程迪思

（中國人民大學附屬中學，北京 100080）

0.引言

近年來，基因編輯等基因技術(shù)在疾病治療等領(lǐng)域都有著至關(guān)重要的地位，其中CRISPR/Cas9 技術(shù)是一種近些年中被研制出來的新型基因治療方法，并且被廣泛應用在多個領(lǐng)域。CRISPR 系統(tǒng)是生物長時間進化而形成的，它具有免疫和防御外來入侵的病毒的功能。利用這一系統(tǒng)，CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)應運而生。CRISPR/Cas9 技術(shù)是一種高效的基因編輯技術(shù)，這項基因技術(shù)主要是對目標基因進行特定化學修飾。CRISPR/Cas9 技術(shù)常常被應用于基因編輯中，能構(gòu)成一種較為前沿的基因編輯體系。在臨床醫(yī)學方面，這項技術(shù)常被應用于血液病等遺傳疾病，且已經(jīng)具有一定的治療效果和較為成功的臨床案例。該技術(shù)的研究成果現(xiàn)已經(jīng)可以應用于對部分常見脊椎模式動物進行精確化學修飾。

在20 世紀90 年代初，CRISPR 最早被發(fā)現(xiàn)存在于細菌和古生菌中，利用這個CRISPR 序列，人們可以更方便地進行生物化學實驗，因此，這項技術(shù)也在許多領(lǐng)域中都很流行。2002 年，CRISPR 被正式定名， Jansen 實驗室的工作人員，通過生物信息學分析等技術(shù)發(fā)現(xiàn)了這種序列，后來，通過進行基因組的測序發(fā)現(xiàn)了大部分古生菌和一部分細菌具有這個特殊序列。2005 年，Mojica、Bolotin、Pourcel 研究小組的成員發(fā)現(xiàn)了CRISPR 基因中一些間隔序列的來源，其源于外來噬菌體的序列或是一些質(zhì)粒。Mojica 實驗室還發(fā)現(xiàn)，病毒不能感染序列中帶有病毒同源基因的細胞，只能感染沒有同源序列的細胞，據(jù)此他們提出了假說，CRISPR基因很有可能是執(zhí)行細菌免疫功能的有關(guān)基因。2008 年，Oost 實驗室的工作人員發(fā)現(xiàn)了CRISPR 實現(xiàn)免疫功能的機制，為CRISPR 的應用提供了理論基礎(chǔ)。2012 年以來，CRISPR 被廣泛用于基因的修飾、替換、敲入、切斷、敲除等技術(shù)，美國約翰·霍普金斯大學醫(yī)學院的實驗室還利用CRISPR 技術(shù)對人類的干細胞進行改造，能夠高效地將目的基因進行改變，實現(xiàn)表達特定蛋白，進而可能有效地應用于疾病治療過程中。目前，這項技術(shù)現(xiàn)在已經(jīng)運用在多種疾病的治療研究過程中。來自中國的四川大學華西醫(yī)院的科學家利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)來選擇性地敲除T 淋巴細胞中的部分基因再輸入腫瘤患者體內(nèi)，因為部分腫瘤患者體內(nèi)的免疫細胞無法識別并區(qū)分腫瘤細胞和正常細胞，導致腫瘤細胞出現(xiàn)無序增殖的現(xiàn)象，利用基因編輯技術(shù)可以使免疫細胞恢復至相對正常水平，并實現(xiàn)對腫瘤細胞的針對性攻擊，以達到長期免疫的效果，有效地治療肺癌疾病。2017 年3 月，英國的科學家利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)使因為視網(wǎng)膜中的視錐細胞和視干細胞退化而失明的小鼠重新恢復視覺。由此展望，這一項技術(shù)可以成為對色素性視網(wǎng)膜炎等眼部疾病醫(yī)治的主要手段，通過CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)可以有效抑制因為基因突變而導致的視錐細胞和視干細胞的衰亡，以此來打破此類疾病無法醫(yī)治的現(xiàn)狀。2020 年獲得了諾貝爾獎證明了此項技術(shù)未來會在更多領(lǐng)域有所發(fā)展，目前，此技術(shù)用于多項動物模擬試驗中，研究結(jié)果顯示取得了較好的效果，未來進一步在倫理規(guī)則的約束下有機會更進一步地在人體疾病中繼續(xù)作為一種可靠的應用工具。

