湯回花 李宏 劉畢琴 陳駿飛 任洪冰 王怡瑾 史巧

摘要：為探究低聚木糖（xylooligosaccharides，XOS）對(duì)泡菜發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落變化及產(chǎn)品品質(zhì)的影響，對(duì)比了XOS和蔗糖分別作為底物時(shí)自然發(fā)酵卷心菜理化特性和代謝產(chǎn)物的變化。結(jié)果顯示，發(fā)酵第6天時(shí)，相較于蔗糖泡菜（SF），低聚木糖泡菜（XF）具有更好的脆度（P<0.05）；發(fā)酵第19天時(shí)，XF總酸含量仍為0.61 g/100 g，顯著低于SF（P<0.05）；XOS有助于延長(zhǎng)泡菜最適口感的維持期。采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)泡菜發(fā)酵過(guò)程中的細(xì)菌群落進(jìn)行分析，共獲得17個(gè)細(xì)菌門(mén)和210個(gè)細(xì)菌屬，發(fā)酵第2天時(shí)，SF中魏斯氏菌屬（Weissella）、腸桿菌屬（Enterobacter）和乳球菌屬（Lactococcus）的相對(duì)豐度較高，分別為37.60%、32.86%和19.26%，XF中魏斯氏菌屬和腸桿菌屬的相對(duì)豐度較高，分別為70.64%和20.51%；發(fā)酵第10天時(shí)，SF中主要以植物乳植桿菌屬（Lactiplantibacillus plantarum，76.65%）、明串珠菌屬（Leuconstoc，8.80%）為主，XF優(yōu)勢(shì)菌屬為植物乳植桿菌屬（89.97%）。RDA相關(guān)性分析顯示魏斯氏菌屬與泡菜的pH、脆度呈正相關(guān)，與總酸呈負(fù)相關(guān)；植物乳植桿菌屬與pH、脆度呈負(fù)相關(guān)，與總酸呈正相關(guān)。XOS可能通過(guò)調(diào)控泡菜的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，提高泡菜的品質(zhì)，為定向調(diào)控蔬菜發(fā)酵提供了參考。

關(guān)鍵詞：低聚木糖；細(xì)菌多樣性；質(zhì)構(gòu)；魏斯氏菌；泡菜

中圖分類(lèi)號(hào)：TS255.54????? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A???? 文章編號(hào)：1000-9973（2023）08-0098-08

Effects of Xylooligosaccharides on Physicochemical Properties and Bacterial Community Dynamics of Pickles

TANG Hui-hua1，2， LI Hong1，2， LIU Bi-qin1，2， CHEN Jun-fei1，2，

REN Hong-bing2， WANG Yi-jin2， SHI Qiao1，2*

（1.Institute of Agro-products Processing， Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Kunming 650223，

China; 2.Yunnan Key Laboratory of Fermented Vegetables， Honghe 654300， China）

Abstract： In order to study the effects of xylooligosaccharides （XOS） on bacterial community change and product quality during pickle fermentation， the changes of physicochemical properties and metabolites of naturally fermented cabbage are compared when XOS and sucrose are used as the substrates respectively. The results show that the crispness of xylooligosaccharide pickles （XF） is better than that of sucrose pickles （SF） on the 6th day of fermentation （P<0.05）， and the total acid content of XF is still 0.61 g/100 g on the 19th day of fermentation， which is significantly lower than that of SF （P<0.05）; XOS is helpful to prolong the maintenance period of pickle optimum taste. High-throughput sequencing technology is used to analyze the bacterial community during pickle fermentation， and a total of 17 bacterial phyla and 210 bacterial genera are obtained.On the 2nd day of fermentation， the relative abundance of Weissella， Enterobacter and Lactococcus in SF is higher， which is 37.60%， 32.86% and 19.26% respectively; the relative abundance of Weissella and Enterobacter is higher in XF， which is 70.64% and 20.51% respectively. On the 10th day of

fermentation， Lactiplantibacillus? plantarum （76.65%） and Leuconstoc （8.80%） are the main genera of SF， and the dominant genus of XF is Lactiplantibacillus plantarum（89.97%）. RDA correlation analysis shows that Weissella is positively correlated with pH and brittleness of pickles， and negatively correlated with total acid; Lactiplantibacillus plantarum is negatively correlated with pH and brittleness， and positively correlated with total acid. XOS may improve the quality of pickles by regulating the bacterial community structure of pickles， which has provided references for targeted regulation of vegetable fermentation.

