高洪敏，彭中燦，王利杰，潘雪格，赫 軍，張維庫(kù)，續(xù)潔琨

山茱萸中1個(gè)新的酚酸類化合物

高洪敏1, 2，彭中燦1, 3, 4，王利杰1, 3, 4，潘雪格1, 3, 4，赫 軍4，張維庫(kù)3*，續(xù)潔琨2*

1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100029 2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100029 3. 中日友好醫(yī)院 臨床醫(yī)學(xué)研究所，北京 100029 4. 中日友好醫(yī)院 藥學(xué)部，北京 100029

研究山茱萸水提取物部位的化學(xué)成分。采用多種色譜技術(shù)進(jìn)行分離純化，通過質(zhì)譜及核磁共振等方法對(duì)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，并以α-葡萄糖苷酶抑制活性為指標(biāo)對(duì)其降糖活性進(jìn)行研究。從山茱萸水提取物中分離得到了1個(gè)酚酸類化合物，鑒定為2-(2-乙氧基-2-氧乙基)-3,5-二羥基苯基4-羥基苯甲酸酯（1）；α-葡萄糖苷酶抑制活性的半數(shù)抑制濃度（median inhibition concentration，IC50）值為7.439 μmol/L?；衔?為新的酚酸類化合物，命名為山茱萸酸酯A，其具有較好的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

山茱萸；酚酸類；山茱萸酸酯A；α-葡萄糖苷酶抑制活性；降糖活性

山茱萸又稱“山萸肉”，俗名棗皮，為山茱萸科山茱萸屬植物山茱萸Sieb.的干燥成熟果實(shí)[1]，味酸澀，性微溫，主產(chǎn)于陜西、浙江、河南等省，有補(bǔ)益肝腎、澀精固脫的功效[2]。山茱萸的化學(xué)成分主要有酚酸類、萜類、黃酮類等[3-5]。藥理學(xué)研究表明山茱萸在糖尿病的防治、抗炎、心腦血管的保護(hù)、神經(jīng)保護(hù)等方面有較好的活性[3-6]。本課題組前期對(duì)山茱萸的化學(xué)成分及其生物活性進(jìn)行了持續(xù)和較為系統(tǒng)的研究[3-22]，發(fā)現(xiàn)山茱萸水提取物具有良好的抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用，結(jié)合山茱萸常被作為傳統(tǒng)中醫(yī)藥在降糖方劑中的藥材，因此研究其降血糖作用物質(zhì)基礎(chǔ)具有重要意義。

本研究首先對(duì)山茱萸的水提取物進(jìn)行分離純化，從中分離得到了1個(gè)新的酚酸類化合物，鑒定為2-(2-乙氧基-2-氧乙基)-3,5-二羥基苯基4-羥基苯甲酸酯（1），命名為山茱萸酸酯A（圖1）；進(jìn)而以α-葡萄糖苷酶抑制活性為指標(biāo)，評(píng)價(jià)了其降糖活性。

圖1 化合物1的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 儀器與材料

Bruker AV-400型核磁共振（Bruker Biospin公司）；Nicolet IS5型紅外光譜儀（Thermo Fisher公司）；Q-Exactive Orbitrap型液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Thermo Scientific公司）；Agilent 1260 Infinity II型分析液相（DAD檢測(cè)器）；島津制備液相（泵：LC-20AR，檢測(cè)器：SPD-20A）；WFH-203型三用紫外分析儀；Sartorius-BS223S型電子分析天平；柱色譜硅膠（100～200、200～300目）為青島海洋化工廠生產(chǎn)；硅膠GF254薄層預(yù)制板為煙臺(tái)化學(xué)工業(yè)研究所產(chǎn)品；ODS（30～50 μm）為YMC公司生產(chǎn)；Sephadex LH-20型凝膠為Pharmacia公司生產(chǎn)；制備型HPLC色譜柱為Phenomenex Gemini C18色譜柱（250 mm×20 mm，5 μm）；分析型HPLC色譜柱為ES Sonoma C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；酶標(biāo)儀Spark（Tecan公司）；96孔板（Coster公司）；pNPG N1377（源葉生物，批號(hào)S10137）；α-葡萄糖苷酶（Sigma公司，批號(hào)G9259）；阿卡波糖（源葉生物，批號(hào)S11190）；磷酸鹽緩沖溶液PBS（Coolaber公司）；其余試劑均為分析純（北京化工廠）和色譜純（Honeywell）。