1. CRISPR 技術(shù)概述

CRISPR 全稱為常間回文重復序列。在發(fā)揮功能的過程中，常常是由CRISPR 和Cas 蛋白構(gòu)成。CRISPR 序列在實行免疫功能時，可以將外來侵染的DNA 剪切并且吸收到自身的基因序列中。在外來侵染物第二次侵染細胞時，該序列通過堿基互補配對的原則實現(xiàn)與外來侵染的DNA的結(jié)合，并利用相關(guān)蛋白實現(xiàn)剪切。CRISPR 可以實現(xiàn)對部分基因的靶向編輯。這一系統(tǒng)具有高度靈活性和針對性，且擁有效率和成本上的優(yōu)勢。

CRISPR/Cas 系統(tǒng)具有多樣性，根據(jù)CRISPR 的組成特征和Cas 基因的結(jié)構(gòu)特征、數(shù)量等，可以大致分為3 類：第1 類是結(jié)構(gòu)和組成最為復雜的系統(tǒng)，其中含有的Cas3 屬于解旋酶；第2 類是現(xiàn)如今研究最為深入的一種，也是綜合性能最好的一種，Cas9 就是這一類的代表蛋白；第3 類包含特征性的Cas10，這一類常發(fā)現(xiàn)于細菌中。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)主要基于第2 類CRISPR 系統(tǒng)，由Cas9、反式作用RNA（tracrRNA）和前體CRISPR RNA（前體crRNA）構(gòu)成。CRISPR 序列轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生前體crRNA 和tracrRNA，成熟的crRNA 與tracrRNA 根據(jù)堿基互補配對原則結(jié)合形成局部雙鏈的結(jié)構(gòu)并進一步與Cas9 結(jié)合形成復合體。依據(jù)同源互補配對的原則，整個核糖核蛋白復合物經(jīng)成熟crRNA 的引導與靶序列（目標DNA）結(jié)合。局部解開DNA 雙鏈并使之與 crRNA 相結(jié)合，Cas9 蛋白最終通過一系列操作（通過結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)）實現(xiàn)對DNA 的切割。現(xiàn)如今已經(jīng)找到了一種引導RNA（gRNA）可以用來取代crRNA 和tracrRNA的功能，它可以通過同源互補配對原則結(jié)合到上游的結(jié)合位點處，使工作流程進一步簡化。2012 年，CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)在體內(nèi)具有切割DNA 的能力的基礎(chǔ)上，被證明在體外也同樣具有切割DNA 的能力，同時CRISPR 也被證明具有在活細胞中改變基因的潛能，這些研究為該技術(shù)的在不同領(lǐng)域的拓展奠定了方向。2013 年，CRISPR/Cas 基因編輯技術(shù)首次人工作用于植物的相關(guān)基因上，這一實驗為該技術(shù)在模式植物中的應用奠定了基礎(chǔ)。

ZFNs 技術(shù)（鋅指核酸酶技術(shù)），TALENs 技術(shù)（類轉(zhuǎn)錄激活因子效應物核酸酶技術(shù)）和CRISPR/Cas9 技術(shù)均可以實現(xiàn)基因組編輯。理論上，ZFNs 技術(shù)適用范圍較廣，可以對諸多DNA 序列進行編輯和調(diào)整。但是在實際應用中，存在著諸多問題。它需要龐大的基因表達文庫，成本高，且脫靶率高，還有潛在的細胞毒性，實驗成功率較低，所以在實際應用中很難拓展。相比而言TALENs 技術(shù)在這幾方面都有所改善，但是也存在著一些問題，例如其構(gòu)建周期長，很難進行多靶點編輯，且成本較高，使這項技術(shù)很難在實際應用中拓展。與前兩個技術(shù)相比，CRISPR/Cas9技術(shù)則具有顯著優(yōu)勢，首先這項技術(shù)設計更為簡單，在應用時能維持較低的成本，同時它的構(gòu)建周期比前兩種技術(shù)更短，可以進行多靶點的編輯且能維持較高的修飾率。但是現(xiàn)在仍然存在脫靶率不確定等問題有待優(yōu)化[1]。