Key words： xylooligosaccharides （XOS）; bacterial diversity; texture; Weissella; pickle

收稿日期：2023-03-03

基金項(xiàng)目：云南省科技廳重大科技專(zhuān)項(xiàng)（202002AE320006，202205AG070001）

作者簡(jiǎn)介：湯回花（1994—），女，助理研究員，碩士，研究方向：食品發(fā)酵。

通信作者：史巧（1983—），女，副研究員，博士，研究方向：食品發(fā)酵。

泡菜是我國(guó)一種廣泛食用的傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜。目前大多數(shù)關(guān)于發(fā)酵蔬菜的研究都強(qiáng)調(diào)了乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）在發(fā)酵中的重要性，即以明串珠菌屬（Leuconostoc）、魏斯氏菌屬（Weisella）為主的異型發(fā)酵階段和以植物乳植桿菌屬（Lactobacillus plantarum）為主的同型發(fā)酵階段[1-2]。與同型發(fā)酵相比，異型發(fā)酵產(chǎn)生 CO2、甘露醇和乙醇等代謝產(chǎn)物，總酸較少，被認(rèn)為有利于提高泡菜的感官品質(zhì)[3-4]。四川泡菜采用明串珠菌和魏斯氏菌的混合發(fā)酵劑，可以加快發(fā)酵速度，減少總酸量，改善泡菜的感官特性[5]。

低聚木糖（XOS）是木糖單元組成的低聚糖，通常，XOS是通過(guò)由β-1，4糖苷鍵連接的木糖殘基形成的寡糖混合物。參與其形成的木糖殘基數(shù)量在2～10個(gè)之間，是一類(lèi)潛在的益生元，具有免疫調(diào)節(jié)、抗癌、抗菌、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)、抗氧化等生物活性[6]。由于β-1，4糖苷鍵的存在，XOS 對(duì)宿主腸道的胃酶具有抗性，并促進(jìn)益生菌的生長(zhǎng)和增殖[7-8]。添加了XOS的食品可以滿足消費(fèi)者對(duì)健康食品的需求，提升產(chǎn)品的附加值，擴(kuò)寬XOS在食品中的應(yīng)用領(lǐng)域[9]。 然而，到目前為止，XOS作為功能性低聚糖對(duì)泡菜理化品質(zhì)和細(xì)菌群落的影響鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)研究了XOS對(duì)泡菜的理化特性、總酸、質(zhì)構(gòu)、原果膠含量、代謝產(chǎn)物小分子糖含量、有機(jī)酸含量的影響，通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)探討XOS對(duì)菌群多樣性的影響，解析低聚木糖泡菜中細(xì)菌群落的變化規(guī)律，可為XOS在發(fā)酵蔬菜中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮卷心菜、白砂糖、相關(guān)輔料：購(gòu)于昆明市售超市；低聚木糖：純度94.81%，購(gòu)于山東龍力生物科技股份有限責(zé)任公司（高相液相自測(cè)，采用面積歸一化法）；木二糖～木五糖各組分占比分別為53.99%、32.55%、6.72%和1.55%，聚合度范圍為2～5。

葡萄糖、果糖、蔗糖（均為標(biāo)準(zhǔn)品） 德國(guó)DRE公司；木糖、木二糖、木三糖、木四糖、木五糖（均為標(biāo)準(zhǔn)品） Megazyme公司；乙酸、乳酸（均為標(biāo)準(zhǔn)品） 北京索萊寶科技有限公司；50%氫氧化鈉溶液 賽默飛世爾科技有限公司；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Five Easy Plus pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；TMS-Touch食品質(zhì)構(gòu)測(cè)定儀 美國(guó)FTC公司；Dionex ICS-5000+型離子色譜儀 美國(guó)Dionex公司；LC-20AT高效液相色譜儀（配有可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器和示差檢測(cè)器） ?日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 泡菜制備及樣品處理

將卷心菜洗凈，切成1 cm×10 cm左右的條狀，裝入密封罐中加入2.5倍體積的2%食鹽水，其他配料（按食鹽水計(jì)）為生姜5%、大蒜5%、辣椒0.3%、花椒0.5%。將泡菜分為2組：對(duì)照組加入2%蔗糖（SF），處理組加入4%低聚木糖（XF）。在25 ℃恒溫條件下密封發(fā)酵。

樣品處理：分別于第0，2，4，6，8，10，14，19天取泡菜水和泡菜。泡菜制作3個(gè)批次，每批次樣品為2個(gè)重復(fù)的混樣。在－80 ℃保存，以備后續(xù)分析。

1.3.2 pH值的測(cè)定

泡菜水的pH值直接用pH計(jì)測(cè)定。

1.3.3 總酸（TA）的測(cè)定

泡菜總酸測(cè)定參考GB/T 12456－2008《食品中總酸的測(cè)定》。

1.3.4 乳酸菌數(shù)的測(cè)定

泡菜水乳酸菌的測(cè)定參考GB 4789.35－2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》[10]。

1.3.5 質(zhì)構(gòu)特性的測(cè)定

取長(zhǎng)25 mm、厚10 mm的泡菜置于質(zhì)構(gòu)儀上進(jìn)行壓縮測(cè)試。選用P/6探頭，以2.0 mm/s的恒定速度，壓縮距離為6 mm，觸發(fā)值為0.075 N。每組隨機(jī)取10個(gè)樣品進(jìn)行測(cè)定，得到脆度值。

