒光顯微鏡在0.5、1.0、3.0、6.0、12.0、24.0 h時(shí)進(jìn)行成像采集。結(jié)果顯示，2種SEDDS在靜脈注射后都能隨血液分布在斑馬魚(yú)全身組織器官中，主要積聚在腦、心臟、肝臟和卵黃囊區(qū)域。此外，對(duì)應(yīng)的統(tǒng)計(jì)圖顯示，2種SEDDS均能對(duì)LPS引起的炎癥損傷部位進(jìn)行有效富集；與正常組比較，SO@SEDDS組有極顯著性差異（＜0.001），OO@SEDDS組只有在給藥1 h時(shí)，LPS組熒光強(qiáng)度增強(qiáng)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05），在給藥3 h后，LPS組熒光強(qiáng)度明顯減小，與正常組基本一致，可能與2種油相中含的化合物種類(lèi)不同有關(guān)[20]。SO@SEDDS組在正常對(duì)照組體內(nèi)分布顯著少于OO@SEDDS組。結(jié)果見(jiàn)圖9和表7。

3 討論

新山地明（環(huán)孢素A）自微乳軟膠囊（ciclosporin soft capsules）的成功上市是SEDDS發(fā)展中的標(biāo)志性事件[8]，同時(shí)，SEDDS也受到中藥藥劑學(xué)工作者們的重視。其中，油相作為SEDDS中常用的賦形劑，具有輔助乳劑形成、裝載親脂藥物、來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉、易得等優(yōu)點(diǎn)[21]，部分油相還是人體必須補(bǔ)充的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，生理活性顯著，但是不同油相由于理化性質(zhì)不同，其組織和器官遞送效應(yīng)——“引藥”作用的“藥輔合一”相關(guān)性尚未得到充分的研究。

炎癥是免疫系統(tǒng)對(duì)感染和損傷做出的反應(yīng)[21]，如果沒(méi)有及時(shí)得到解決，將會(huì)演變成慢性疾病，對(duì)機(jī)體組織器官功能造成損害，并已成為遞送系統(tǒng)研究關(guān)注的焦點(diǎn)[22]。斑馬魚(yú)作為脊椎動(dòng)物，在分子水平上85%與人相同[23]，同時(shí)斑馬魚(yú)胚胎幼魚(yú)具有身體透明的特點(diǎn)，可以使用非侵入性方法直接觀(guān)察其內(nèi)部結(jié)構(gòu)，尤其是將斑馬魚(yú)麻醉后，在顯微鏡下可以清晰地看見(jiàn)其心臟搏動(dòng)及血液循環(huán)，因此，在研究遞送系統(tǒng)分布方面具有顯著優(yōu)勢(shì)[24]。另外，斑馬魚(yú)的免疫系統(tǒng)高度保守，具有中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等與人類(lèi)相似的免疫細(xì)胞類(lèi)型和形態(tài)，被廣泛應(yīng)用于炎癥模型[25-26]。

在正常斑馬魚(yú)體內(nèi)，SO@SEDDS的器官熒光強(qiáng)度顯著低于OO@SEDDS，可能在正常情況下，SO@SEDDS的分布可能主要在血液中；炎癥損傷后2種SEDDS總熒光強(qiáng)度均增強(qiáng)，表明2種SEDDS均能對(duì)LPS引起的炎癥損傷部位進(jìn)行有效富集，可能是由于LPS刺激引起巨噬細(xì)胞的增加，易于吸收中位徑較小的自乳化液。

圖9 2種SEDDS在斑馬魚(yú)幼體中的生物分布

表7 2種SEDDS在斑馬魚(yú)幼體中的總熒光強(qiáng)度(, n = 5)

與對(duì)照組比較：*＜0.05**＜0.01***＜0.001

*< 0.05**< 0.01***< 0.001control group

此外，由于炎癥部位的細(xì)胞排列不像正常組織那樣密集，SEDDS在炎癥部位具有增強(qiáng)的滲透和滯留作用，能夠迅速分布并實(shí)現(xiàn)靶向聚集。SO@SEDDS與正常組比較所有時(shí)間點(diǎn)均有極顯著性差異（＜0.001），OO@SEDDS組只有1 h時(shí)有顯著性差異，這說(shuō)明可能SO@SEDDS更適宜用于炎癥藥物載體，2種油相化學(xué)成分的差異可能是產(chǎn)生分布差異的主要原因。同時(shí)，有文獻(xiàn)報(bào)道，-3多不飽和脂肪酸的存在更有利于炎癥的治療[27]，而芝麻油中-3多不飽和脂肪酸含量較高，可以作為后期深入考察輔料對(duì)炎癥損傷保護(hù)作用的“藥輔合一”理論提供參考。本研究還為實(shí)驗(yàn)室后期添加不同藥物進(jìn)行藥物對(duì)油相遞送的影響研究提供前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Preparation of two self-emulsifying delivery systems and its medicinal usher effect on zebrafish with inflammatory injury

