郭晨曦，史薇，馮旭曼，楊雅欣，龔法伍，劉占軍

華北理工大學(xué) 藥學(xué)院，河北 唐山 063210

在水溶液中，具有兩親性的分子可自組裝成納米粒，暴露出與周圍水分子接觸的親水鏈，而將其疏水鏈隱藏在里面，為主藥特別是疏水藥物提供空間[1]。透明質(zhì)酸能夠主動靶向許多癌細(xì)胞過度表達(dá)的細(xì)胞表面受體CD44 受體，可作為構(gòu)建納米粒的親水鏈[2]。熊果酸作為一種抗癌活性成分，可與姜黃素表現(xiàn)出協(xié)同抗腫瘤作用[3]，但較低的水溶性和生物利用度限制了其臨床應(yīng)用，需引入納米技術(shù)制成納米級制劑，以提高藥物的臨床療效[4]。硫辛酸具有含二硫鍵的硫辛環(huán)結(jié)構(gòu)，可發(fā)生硫醇/二硫醚的氧化還原反應(yīng)[5]。在催化量1,4-二硫代蘇糖醇的水性條件下，硫辛酸的硫辛環(huán)易開環(huán)，聚合形成線性聚硫化物[6]。谷胱甘肽在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的濃度為2～10 mmol/L，在細(xì)胞外的濃度為2～20 μmol/L，細(xì)胞外濃度明顯高于細(xì)胞外，納米粒中的硫–硫鍵結(jié)構(gòu)斷裂以響應(yīng)腫瘤細(xì)胞內(nèi)高濃度谷胱甘肽的細(xì)胞質(zhì)環(huán)境[7]。熊果酸具有抗癌活性、強疏水性，所以將其作為疏水鏈，通過共價鍵接枝到具有腫瘤靶向性的透明質(zhì)酸親水骨架上，構(gòu)建兩親性偶聯(lián)物，同時在親水骨架上接枝具有二硫鍵結(jié)構(gòu)的交聯(lián)劑硫辛酸，催化生成線性聚硫醚結(jié)構(gòu)，進行交聯(lián)，自組裝后載姜黃素，構(gòu)建具有氧化還原響應(yīng)和腫瘤靶向性的納米粒。基于以上，本實驗對兩親性透明質(zhì)酸-熊果酸-硫辛酸交聯(lián)物（hyaluronic acid-ursolic acidlipoic acid conjugate，LA-HU）自組裝形成的納米粒包載姜黃素的工藝進行研究，并對載姜黃素的透明質(zhì)酸-熊果酸-硫辛酸交聯(lián)納米粒（curcumin-loaded hyaluronic acid-ursolic acid-lipoic acid cross-linked nanoparticles，Cur/cLA-HU NPs）進行評價。

1 儀器和試劑

ZEN3690 型激光粒度分析儀（英國Malvern 儀器公司）；F-320 熒光分光光度計（天津港東科技股份有限公司）；Lambda 35 紫外可見光分光光度計（珀金埃爾默儀器有限公司）；Agilent 1260-API500高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；iMark 全自動酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad 公司）；I70-S8F2 熒光倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；JEM-2800 場發(fā)射透射電子顯微鏡（日本電子株式會社）；實驗透析袋MD44（相對分子質(zhì)量3 500，北京怡康盛世生物科技有限公司）。

姜黃素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%，批號C400271）、甲醇（分析純）、二甲基亞砜（分析純）、無水乙醇（分析純）均購于阿拉丁有限公司；0.1%磷酸鹽溶液由實驗室自配；甲醇、乙腈（色譜純，北京邁瑞達(dá)科技有限公司）；LA-HU（實驗室自制，相對分子質(zhì)量1.17×104，熊果酸取代度為10.5%，硫辛酸取代度為13.6%）；DMEM 高糖培養(yǎng)基（Eallbio，批號NG190320EL）、胰酶（Eallbio，批號N190823CF）、四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT，Eallbio，批號190114）均購于北京中生奧邦生物科技有限公司；胎牛血清（FBS，天津康源生物技術(shù)有限公司）；人肝癌細(xì)胞HepG2 受贈于華北理工大學(xué)的齊亞娟教授實驗室。