1.3.6 原果膠含量的測(cè)定

泡菜原果膠的測(cè)定根據(jù)原果膠試劑盒（上海索橋生物科技有限公司）方法進(jìn)行。

1.3.7 小分子糖含量的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[11]的方法。取2.0 g泡菜水，以12 000 r/min離心15 min，上清液過(guò)0.22 μm濾膜，備用。 色譜條件：采用色譜柱CarboPac PA1（250 mm×4 mm），保護(hù)柱Carbo PacPA1（50 mm×4 mm）；流動(dòng)相A：H2O；流動(dòng)相B：200 mmol/L NaOH，流速1 mL/min；梯度洗脫程序：50 mmol/L氫氧化鈉水溶液（0～10 min）→200 mmol/L氫氧化鈉水溶液（10～13 min）→200 mmol/L氫氧化鈉水溶液（13～25 min）→50 mmol/L氫氧化鈉水溶液（25～30 min）；積分脈沖安培檢測(cè)器，Au工作電極，AgCl參比電極，選用四波形電位采樣；柱溫30 ℃， 進(jìn)樣量25 μL。對(duì)泡菜水中葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、木二糖、木三糖含量進(jìn)行測(cè)定。

1.3.8 有機(jī)酸含量的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[11]的方法。取1.0 g瀝干的泡菜，加入5 mL流動(dòng)相混合，制備成勻漿，于60 ℃超聲處理30 min，再以12 000 r/min離心15 min，上清液過(guò)0.22 μm濾膜，備用。色譜條件：C18色譜柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm），紫外檢測(cè)器，流動(dòng)相為0.01 mol/L磷酸二氫鉀-水（3∶97，pH 2.8），流速1 mL/min，柱溫40 ℃， 進(jìn)樣量25 μL，波長(zhǎng)210 nm。

1.3.9 感官評(píng)價(jià)

由15名專(zhuān)業(yè)人員組成感官評(píng)價(jià)小組，對(duì)發(fā)酵6 d的樣品進(jìn)行盲評(píng)打分。實(shí)行25分制，采用分段計(jì)分，從色澤、香氣、滋味、口感4個(gè)方面進(jìn)行評(píng)定，具體評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

1.3.10 DNA提取、測(cè)序和分析

采用PowerSoil DNA Isolation Kit 試劑盒提取泡菜水的總DNA，PCR擴(kuò)增16S rRNA基因全長(zhǎng)用于SMRT測(cè)序，使用正向引物27F（5'-AGGTTTGATYNTGGCTCAG-3'）和反向引物1492 R（5'-TASGGHTACCTTGTTASGACTT-3'）。PCR程序：擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min，30個(gè)循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s），然后72 ℃穩(wěn)定延伸7 min。之后用 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) DNA 的純度和濃度。高通量測(cè)序由北京百邁客生物科技有限公司基于PacBio測(cè)序平臺(tái)完成。使用Smart Link V8.0軟件，按照 min Passes（最小循環(huán)數(shù)）≥5，min Predicted Accuracy（最小準(zhǔn)確度）≥0.9 識(shí)別CCS序列，進(jìn)行序列預(yù)處理。然后使用Lima V1.7.0軟件通過(guò) Barcode 序列識(shí)別不同樣品的CCS序列并去除嵌合體，得到 Effective CCS序列。使用Usearch v10.0在相似度97%的水平上將Effective CCS 序列聚類(lèi)為OTUs；通過(guò)QIIME 2（https：//qiime2.org/）計(jì)算ACE、Chao 1、Shannon、Simpson指數(shù)，使用R軟件分析樣品稀釋曲線、Alpha多樣性指數(shù)差異。通過(guò)QIIME 2測(cè)定Beta多樣性，采用主坐標(biāo)分析（PCA）對(duì)Beta多樣性進(jìn)行分析。多級(jí)物種差異判別分析（LEfSe）分析菌群組成，LDA Score篩選值為3.5，R軟件分析組間差異顯著物種。采用冗余分析（RDA）方法探討不同因素間微生物組成的差異，進(jìn)行相關(guān)性分析。以上分析內(nèi)容均在 BMKCloud（www.biocloud.net）上完成。

1.3.11 數(shù)據(jù)處理

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 17.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Origin 8.5軟件作圖，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化指標(biāo)

2.1.1 pH和總酸

pH和總酸是影響泡菜風(fēng)味品質(zhì)的重要指標(biāo)[12]。泡菜的 pH 在發(fā)酵初始階段迅速下降并在隨后幾天趨于穩(wěn)定（見(jiàn)圖1），與SF相比，XF的pH 后期下降較慢，pH在發(fā)酵第10天時(shí)達(dá)到3.57，而SF在發(fā)酵第8天時(shí)達(dá)到3.55，且從第8天開(kāi)始不同處理間差異顯著（P<0.05）。 Iliev等[13]研究了3種乳桿菌在不同碳源培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況，結(jié)果表明在以XOS為唯一碳源時(shí)，發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)pH顯著高于葡萄糖對(duì)照組?？偹岬淖兓厔?shì)與pH相反，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中均呈上升趨勢(shì)。隨著低鹽低酸泡菜產(chǎn)品在市場(chǎng)上大受歡迎，泡菜過(guò)酸是一個(gè)需要解決的問(wèn)題，有研究表明泡菜總酸在0.6 g/100 g左右風(fēng)味最佳[14]。SF在發(fā)酵第6天時(shí)總酸含量為0.61 g/100 g，XF在發(fā)酵第8天時(shí)總酸含量為0.61 g/100 g。隨著發(fā)酵的繼續(xù)，在第19天時(shí)，SF總酸含量增加至0.75 g/100 g，XF總酸含量仍然為0.61 g/100 g（P<0.05）。Park等[15]對(duì)比了黃原膠對(duì)泡菜pH和總酸的影響，發(fā)現(xiàn)添加黃原膠發(fā)酵泡菜的pH高于空白對(duì)照組，總酸低于空白對(duì)照組，表明該多糖的添加有助于減少總酸的生成。