2. CRISPR 技術(shù)在模式植物應用概述

CRISPR/Cas9 技術(shù)在探究生物基因功能和動植物的基因編輯等方面展現(xiàn)了非常廣闊的應用和發(fā)展前景。因為CRISPR/Cas9 技術(shù)具有低成本高效率的優(yōu)勢，其在微藻等模式植物中的應用得到了快速的進步和發(fā)展。根據(jù)相關(guān)資料顯示，CRISPR/Cas9 技術(shù)首先應用于萊茵衣藻這類藻類植物中，隨著這項技術(shù)在微藻中的拓展，越來越多的藻類基因組測序得到完善，其提供的明確的遺傳背景等信息對衣藻等多種微藻的基因工程的研究和應用起到了促進的作用。CRISPR/Cas9 技術(shù)在衣藻中的廣泛應用在體現(xiàn)了其顯著優(yōu)勢的同時，還體現(xiàn)了其具有識別并測定特定基因的功能，具有開發(fā)特定性狀的菌株的潛力。

2.1 CRISPR 技術(shù)在萊茵衣藻中的應用簡介

對于萊茵衣藻這類模式植物的研究，早在20 世紀末就開始了。作為模式植物，萊茵衣藻具有單細胞形態(tài)，培養(yǎng)條件較為簡單，樣本量較大等優(yōu)勢。所以這類模式植物成為首批進行基因組測序的藻類。許多異源轉(zhuǎn)基因已在萊茵衣藻中實現(xiàn)表達，其中包括抗生素抗性標記基因等可以方便研究者研究基因表達和篩選轉(zhuǎn)化細胞。這些特征促使萊茵衣藻成為早期研究基因編輯技術(shù)的模型藻類。

自從CRISPR/Cas9 技術(shù)首次成功應用于萊茵衣藻中，研究人員也成功地將Cas9 和sgRNA（小向?qū)Щ颍┺D(zhuǎn)入衣藻細胞中進行了短暫表達，同時也首次成功敲除了萊茵衣藻中的內(nèi)源基因，但是研究人員通過實驗也發(fā)現(xiàn)了當時的CRISPR/Cas9 技術(shù)具有極低的基因轉(zhuǎn)化效率且含有潛在細胞毒性等問題。

為了有效降低Cas9 載體的細胞毒性和脫靶效應，在隨后的幾年中，相關(guān)研究人員合成了Cas9-gRNA RNP（Cas9-gRNA 核糖核蛋白復合物）并成功將其轉(zhuǎn)化進入萊茵衣藻中，并且在不同基因座上都成功實現(xiàn)了突變。RNP 方法比起傳統(tǒng)方法的優(yōu)勢在于這個方法顯著提高了基因沉寂的效率，從而降低了脫靶效應的概率。因為這種蛋白只存在著瞬時活性并且隨后就會被細胞中相關(guān)蛋白酶所分解，所以RNP 方法也同時有效降低了細胞毒性。這一技術(shù)促進了萊茵衣藻用于黃斑色素的工業(yè)生產(chǎn)，大幅提高了玉米黃素的產(chǎn)量。

隨著技術(shù)的進步，CRISPR-Cpf1 核酸酶首次在萊茵衣藻中實驗。通過其相關(guān)核糖核蛋白復合物與相關(guān)脫氧核苷酸作為DNA 的修復模板，實現(xiàn)了定向的DNA 取代，優(yōu)化了CRISPR/Cas9 技術(shù)。

研究人員首次將CRISPRi 系統(tǒng)（基因抑制/沉默系統(tǒng)）用于萊茵衣藻中的脂質(zhì)基因的調(diào)控。PEPC 與PEP 形成草酰乙酸，草酰乙酸后流入三羧酸循環(huán)中進行相關(guān)蛋白的合成。通過一系列的反應過程，實現(xiàn)了萊茵衣藻中的脂質(zhì)積累速率，從而實現(xiàn)了生物量的積累。為促進基因編輯的效率，研究人員選擇了進一步研究MAA7 基因，通過一系列實驗操作，成功優(yōu)化了RNP 復合物的濃度的轉(zhuǎn)化方案，并且確定了實現(xiàn)高效的靶向敲除的研究方向[2]。

2.2 CRISPR 技術(shù)在藍藻中的應用簡介

藍藻是生產(chǎn)生物燃料的理想的底盤生物，但是，它的基因組的修飾卻非常的復雜。隨著CRISPR/Cas9 技術(shù)對基因組編輯方式的改變，藍藻的相關(guān)研究也實現(xiàn)了突破。其發(fā)展進程與萊茵衣藻的研究進程相似。