本研究所用山茱萸為2013年11月采自陜西省佛坪縣，由北京中醫(yī)藥大學(xué)續(xù)潔琨教授鑒定為山茱萸屬植物山茱萸Sieb. 的干燥成熟果實(shí)，樣品（20131106）目前存放于中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所。

2 提取與分離

將63 kg干燥的山茱萸果實(shí)用水煎煮提取2次（600、500 L），每次2 h。合并提取液，減壓濃縮得到總浸膏約28.9 kg。總浸膏用水混懸后經(jīng)D101型大孔吸附樹脂柱，依次用水、30%、55%、95%乙醇洗脫。55%乙醇洗脫部位濃縮后得浸膏388 g，將其用硅膠1∶1拌樣，采用硅膠開放柱（200～300目，Φ7.5 cm×118 cm）用氯仿-甲醇梯度洗脫進(jìn)行分離得到8個(gè)流分CO-C1～CO-C8。

流分CO-C4（101 g）經(jīng)硅膠柱色譜，二氯甲烷-甲醇（100∶0、90∶10、80∶20、70∶30、60∶40、50∶50、40∶60、30∶70）梯度洗脫，TLC點(diǎn)板分析合并為6個(gè)流分（C4-1～C4-6），其中流分C4-2～C4-4經(jīng)點(diǎn)板合并后過ODS柱色譜（甲醇-水1∶9→10∶0）并經(jīng)TLC點(diǎn)板分析合并得到8個(gè)流分（C4-B1～C4-B8）。其中C4-B7過Sephadex LH-20凝膠柱色譜（甲醇-水1∶1→1∶0）經(jīng)TLC分析合并得到10個(gè)流分（B7-A～B7-J），B7-G經(jīng)Pre-HPLC分離得到化合物1（38.6 mg）[色譜柱Phenomenex Gemini C18（250 mm×20 mm，5 μm）；體積流量3 mL/min；流動(dòng)相55%甲醇；R＝26 min]。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：褐色粉末。HR-ESI-MS/331.082 3（[M－H]?，計(jì)算值為331.081 2），可確定化合物的分子式為C17H16O7，計(jì)算其不飽和度為10。紅外光譜顯示其結(jié)構(gòu)中含有羥基（3415 cm?1）和羰基（1713 cm?1）和苯環(huán)（1516 cm?1）等基團(tuán)。紫外光譜顯示在206 nm和264 nm處有特征吸收。

1H-NMR (400 MHz, Methanol-4) 譜（表1）顯示1個(gè)甲基質(zhì)子信號(hào)H1.10 (3H, t,= 7.2 Hz, H-10)；1組亞甲基質(zhì)子信號(hào)H4.00 (2H, q,= 7.2 Hz, H-9), 3.49 (2H, s, H-7)；1組對(duì)取代苯上質(zhì)子信號(hào)H8.00 (2H, d,= 8.8 Hz, H-2′, 6′), 6.90 (2H, d,= 8.8 Hz, H-3′, 5′)，提示該化合物存在1個(gè)對(duì)位取代的苯環(huán)結(jié)構(gòu)；1對(duì)間位偶合的苯環(huán)質(zhì)子信號(hào)H6.27 (1H, d,= 2.4 Hz, H-3), 6.17 (1H, d,= 2.4 Hz, H-5)，提示還存在1個(gè)四取代的苯環(huán)結(jié)構(gòu)。

