吳逸琳，蘇海倫，姚潤藝，王帥琪，張占麗，左 麗*，張永英

（ 1． 河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北 邯鄲 056000 ；2． 館陶縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北 邯鄲 057150 ）

近年來，多重耐藥大腸桿菌的出現(xiàn)和廣泛傳播給疾病治療帶來了巨大困難[1]，使抗菌藥物的治療效果越來越差。禽致病性大腸桿菌病的治療尤為困難，傳統(tǒng)的抗生素療法效果甚微[2-3]。因此研究人員將重點(diǎn)放在尋找新的治療方法。研究表明，中藥具有多靶點(diǎn)、無毒副作用等優(yōu)點(diǎn)[4]，用于治療細(xì)菌性疾病具有良好的效果。但一種中藥含有多種有效成分，成分及藥效受到產(chǎn)地、炮制方式等多種因素的影響，限制其在臨床中的應(yīng)用[5]。中藥有效成分具有多靶位效應(yīng)，對(duì)于不同耐藥機(jī)制介導(dǎo)的大腸桿菌耐藥性具有消除效果[6]，更具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。本研究利用中藥有效成分形成組合物，并對(duì)禽致病性大腸桿菌病進(jìn)行治療，為其臨床治療多重耐藥大腸桿菌病提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

血清型為O78 的禽致病性大腸桿菌由河北工程大學(xué)禽病工程技術(shù)研究中心保存[7]。檸檬酸、蘆丁、小檗堿、頭孢噻肟等標(biāo)準(zhǔn)品購自北京索萊寶科技有限公司。三黃湯購自邯鄲市同仁堂藥店。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 溶液配制

頭孢噻肟、檸檬酸溶解于100 mL無菌蒸餾水中，蘆丁和小檗堿溶解于100 mL 10% DMSO中，0.22 μm濾膜過濾除菌。

1.2.2 中藥有效成分對(duì)大腸桿菌最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定

將大腸桿菌純化后采用二倍稀釋法測(cè)定各中藥有效成分MIC。在96 孔板中將各中藥有效成分2 倍倍比稀釋為10個(gè)稀釋度，1～10孔依次加入濃度為1×106CFU/mL菌液100 μL。第11 孔加入100 μL 菌液為陽性對(duì)照組，第12 孔加入100 μL LB 為陰性對(duì)照組，每組3 個(gè)重復(fù)，37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果，以無菌生長的最低稀釋度定為該菌的MIC值。

1.2.3 亞抑菌濃度（1/2 MIC）組合物處理

大腸桿菌接種于LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min 搖床培養(yǎng)4.0～4.5 h，比濁儀調(diào)整菌液濃度至1×106CFU/mL，然后加入終濃度為1/2 MIC 的中藥組合物（檸檬酸、蘆丁、小檗堿按2∶1∶2 體積比組合），37 ℃、180 r/min 搖床培養(yǎng)18～24 h，重復(fù)以上步驟連續(xù)作用72 h。

1.2.4 大腸桿菌動(dòng)物模型建立

選擇1 日齡蛋雛雞75 只，適應(yīng)性飼養(yǎng)6 d，7 日齡時(shí)用血清型為O78 且對(duì)頭孢噻肟耐藥的雞源大腸桿菌攻毒。記錄48 h 內(nèi)死亡率，按照改良寇氏法計(jì)算半數(shù)致死量（LD50）。大腸桿菌動(dòng)物模型試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 大腸桿菌動(dòng)物模型試驗(yàn)設(shè)計(jì)Tab.1 Grouping of E. coli animal models

1.2.5 動(dòng)物回歸試驗(yàn)細(xì)菌分離鑒定

剖檢攻毒后的蛋雛雞，無菌操作從病變臟器中分離細(xì)菌，進(jìn)行生化試驗(yàn)，確定細(xì)菌種屬，通過玻片凝集試驗(yàn)鑒定血清型，檢測(cè)分離菌株和攻毒菌株是否一致。

1.2.6 組合物治療試驗(yàn)