注：SF表示蔗糖發(fā)酵泡菜，XF表示低聚木糖發(fā)酵泡菜。不同字母表示不同發(fā)酵時(shí)間下差異顯著（P<0.05），下圖同。

2.1.2 發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌數(shù)變化

泡菜發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌數(shù)的變化見(jiàn)表2，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，乳酸菌數(shù)逐漸增加，發(fā)酵第4天后，乳酸菌數(shù)開(kāi)始減少，其變化趨勢(shì)與Yang等[16]的研究結(jié)果一致。對(duì)比整個(gè)發(fā)酵過(guò)程，可發(fā)現(xiàn)XF的乳酸菌數(shù)總體低于SF泡菜，與pH、總酸的變化趨勢(shì)一致。

2.1.3 質(zhì)構(gòu)和原果膠含量

質(zhì)構(gòu)是反映泡菜品質(zhì)的重要指標(biāo)。質(zhì)構(gòu)軟化和脆度下降主要是由于蔬菜加工過(guò)程中細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和組成的變化，尤其是果膠多糖的變化[17]。由圖2可知，發(fā)酵第2天時(shí)，SF和XF的脆度由新鮮樣品的58.87 N顯著下降為29.16 N和31.92 N，XF的脆度在發(fā)酵第4天時(shí)略有增加但不顯著，在隨后的發(fā)酵過(guò)程中逐漸下降。然而，從第4天起，XF的脆度總是顯著高于SF（P<0.05）。

原果膠是果蔬細(xì)胞壁的重要成分，與纖維素和半纖維素等交聯(lián)，在黏結(jié)細(xì)胞和維持組織脆度方面起著重要作用[18]。原果膠含量越多，樣品越容易保持其質(zhì)構(gòu)。由圖2可知，原果膠的變化趨勢(shì)與脆度一致，發(fā)酵前4 d原果膠含量呈明顯下降趨勢(shì)，SF和XF中原果膠含量由新鮮樣品的29.50 μmol/g分別下降至1.73 μmol/g和2.32 μmol/g，這可能是由于在發(fā)酵前期產(chǎn)果膠酶細(xì)菌如果膠桿菌（Pectobacterium）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）和假單胞菌屬（Pseudomonas）快速生長(zhǎng)，原果膠的酶水解作用較快[19-20]，因此，在發(fā)酵前期樣品中原果膠迅速下降，在發(fā)酵中后期含量變化不大。但從發(fā)酵第6天開(kāi)始，XF的原果膠含量顯著高于SF（P<0.05），推測(cè)XF前期產(chǎn)酸迅速，可抑制產(chǎn)果膠酶細(xì)菌的生長(zhǎng)。

2.1.4 小分子糖含量

游離糖、有機(jī)酸等泡菜代謝物對(duì)泡菜的感官特性影響很大。在發(fā)酵過(guò)程中，這些泡菜代謝物的變化會(huì)受到微生物群落的顯著影響。葡萄糖和果糖是泡菜中發(fā)現(xiàn)的主要游離糖，在發(fā)酵過(guò)程中對(duì)乳酸菌的生長(zhǎng)發(fā)揮著重要作用[21]。通過(guò)測(cè)定發(fā)酵液中糖含量的變化反映泡菜發(fā)酵程度，由表3可知，SF中的葡萄糖含量在發(fā)酵開(kāi)始時(shí)迅速增加，可能源于蔗糖的水解。發(fā)酵第2天時(shí)，蔗糖消耗量為64.62%，葡萄糖增長(zhǎng)量為54.94%，果糖增長(zhǎng)量為14.08%，隨著發(fā)酵至第6天，糖變化趨于平緩，結(jié)合表2可知，乳酸菌數(shù)逐步下降，表明泡菜乳酸菌發(fā)酵基本結(jié)束。對(duì)XF而言，與第0天相比，發(fā)酵第2天時(shí)，泡菜內(nèi)源葡萄糖、果糖滲出量大于微生物生長(zhǎng)消耗量，木二糖和木三糖消耗量分別為31.77%和25.06%；發(fā)酵第4天起，葡萄糖、果糖濃度下降相較于低聚木糖更快，表明后續(xù)發(fā)酵過(guò)程中微生物快速利用葡萄糖和果糖，對(duì)木二糖和木三糖的利用速率不顯著，這一結(jié)果可歸因于發(fā)酵后期pH較低，能利用XOS的耐酸性微生物減少，其次單糖作為碳源更易被多數(shù)微生物消耗。木糖在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中含量逐漸增加，木四糖和木五糖在發(fā)酵過(guò)程中峰面積沒(méi)有減小，表明微生物可分解木二糖和木三糖生成木糖，與前人的報(bào)道一致。Kanpiengjai等[22]研究多種乳酸菌對(duì)XOS的利用效果，發(fā)現(xiàn)乳酸乳球菌、植物乳植桿菌屬優(yōu)先利用木二糖、木三糖，產(chǎn)生木糖，Hernndez等[23]通過(guò)HPAEC-PAD和薄層層析分析了食竇魏斯氏菌株WcL17對(duì)XOS的消耗動(dòng)力學(xué)，其優(yōu)先分解短鏈XOS（木二糖、木三糖）以及生成木糖。SF與XF相比較，易于利用的碳源多，與乳酸菌數(shù)總體高的趨勢(shì)一致。