13C-NMR (100 MHz, Methanol-4）譜（表1）顯示共17個(gè)碳信號(hào)，結(jié)合HSQC譜確定該化合物含有1個(gè)甲基碳信號(hào)C14.5 (C-10)；2個(gè)亞甲基碳信號(hào)C61.9 (C-9), 30.3 (C-7)；2組苯環(huán)上碳信號(hào)C164.4 (C-4′), 158.7 (C-4), 158.5 (C-6), 152.5 (C-2), 133.6 (C-2′, 6′), 121.5 (C-1′), 111.6 (C-3′, 5′), 107.3 (C-1), 102.3 (C-3), 101.1 (C-5)；2個(gè)羰基碳信號(hào)C174.0 (C-8), 166.2 (C-7′)?；衔?的波譜數(shù)據(jù)與已知化合物2--(4-hydroxybenzoyl)-2,4,6-trihydroxy- phenylacetate[23]的波譜數(shù)據(jù)非常相似，不同之處在于化合物1多了1個(gè)乙氧基信號(hào)[H4.00 (2H, q,= 7.2 Hz), 1.10 (3H, t,= 7.2 Hz)；C61.9, 14.5]，少了1個(gè)甲氧基信號(hào)[H3.54 (3H, s, OCH3),C52.4]。

表1 化合物1的1H-和13C-NMR數(shù)據(jù)(400/100 MHz, Methanol-d4)

Table 1 1H- and 13C-NMR data for compound 1 (400/100 MHz, Methanol-d4)

碳位δHδc 1 107.3 2 152.5 36.17 (d, J= 2.4 Hz)102.3 4 158.7 56.27 (d, J= 2.4 Hz)101.1 6 158.5 73.49 (s)30.3 8 174.0 94.00 (q, J= 7.2 Hz)61.9 101.10 (d, J= 7.2 Hz)14.5 1′ 121.5 2′8.00 (d, J= 8.8 Hz)133.6 3′6.90 (d, J= 8.8 Hz)116.6 4′ 164.4 5′6.90 (d, J= 8.8 Hz)116.6 6′8.00 (d, J= 8.8 Hz)133.6 7′ 166.2

在HMBC譜（圖2）中，H-5 (H6.27) 與C-1 (C107.3), C-3 (C102.3), C-4 (C158.7) 相關(guān)，H-3 (H6.17) 與C-1 (C107.3) 相關(guān)；同時(shí)，H-2′ (H8.00) 與C-7′ (C166.2), C-4′ (C164.4) 相關(guān)，H-5′ (H6.90) 與C-1′ (C121.5), C-4′ (C164.4) 相關(guān)，結(jié)合碳譜、氫譜進(jìn)一步確定了其結(jié)構(gòu)中存在1個(gè)間苯三酚和1個(gè)對(duì)羥基苯甲酰的結(jié)構(gòu)。另外，H-7 (H3.49) 與C-1 (C107.3), C-2 (C152.5) 和C-8 (C174.0) 相關(guān)，H-9 (H4.00) 與C-8 (C174.0), C-10 (C14.5) 相關(guān)，H-10 (H1.10) 與C-9 (C61.9) 相關(guān)，說明乙氧基與C-8位的羰基相連。綜上所述，該化合物為2-(2-乙氧基-2-氧乙基)-3,5-二羥基苯基-4-羥基苯甲酸酯，經(jīng)SciFinder文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索發(fā)現(xiàn)該化合物為未見報(bào)道的新化合物，命名為山茱萸酸酯A。

圖2 化合物1的主要HMBC

4 降糖活性測(cè)定

以4-硝基酚-β--吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl- β--glucopyranoside，PNPG）為底物測(cè)定α-葡萄糖苷酶的活性，以阿卡波糖作為陽(yáng)性對(duì)照，在96孔板上進(jìn)行活性檢測(cè)。100 μL PBS緩沖溶液（pH 7.4）中加入20 μL α-葡萄糖苷酶（0.125 U/mL）溶液，以及20 μL不同濃度的化合物1（0.31、0.62、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00 μmol/L），37 ℃恒溫15 min，然后加入20 μL PNPG（2.5 mmol/L），37 ℃恒溫15 min，再加入40 μL的Na2CO3溶液（0.2 mol/L）終止反應(yīng)，在405 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（）值[24-26]。按照公式計(jì)算α-葡萄糖苷酶抑制率。