選擇1 日齡蛋雛雞180 只，隨機(jī)分成6 組（試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2），適應(yīng)性飼養(yǎng)6 d。7 日齡時(shí)，使用濃度為1.102×108CFU/mL O78 型大腸桿菌攻毒。從攻毒時(shí)開始采用飲水給藥的治療方式；針對(duì)臨床癥狀嚴(yán)重、不能正常飲水的雞進(jìn)行人工灌服，劑量為20 mL/kg，2次/d。記錄各組雞的發(fā)病情況，統(tǒng)計(jì)治愈率、有效率、死亡率。

表2 組合物治療試驗(yàn)設(shè)計(jì)Tab.2 Composition treatment trial groups

2 結(jié)果與分析

2.1 中藥有效成分對(duì)O78大腸桿菌的MIC（見圖1）

圖1 中藥有效成分對(duì)O78大腸桿菌的MICFig.1 MIC of active components of traditional Chinese medicine against Escherichia coli O78

由圖1可知，小檗堿、檸檬酸、蘆丁對(duì)大腸桿菌的MIC為2.00、6.25、8.00 g/L，小檗堿的抑菌效果最好。DMSO作為溶劑對(duì)照組對(duì)大腸桿菌MIC為25%，而本試驗(yàn)中DMSO作為溶劑所用濃度為10%，因此對(duì)本試驗(yàn)結(jié)果無影響。

2.2 大腸桿菌最佳攻毒劑量確定（見表3）

表3 大腸桿菌最佳攻毒劑量確定Tab.3 Determination of optimal Challenge dose of E. coli 單位:只

由表3 可知，根據(jù)改良寇氏法得出大腸桿菌O78 對(duì)蛋雛雞LD50=1.102×108CFU/mL。即1.102×108CFU/mL、0.5 mL為最佳的攻毒劑量。

2.3 動(dòng)物回歸試驗(yàn)（見圖2、表4）

圖2 動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Result of animal regression test

表4 大腸桿菌生化試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Biochemical reactions of E. coli

由圖2可知，患病蛋雛雞剖檢可見心臟、肝臟表面有黃色纖維素性滲出物，包膜肥厚易剝離，與周圍組織粘連。將上述病料無菌接種于麥康凱瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24 h，形成中等大小、突起的粉紅色菌落；挑取病料顯微鏡觀察下可見粉紅色的革蘭氏陰性短桿菌。

由表4可知，生化反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離株與大腸桿菌接近度為99.8%。測(cè)序后經(jīng)序列比對(duì)同源性在99.9%以上，表明分離株為大腸桿菌。玻片凝集試驗(yàn)出現(xiàn)明顯凝集現(xiàn)象，說明分離株與攻毒菌株為同一菌株，大腸桿菌致病模型建立成功。

2.4 中藥組合物治療雞大腸桿菌病的效果（見表5）

表5 中藥組合物治療雞大腸桿菌病的效果Tab.5 Clinical therapeutic effect of the composition on chicken colibacillosis

由表5 可知，中藥組合物與頭孢噻肟聯(lián)合使用可增強(qiáng)頭孢噻肟對(duì)大腸桿菌的治療作用，且優(yōu)于頭孢噻肟單獨(dú)治療效果。陽性對(duì)照組雞群治愈率為60.0%、有效率為72.0%、死亡率為16.7%；試驗(yàn)組雞群治愈率達(dá)86.7%、有效率為93.3%、死亡率僅為6.7%。綜上所述，組合物與頭孢噻肟聯(lián)合應(yīng)用可增強(qiáng)頭孢噻肟對(duì)大腸桿菌的治療作用。