2.1.5 有機(jī)酸含量

泡菜發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸含量的變化見(jiàn)圖3，乳酸菌可以通過(guò)同型發(fā)酵和異型發(fā)酵途徑分解糖類(lèi)從而產(chǎn)生有機(jī)酸。其中，乳酸為主要代謝產(chǎn)物，其含量最高且具有溫和的酸味；乙酸具有強(qiáng)烈的刺激作用，能增強(qiáng)泡菜的香氣和酸度，改善食欲[24-25]。發(fā)酵前2 d，SF和XF中乙酸和乳酸含量無(wú)明顯差異，SF在發(fā)酵第6天時(shí)乳酸和乙酸含量分別為4.82，1.59 mg/g，XF分別為3.76，1.42 mg/g。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，發(fā)酵第19天時(shí)，SF的乳酸和乙酸含量分別為8.95，1.91 mg/g，XF分別為8.23，1.69 mg/g，發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)SF的乳酸含量顯著高于XF（P<0.05），這與其發(fā)酵后期低pH和高總酸的趨勢(shì)一致。在整個(gè)發(fā)酵周期，SF乳酸含量均高于XF，這可能是由于泡菜相關(guān)乳酸菌以蔗糖為底物產(chǎn)乳酸率高[26-27]。XOS雖然也能產(chǎn)乳酸，但由于糖代謝途徑存在差異，僅產(chǎn)β-d-木糖苷酶和 endo-1，4-β-木聚糖酶的乳酸菌才能進(jìn)行水解，因而產(chǎn)乳酸率較低[28]。

2.2 感官評(píng)價(jià)結(jié)果

泡菜的感官品質(zhì)直接決定了消費(fèi)者的飲食偏好。因此，感官評(píng)價(jià)對(duì)泡菜的品質(zhì)極其重要。由表4可知，在色澤、滋味、口感方面，XF顯著優(yōu)于SF（P<0.05），相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道XOS具有優(yōu)異的羥基自由基清除能力[29-30]，對(duì)泡菜可能具有護(hù)色作用。其次，XF感官品質(zhì)與pH、質(zhì)構(gòu)等指標(biāo)一致。

2.3 細(xì)菌Alpha多樣性

對(duì)24個(gè)樣本進(jìn)行高通量16S rDNA V1～V9區(qū)域測(cè)序，獲得312 791個(gè)原始序列。經(jīng)過(guò)質(zhì)量控制，獲得307 494個(gè)序列。樣本的平均覆蓋率為98.31%。樣本序列長(zhǎng)度主要集中在1 450～1 492 bp。根據(jù)97%的序列相似度水平，將樣本分類(lèi)為可操作分類(lèi)單元（OTU）。24個(gè)樣本細(xì)菌分類(lèi)統(tǒng)計(jì)數(shù)目為17個(gè)門(mén)、29個(gè)綱、66個(gè)目、121個(gè)科、210個(gè)屬、265種、311個(gè)OTU。

稀釋曲線（Shannon指數(shù)）接近平臺(tái)期達(dá)到飽和（見(jiàn)圖4），表明測(cè)序數(shù)據(jù)足以代表整個(gè)種群。Alpha指數(shù)評(píng)估微生物群落豐度和多樣性見(jiàn)表5，Chao 1和Ace指數(shù)用于衡量物種豐度即物種數(shù)量的多少，Shannon和Simpson指數(shù)用于衡量物種多樣性。在這項(xiàng)研究中，所有樣品在發(fā)酵開(kāi)始時(shí)都具有最高的細(xì)菌多樣性，隨著發(fā)酵的進(jìn)行逐漸減少，SF的Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)減少慢于XF，反映XF可以快速形成優(yōu)勢(shì)菌群，增加發(fā)酵過(guò)程的穩(wěn)定性。