抑制率＝[(對(duì)照－空白對(duì)照)－(樣品－樣品對(duì)照)]/(對(duì)照－空白對(duì)照)

空白對(duì)照為加入緩沖液代替樣品的空白對(duì)照0 min時(shí)的值，對(duì)照為對(duì)照15 min時(shí)的值，樣品對(duì)照為加入測(cè)試樣品0 min時(shí)的值，樣品為加入測(cè)試樣品15 min時(shí)的值

結(jié)果表明，化合物1在20 μmol/L表現(xiàn)出較好的抑制活性，半數(shù)抑制濃度（median inhibition concentration，IC50）值為7.439 μmol/L，其效果優(yōu)于陽(yáng)性藥阿卡波糖（IC50＝642.4 μmol/L）。

5 結(jié)語(yǔ)

本研究從山茱萸水提取物中分離鑒定了1個(gè)新的酚酸類化合物山茱萸酸酯A，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)其對(duì)α-葡萄糖苷酶活性（IC50＝7.439 μmol/L）明顯優(yōu)于陽(yáng)性藥阿卡波糖（IC50＝642.4 μmol/L）。本研究一方面豐富了山茱萸的化學(xué)成分多樣性，另一方面為闡明山茱萸的降糖藥效物質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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A new phenolic acid from

GAO Hong-min1, 2, PENG Zhong-can1, 3, 4, WANG Li-jie1, 3, 4, PAN Xue-ge1, 3, 4, HE Jun4, ZHANG Wei-ku3, XU Jie-kun2

1. School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China 2. School of Life Sciences, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China 3. Institute of Clinical Medical Sciences, China-Japan Friendship Hospital, Beijing 100029, China 4. Department of Pharmacy, China-Japan Friendship Hospital, Beijing 100029, China

To study on the constituents from water extract of.The water extract ofwas separated and purified by use of various chromatographic techniques, and the structures of the isolates were elucidated by mass spectrometry and nuclear magnetic resonance. The hypoglycemic activity of the compounds using α-glucosidase inhibitory activity as index was also investigated.One phenolic acid compound was isolated from the extract ofand identified as 2-(2-ethoxy-2-oxoethyl)-3,5-dihydroxyphenyl 4-hydroxybenzoate (1). The IC50value of the α-glucosidase inhibitory activity was 7.439 μmol/L.Compound 1 is a new phenolic acid, named cornusester A, with good α-glucosidase inhibitory activity.

Sieb.; phenolic acids; cornusester A; α-glucosidase inhibitory activity; hypoglycemic activity

R284.1

A

0253 - 2670(2023)16 - 5142 - 04

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.16.002

2023-05-30

中央高水平醫(yī)院臨床科研業(yè)務(wù)費(fèi)（2023-NHLHCRF-CXYW-01，2022-NHLHCRF-YNZJ-01）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（82073731，82273815，82273809）；中國(guó)藥學(xué)會(huì)以嶺生物醫(yī)藥創(chuàng)新基金（CPA-B04-ZC-2021-005）；中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)（2022- JKCS-1616）；天然藥物活性物質(zhì)與功能國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金（GTZK202101，GTZK202206）；中日友好醫(yī)院菁英計(jì)劃（ZRJY2021-BJ06，ZRJY2021-TD06）

高洪敏（1982—），女，在職碩士，從事中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

張維庫(kù)，男，博士，研究員，從事中藥活性成分的發(fā)現(xiàn)和新藥開發(fā)。Tel: (010)84205766 E-mail: cpuzwk@163.com

續(xù)潔琨，女，博士，教授，研究方向?yàn)橹兴幩幚砗托滤庨_發(fā)。Tel: (010)84205360 E-mail: xjkbucm@163.com

[責(zé)任編輯 王文倩]