研究人員先通過將CRISPR/Cas9 技術(shù)實驗，發(fā)現(xiàn) Cas9具有潛在的細胞毒性。后來將Cpf1 蛋白和Cas9 蛋白進行毒性評估檢測，發(fā)現(xiàn)Cpf1 蛋白的毒性更低，并通過對不同藍藻的基因點突變等實驗證明CRISPR/Cpf1 技術(shù)更適合藍藻，且具有多功能性。

CRISPRi 系統(tǒng)后來也在藍藻工程學中得到了應用，這一應用取得了很多應用成果，實現(xiàn)了高效生產(chǎn)銨鹽等技術(shù)的突破。在不斷的研究過程中，無酶活性但影響細胞活性的dCas9 被功能相近且對細胞活性影響較小的dCpf1 取代。無酶活性這一特點，推動對于不能刪除只能抑制的必需基因的研究進行。隨著多次研究進行，人們發(fā)現(xiàn)由dCpf1 介導的CRISPRi 系統(tǒng)極大地促進了藍藻代謝工程學的發(fā)展，這一研究方式為藍藻生物量的提高提供了新的策略。

CRISPR 技術(shù)同樣具有多路復用的功能，可以實現(xiàn)多基因同時編輯。研究人員通過這一作用成功地優(yōu)化了藍藻，使其代謝過程得到了更廣大更全面地覆蓋，加速了藍藻代謝工程的研究。

2.3 CRISPR 技術(shù)在硅藻中的應用簡介

硅藻具有生產(chǎn)生物燃料和生物衍生化學品等的潛在的應用潛力，CRISPR/Cas9 技術(shù)在硅藻中也有著重要作用。研究人員通過CRISPR/Cas9 技術(shù)得到了突變菌株，并且還實現(xiàn)了對特定基因的精確敲除，有效地論證了在硅膠中進行基因編輯的可行性。

CRISPR/Cas9 技術(shù)在硅藻中的應用仍在不斷地完善的過程中。為了優(yōu)化CRISPR/Cas9 技術(shù)，研究人員采取了對CRISPR/Cas9 載體的優(yōu)化構(gòu)型，簡化了篩選的步驟，實現(xiàn)了實質(zhì)性的突破。后來，研究人員進一步改良這一技術(shù)，通過CRISPR/Cas9 切口酶優(yōu)化了部分模式植物的特定基因編輯，Cas9 切口酶的引用有效降低了脫靶效應和時間消耗。但是CRISPR/Cas9 切口酶依然存在著在微藻拓展層次的局限性。

除了上述藻類，CRISPR 技術(shù)也在其他藻類上進行著探索式的研究。研究人員對諸多工業(yè)產(chǎn)油微藻實現(xiàn)了CRISPR技術(shù)的應用，并且大幅增加了產(chǎn)量，實現(xiàn)了對脂質(zhì)的進一步累積。目前CRISPR/Cas9 技術(shù)在藻類上的研究已逐步深入，其在相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展?jié)摿κ遣豢晒懒康腫3]。

3.結(jié)語

CRISPR/Cas9 技術(shù)具有成本較低且可以實現(xiàn)多靶點修飾的功能，相較于以前的兩個技術(shù)，CRISPR/Cas9 技術(shù)擁有著顯著的優(yōu)勢。目前，這項技術(shù)為多種模式植物的相關(guān)工程提供了新的思路和方法，實現(xiàn)了對技術(shù)的應用。但是其仍然面臨著脫靶率較高，存在潛在的細胞毒性等問題，這項技術(shù)也沒有完全地應用于所有類型的模式植物中來驗證它的普適性。針對這項技術(shù)潛在的細胞毒性，我們可以通過改變Cas 蛋白類型，利用不同蛋白（例如：Cpf1 蛋白）來實現(xiàn)這項功能，同時我們可以利用體外合成RNP 的技術(shù)來降低其毒性。針對其脫靶效應，我們可以通過增加sgRNA 的BP（堿基對數(shù)目），來降低脫靶效應的頻率。未來CRISPR/Cas9 技術(shù)會在更多領(lǐng)域中實現(xiàn)廣泛應用，這項技術(shù)在不同模式植物中的進一步拓展也同樣值得期待。