2.4 細(xì)菌β多樣性

由圖5可知，第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）可以解釋92.46%的原始變量信息，很大程度上可以反映添加兩種不同碳源與發(fā)酵時(shí)間變化引起的細(xì)菌多樣性差異。SF和XF根據(jù)發(fā)酵時(shí)間不同分為3個(gè)發(fā)酵階段，包括2個(gè)快速轉(zhuǎn)變和1個(gè)緩慢轉(zhuǎn)變。第一次快速轉(zhuǎn)變發(fā)生在第0～2天，推測(cè)隨著發(fā)酵的開(kāi)始菌落組成發(fā)生明顯變化；第二次快速轉(zhuǎn)變發(fā)生在第2～6天，乳酸菌發(fā)酵從異型發(fā)酵向同型發(fā)酵過(guò)渡，從而導(dǎo)致變化較大；第三次緩慢轉(zhuǎn)變發(fā)生在第6～10天，由于發(fā)酵進(jìn)入后期直至發(fā)酵結(jié)束，細(xì)菌變化較小。由圖5可知，兩組起點(diǎn)接近，變化趨勢(shì)一致，XF發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌組成變化更大，表明碳源在一定程度上影響發(fā)酵過(guò)程中微生物菌落組成。

2.5 細(xì)菌組成

由圖6可知，變形菌門(mén)（Proteobacteria）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）和擬桿菌門(mén)（Bacteroidota）在發(fā)酵早期階段作為主要門(mén)存在。在發(fā)酵第0天，SF中主要的門(mén)相對(duì)豐度占比分別為變形菌門(mén)89.91%、厚壁菌門(mén)5.04%和擬桿菌門(mén)2.16%。XF分別為變形菌門(mén)96.04%和厚壁菌門(mén)2.26%。隨后，在發(fā)酵前2 d期間，厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度顯著增加，而其他門(mén)占比較小。相較于SF，XF中厚壁菌門(mén)在前2 d內(nèi)從2.26%迅速增加至79.29%，而SF則從5.04%增加為66.94%。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，厚壁菌門(mén)在兩組中是最主要的門(mén)，SF的相對(duì)豐度為92.27%，XF的相對(duì)豐度為95.74%。其次是變形菌門(mén)，相對(duì)豐度分別為7.71%和4.22%。

由圖7可知，發(fā)酵第0天的SF中主要的屬相對(duì)豐度占比分別為腸桿菌屬（Enterobacter）25.41%、Paucibacter屬25.01%和不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）22.50%，而XF中相對(duì)豐度占比高的為不動(dòng)桿菌屬（41.42%）、腸桿菌屬（22.93%）。隨后，魏斯氏菌屬的相對(duì)豐度迅速增加，然后下降直至發(fā)酵完成，峰值出現(xiàn)在第2天，分別為SF 37.60%和XF 70.64%，乳球菌屬（Lactococcus）在第2天時(shí)也達(dá)到峰值，分別為SF 19.26%和XF 8.62%，明串珠菌屬峰值出現(xiàn)在第6天，分別為SF 12.25%和XF 0.28%。XF 魏斯氏菌屬在發(fā)酵第2天時(shí)的相對(duì)豐度明顯高于SF，推測(cè)XOS促進(jìn)發(fā)酵早期魏斯氏菌屬增殖。在菌屬水平上采用LEfSe分析，發(fā)現(xiàn)明串珠菌屬為組間差異微生物。谷新晰等[31]研究了殼寡糖對(duì)泡菜微生物多樣的影響，發(fā)現(xiàn)殼寡糖試驗(yàn)組的優(yōu)勢(shì)菌為乳球菌屬，蔗糖組為成團(tuán)泛菌屬、明串珠菌屬等，表明特定碳源對(duì)菌群生長(zhǎng)存在差異。文獻(xiàn)報(bào)道XOS 由于其寡聚糖結(jié)構(gòu)僅能被特定乳酸菌利用，從而影響菌群結(jié)構(gòu)[32]，研究表明擬桿菌屬、魏斯氏菌屬、植物乳植桿菌屬、短乳桿菌屬可利用XOS[33-35]。結(jié)合表3可推斷，在發(fā)酵前期，魏斯氏菌屬通過(guò)利用木二糖和木三糖形成優(yōu)勢(shì)，而其他部分明串珠菌屬不能利用低聚木糖底物[36]，XF組不占優(yōu)勢(shì)。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，葡萄糖被快速利用，伴隨著植物乳植桿菌屬的生長(zhǎng)。發(fā)酵結(jié)束時(shí)SF中主要以植物乳植桿菌屬（76.65%）、明串珠菌屬（8.80%）為主，XF的相對(duì)豐度主要為植物乳植桿菌屬89.97%。