3 討論

隨著養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，采用集約化養(yǎng)殖的雞場(chǎng)養(yǎng)殖數(shù)量不斷擴(kuò)大，飼養(yǎng)密度持續(xù)增大，易發(fā)多種疾病。雞大腸桿菌病作為規(guī)?；u場(chǎng)常發(fā)疾病之一，嚴(yán)重危害雞的生長發(fā)育[8]。禽大腸桿菌病常與血清型為O1、O2、O5、O8、O18和O78等大腸桿菌相關(guān)[9]。雞群各個(gè)年齡段均易感大腸桿菌病，其中成年雞群感染率最高（36.73%）。雞大腸桿菌病治療多依賴抗生素，但隨著多重耐藥大腸桿菌分離株增多，導(dǎo)致抗生素對(duì)這類疾病的治療效果不佳。APEC 菌株可表達(dá)對(duì)超廣譜β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的基因，從而降低頭孢噻肟的藥效，因此頭孢噻肟在家禽養(yǎng)殖和孵化場(chǎng)的應(yīng)用有限[10]。治療雞大腸桿菌病方式有多種，如抗生素、噬菌體、中藥等，但使用抗生素時(shí)，雖然可輔助宿主防御、控制和消除感染，但也可引起毒性或過敏反應(yīng)，并與耐藥菌發(fā)生重疊感染，促進(jìn)微生物染色體突變產(chǎn)生耐藥性，隨后耐藥基因向易感物種轉(zhuǎn)移，進(jìn)一步促進(jìn)耐藥基因的表達(dá)[5]。而我國傳統(tǒng)中藥治療細(xì)菌感染時(shí)不易產(chǎn)生耐藥性，對(duì)機(jī)體的毒性作用較小，且組方中藥具有多靶點(diǎn)優(yōu)勢(shì)[4,11]，根據(jù)不同耐藥機(jī)制篩選中藥進(jìn)行組方治療，可降低大腸桿菌耐藥性，提高雞大腸桿菌病治愈率[7]。賀常亮等[12]表明，用香芪湯組方治療經(jīng)大腸桿菌O78攻毒雞群，高劑量組對(duì)患病雞群的有效率（86.7%）顯著高于中劑量組（80%）和低劑量組（60%）；并且高劑量組心包炎和肝周炎發(fā)病率分別為66.7%和40.0%，顯著低于攻毒對(duì)照組、低劑量組。于文會(huì)等[13]表明，黃連組方對(duì)大腸桿菌O78 具有抑制作用，其MIC 為62.5 g/L、菌株死亡率為74.1%，顯著高于正常組菌株死亡率（37.2%）；中劑量組對(duì)發(fā)病雛雞治療效果顯著，治愈率為86.67%，明顯高于西藥組（治愈率60%）。曹翠萍[14]研究表明，黃芩+阿米卡星組方對(duì)患有雞大腸桿菌病的雞群治愈率（76.6%）和保護(hù)率（83.3%），均高于阿米卡星對(duì)照組（治愈率43.3%、保護(hù)率53.3%）和感染對(duì)照組（治愈率3.3%、保護(hù)率16.7%）。申海龍[15]研究表明，采用中藥、西藥、中西藥組合治療某雞場(chǎng)發(fā)病雞，中藥組治愈率50%，西藥組治愈率60%，中西藥組合組治愈率80%，中西藥聯(lián)合使用可以有效增加疾病治愈率。上述研究結(jié)果表明，中藥組方治療雞大腸桿菌病具有較好的效果，且中西藥聯(lián)合應(yīng)用可提高疾病治愈率，但目前對(duì)中藥有效成分和頭孢噻肟聯(lián)用治療禽大腸桿菌病的報(bào)道較少，本研究利用中藥有效成分組合物與頭孢噻肟聯(lián)合治療禽大腸桿菌病，避免了中藥的缺點(diǎn)，同時(shí)還繼承了其多靶點(diǎn)的優(yōu)點(diǎn)，比傳統(tǒng)中藥的治療效果更佳。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，由檸檬酸、蘆丁、小檗堿組成的中藥組合物和頭孢噻肟聯(lián)合應(yīng)用治療禽大腸桿菌病的有效率高達(dá)93.3%，高于傳統(tǒng)組方三黃湯治療組（80.0%），表明該組合物可應(yīng)用于治療禽大腸桿菌病。中藥藥效因多種因素影響導(dǎo)致臨床應(yīng)用受到限制，中藥有效成分組合物具有多靶點(diǎn)、不易產(chǎn)生耐藥性的優(yōu)點(diǎn)，更便于臨床上推廣應(yīng)用，并且與頭孢噻肟聯(lián)用對(duì)禽大腸桿菌病的有效率高達(dá)93.3%，為臨床中大腸桿菌病的治療及用藥提供新思路。