LIU Huan-huan1, WU Cai-dong1, LI Qi-qi1, WU Xing-jie1, CHEN Ying1, SHEN Xiang-chun1, WEI Mao-chen1, 2, TAO Ling1

1. Guizhou Engineer Center for Efficient Utilization of Natural Drugs, Key Laboratory of Pharmacology and Druggability Evaluation of Natural Drugs in Colleges and Universities of Guizhou Province, Key Laboratory of Excellent Utilization of Natural Drug Resources of Guizhou Medical University, School of Pharmacy, Guizhou Medical University, Guiyang 550025, China 2. Guiyang Xintian Pharmaceutical Co., Ltd., Guiyang 550025, China

To construct the self-emulsifying drug delivery system (SEDDS) carriers using olive oil and sesame oil as the oil phase to investigate the pharmacologic properties and delivery differences of two SEDDS carriers to the inflammation injured sitesin zebrafish. The medicinal usher effect of excipients was preliminaries elucidated, so as to provide experimental reference for the selection of effective delivery materials for the site of inflammatory injury and the medicinal usher effect of excipients.The emulsifier, coemulsifier andmvalue were screened by phase transition method and pseudo-ternary phase diagram method. The carrier prescription of SEDDS was optimized by central composite design-response surface method. The partical size (50) and ζ potential of two SEDDS carriers were determined by Brookhaven nanosize analyzer. Three-dimensional fluorescence microscopy was used to observe its delivery difference in inflammatory injury site of zebrafish.The emulsifying effect was the best when the oil phase andmvalue of the two SEDDS were 1:1. The best emulsifier and coemulsifier was Tween 80-anhydrous ethanol (2:1), which was translucent and bluish milky liquid after adding proper amount of pure water. The optimal50of self-emulsifying carriers of olive oil and the sesame oil were (219.36 ± 14.86) nm and (225.06 ± 13.66) nm, respectively. The ζ potentials were (?3.13 ± 0.55) mV and (3.58 ± 0.10) mV, respectively. The total fluorescence intensity of the two SEDDS carriers in the inflammatory zebrafish was stronger than that in the normal group (< 0.001). Compared with the olive oil self-emulsifying, the enrichment effect of the sesame oil SEDDS was more prominent in the injured site of inflammation. They were mainly distributed in the heart and liver.The preparation methods of the two SEDDS carriers were simple and good in appearance. The difference in delivery caused by oil phase factors can provide material selection for effective delivery to different inflammatory injury sites, which provide experimental reference for excipients to play the role of medicinal usher.

medicinal usher; inflammation damages; zebrafish; self-emulsifying delivery system; delivery effect; olive oil; sesame oil; oil phase; pharmaceutical properties; phase transition method; pseudo-ternary phase diagram; central composite design-response surface method

R283.6

A

0253 - 2670(2023)16 - 5204 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.16.009

2023-03-21

貴州省科技計(jì)劃項(xiàng)目（黔科合基礎(chǔ)-ZK[2022]一般380）；貴州省科技計(jì)劃項(xiàng)目（黔科合基礎(chǔ)-ZK[2023]一般303）；貴州省高層次創(chuàng)新型人才百層次人才項(xiàng)目（貴州省科技庁黔科合人才［2015］No.4029）；貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)國(guó)際科技合作基地（黔科合平臺(tái)人才［2017］5802）

劉歡歡，女，碩士，主要從事中藥制劑工藝與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。Tel: 15585139987 E-mail: 1187689582@qq.com

陶 玲，女，教授，從事藥物新劑型和新技術(shù)、中藥民族藥新藥開(kāi)發(fā)研究。Tel: (0851)88416160 E-mail: 649511230@qq.com

魏茂陳，博士，主任藥師，從事中藥制劑工藝與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。Tel: 18685182437 E-mail: wmc@xtyyoa.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]