在菌屬水平上，SF和XF的pH、總酸（TA）、脆度（B）與細(xì)菌群落相關(guān)性分析結(jié)果見(jiàn)圖8。

RDA分析共解釋了59.44%的微生物菌群與環(huán)境因子之間的關(guān)系。在所示乳酸菌屬中，魏斯氏菌屬與pH、脆度呈正相關(guān)，與總酸呈負(fù)相關(guān)，植物乳植桿菌屬與pH、脆度呈負(fù)相關(guān)，與總酸呈正相關(guān)。Herna＇ndez等[23]研究表明5株魏斯氏菌種均有代謝XOS的能力，還具備β-葡萄糖苷酶和β-半乳糖苷酶活性。因此，XOS有助于提高泡菜發(fā)酵中魏斯氏菌屬的豐度，從而改變泡菜微生物菌群組成，促使泡菜具有更佳的感官品質(zhì)。Wang等[37]研究表明，接種Weissella cibaria CPTCC 1R15 可增強(qiáng)泡菜的風(fēng)味。Gupta等[32]研究表明，以XOS 作為唯一碳源改良MRS 中培養(yǎng)植物乳植桿菌 M-13，獲得的無(wú)細(xì)胞上清液對(duì)多種病原細(xì)菌表現(xiàn)出高抑制潛力，此外，乳酸菌利用XOS可產(chǎn)生短鏈脂肪酸，影響菌群結(jié)構(gòu)。XOS可以選擇性促進(jìn)特定乳酸菌增殖，從而調(diào)控發(fā)酵過(guò)程，提高泡菜品質(zhì)。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究XOS對(duì)泡菜自然發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落變化及產(chǎn)品品質(zhì)的影響。pH、總酸結(jié)果顯示，XOS有助于減少總酸的生成量，延緩發(fā)酵后期pH的下降；保持泡菜的脆度、原果膠含量。感官結(jié)果表明，XOS有助于延長(zhǎng)泡菜最適口感的維持期。相較于蔗糖，添加X(jué)OS促使發(fā)酵早期魏斯氏菌屬成為優(yōu)勢(shì)菌屬，發(fā)酵后期植物乳植桿菌屬成為優(yōu)勢(shì)菌屬；明串珠菌屬在菌落組成中不占優(yōu)勢(shì)，為組間差異微生物。推測(cè)XOS通過(guò)調(diào)控泡菜的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，提高泡菜的品質(zhì)。本研究可為提高發(fā)酵蔬菜生產(chǎn)的可控性提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]GUAN Q Q， ZHENG W D， HUANG T， et al. Comparison of microbial communities and physiochemical characteristics of two traditionally fermented vegetables[J].Food Research International，2020，128：108755.

[2]LIANG H P， CHEN H Y， ZHANG W X， et al. Investigation on microbial diversity of industrial Zhacai paocai during fermentation using high-throughput sequencing and their functional characterization[J].LWT-Food Science and Technology，2018，91（2）：460-466.

[3]MOON S， KIM C， CHANG H. Heterofermentative lactic acid bacteria as a starter culture to control kimchi fermentation[J].LWT-Food Science and Technology，2017，88：181-188.

[4]朱孔亮.泡菜用乳酸菌的篩選、高密度培養(yǎng)及菌劑配方的研究[D].無(wú)錫：江南大學(xué)，2014.

[5]LUO Y L， LIU Y L， REN T， et al. Sichuan paocai fermented by mixed-starter culture of lactic acid bacteria[J].Food Science & Nutrition，2020，8（10）：5402-5409.

[6]YANG J， XU Y X. Functional Carbohydrate Polymers： Prebiotics[M]//Polymers for Food Applications，Berlin：Springer，2018：651-691.

[7]HOLSCHER H D.Dietary fiber and prebiotics and the gastrointestinal microbiota[J].Gut Microbes，2017，8（2）：172-184.

[8]ZHANG S S， HU H J， WANG L F， et al. Preparation and prebiotic potential of pectin oligosaccharides obtained from citrus peel pectin[J].Food Chemistry，2018，244：232-237.

[9]PALANI A， ANTONY U， EMMAMBUX M N. Current status of xylooligosaccharides： production， characterization， health benefits and food application[J].Trends in Food Science & Technology，2021，111：506-519.

[10]中國(guó)人民共和國(guó)衛(wèi)生部.食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)：GB 4789.35－2010[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

[11]ZHANG C C， ZHANG J M， LIU D Q. Biochemical changes and microbial community dynamics during spontaneous fermentation of Zhacai， a traditional pickled mustard tuber from China[J].International Journal of Food Microbiology，2021，347（2）：109199.

[12]AN F Y， SUN H J， WU J R， et al. Investigating the core microbiota and its influencing factors in traditional Chinese pickles[J].Food Research International，2021，147：110543.

[13]ILIEV I， VASILEVA T， BIVOLARSKI V， et al. Metabolic profiling of xylooligosaccharides by lactobacilli[J].Polymers，2020，12（10）：2387.

[14]MHEEN T I， KWON T W. Effect of temperature and salt concentrations on kimchi fermentation[J].Korean Journal of Food Science and Technology，1984，16（4）：443-450.

[15]PARK W P. The quality characteristics of kimchi as affected by the addition of xanthan gum[J].Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition，2002，31（3）：423-427.

[16]YANG X T， SONG X L， WANG Y Y， et al. Effects of glycine and lactic acid bacteria starter on the quality， function and bacterial community of pickles[J].Function and Bacterial Community of Pickles，2021：508.

[17]WANG D， MA Y， SUN X， et al. Effect of dense phase carbon dioxide treatment on physicochemical and textural properties of pickled carrot[J].CyTA-Journal of Food，2019，17（1）：988-996.

[18]DONG W， LI L， CAO R X， et al. Changes in cell wall components and polysaccharide-degrading enzymes in relation to differences in texture during sweetpotato storage root growth[J].Journal of Plant Physiology，2020，254：153282.

[19]張菊，薛永常.細(xì)菌果膠酶的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào)，2011（2）：56-60.

[20]DAI X Y， KONG M， WANG X L， et al. Preparation， characterization and catalytic behavior of pectinase covalently immobilized onto sodium alginate/graphene oxide composite beads[J].Food Chemistry，2018，253（1）：185-193.

[21]HA J H， HAWER W S， KIM Y J， et al. Changes of free sugars in kimchi during fermentation[J].Korean Journal of Food Science and Technology，1989，21（5）：633-638.

[22]KANPIENGJAI A， NUNTIKAEW P， WONGSANITTAYARAK J， et al. Isolation of efficient xylooligosaccharides—fermenting probiotic lactic acid bacteria from ethnic pickled bamboo shoot products[J].Biology，2022，11（5）：638.

[23]HERNNDEZ O D， LPEZ S R， LOZANO L， et al. Diversity of Weissella confusa in pozol and its carbohydrate metabolism[J].Frontiers in Microbiology，2021，12：629449.

[24]郝懿.加鹽量對(duì)自然發(fā)酵香椿泡菜的品質(zhì)及微生物菌群的影響[D].咸陽(yáng)：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2021.

[25]OGUNTOYINB F A， FUSCO V， CHO G S， et al. Produce from Africa's gardens： potential for leafy vegetable and fruit fermentations[J].Frontiers in Microbiology，2016，7：981.

[26]MACORI G， COTTER P D. Novel insights into the microbiology of fermented dairy foods[J].Current Opinion in Biotechnology，2018，49：172-178.

[27]ZHENG J S， WITTOUCK S， SALVETTI E， et al. A taxonomic note on the genus Lactobacillus： description of 23 novel genera， emended description of the genus Lactobacillus beijerinck 1901，and union of Lactobacillaceae and Leuconostocaceae[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2020，70（4）：2782-2858.

[28]SANCHEZ J I， MARZORATI M， GROOTAERT C， et al. Arabinoxylanoligosaccharides （AXOS） affect the protein/carbohydrate fermentation balance and microbial population dynamics of the Simulator of Human Intestinal Microbial Ecosystem[J].Microbial Biotechnology，2009，2：101-113.

[29]ZHOU T， XUE Y M， REN F J， et al. Antioxidant activity of xylooligosaccharides prepared from Thermotoga maritima using recombinant enzyme cocktail of β-xylanase and α-glucuronidase[J].Journal of Carbohydrate Chemistry，2018，37（4）：210-224.

[30]KHANGKHACHIT W， SUYOTHA W， LEAMDUM C， et al.Production of thermostable xylanase using Streptomyces thermocarboxydus ME742 and application in enzymatic conversion of xylan from oil palm empty fruit bunch to xylooligosaccharides[J].Biocatalysis and Agricultural Biotechnology，2021，37：102180.

[31]谷新晰，王晨笑，于宏偉，等.殼寡糖對(duì)泡菜品質(zhì)、微生物多樣及演替規(guī)律的影響[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2021，21（10）：125-132.

[32]GUPTA M， BANGOTRA R， SHARMA S， et al. Bioprocess development for production of xylooligosaccharides prebiotics from sugarcane bagasse with high bioactivity potential[J].Industrial Crops and Products，2022，178：114591.

[33]ACHARY A A， PRAPULLA S G. Xylooligosaccharides （XOS） as an emerging prebiotic： microbial synthesis， utilization， structural characterization， bioactive properties， and applications[J].Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety，2011，10（1）：2-16.

[34]JAICHAKAN P， NAKPHAICHIT M， RUNGCHANG S， et al.Two-stage processing for xylooligosaccharide recovery from rice by-products and evaluation of products： promotion of lactic acid-producing bacterial growth and food application in a high-pressure process[J].Food Research International，2021，147：110529.

[35]IMMERZEEL P， FALCK P， GALBE M， et al. Extraction of water-soluble xylan from wheat bran and utilization of enzymatically produced xylooligosaccharides by Lactobacillus， Bifidobacterium and Weissella spp.[J].LWT-Food Science and Technology，2014，56（2）：321-327.

[36]SHARMA A， SHARMA N， GUPTA D， et al. Comparative genome analysis of four Leuconostoc strains with a focus on carbohydrate-active enzymes and oligosaccharide utilization pathways[J].Computational and Structural Biotechnology Journal，2022，20：4771-4785.

[37]WANG D D， CHEN G， TANG Y， et al. Study of bacterial community succession and reconstruction of the core lactic acid bacteria to enhance the flavor of paocai[J].International Journal of Food Microbiology，2022，375：109702.