2 方法

2.1 制備流程

稱取LA-HU 10 mg，溶于5 mL 水和二甲基亞砜混合溶液中，攪拌混勻。稱取姜黃素3 mg，加入1 mL 藥物溶劑溶解。將姜黃素溶液滴加入到LAHU 聚合物溶液中，磁力攪拌混勻后于100 W 下進行超聲處理，純水過夜透析，離心后過0.45 μm 濾膜，即得非交聯(lián)載姜黃素納米粒（curcumin-loaded hyaluronic acid-ursolic acid-lipoic acid nanoparticles，Cur/LA-HU NPs）。使用催化劑催化納米粒內(nèi)部分子內(nèi)二硫鍵斷裂，重構(gòu)聚硫環(huán)，構(gòu)建交聯(lián)載姜黃素納米粒Cur/cLA-HU NPs。

2.2 姜黃素的HPLC 測定方法的建立

2.2.1色譜條件 Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流動相為甲醇–0.1%磷酸水溶液（80∶20）；紫外檢測波長為425 nm；體積流量為1.0 mL/min；進樣量為10 μL；柱溫為30 ℃。

2.2.2樣品處理 精密量取100 μL Cur/cLA-HU NPs 的PBS 溶液置離心管中，并加入100 μL 二甲基亞砜和4 mL 甲醇，超聲1 h 進行破乳，離心后取上清，過0.22 μm 濾膜。

2.2.3藥物測定 方法學(xué)試驗參考文獻(xiàn)報道[8]。以姜黃素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得到回歸曲線方程Y=102 100 171X—236 390.604，R2=0.999 8，姜黃素在10.0～100.0 μg/mL 線性關(guān)系良好。取濾液進樣測定，代入回歸曲線方程計算Cur/cLA-HU NPs 中姜黃素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2.3 載藥量和包封率的計算

將所得的姜黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定結(jié)果代入公式，計算載藥量（DL）和包封率（EE）。

DL=納米粒包載的藥物質(zhì)量/載藥納米粒質(zhì)量

EE=納米粒包載的藥物質(zhì)量/藥物投料質(zhì)量

2.4 超聲法單因素考察最佳載藥工藝

從超聲次數(shù)、藥物溶劑、姜黃素與載體LA-HU的質(zhì)量比（藥質(zhì)比）3 個因素進行單因素變量比較，測定納米粒的DL 和EE，確定載藥非交聯(lián)的最佳制備條件。

2.4.1超聲次數(shù)的考察 固定LA-HU 的質(zhì)量為10 mg，姜黃素的投料量為3 mg，以甲醇為溶劑，于100 W 功率下對LA-HU 溶液進行超聲處理，結(jié)果見表1。超聲3 次后的載藥量和包封率較超聲2、4次都高，結(jié)果更理想。超聲3、4 次后的沉淀比超聲2 次少，可能是因為超聲時間較長，破壞聚合物結(jié)構(gòu)后藥物與聚合物接觸程度更大，被包裹住的藥量更多。超聲4 次的載藥量和包封率較超聲3 次略小，且差距不大，所以采用超聲3 次作為實驗操作。

表1 不同超聲次數(shù)對納米粒DL 和EE 的影響（，n =3）Table 1 Effect of different ultrasonic times on DL and EE of nanoparticles (,n =3)

表1 不同超聲次數(shù)對納米粒DL 和EE 的影響（，n =3）Table 1 Effect of different ultrasonic times on DL and EE of nanoparticles (,n =3)

2.4.2藥物溶劑的考察 固定LA-HU 的質(zhì)量為10 mg，姜黃素的投料量為3 mg，使用溶劑甲醇、無水乙醇和二甲基亞砜溶解姜黃素，于100 W 功率下對LA-HU 溶液進行超聲處理，結(jié)果見表2。作為藥物溶劑，甲醇的載藥量和包封率最高，乙醇次之，二甲基亞砜最低。甲醇作藥物溶劑時，溶液的沉淀少，說明整個納米體系較穩(wěn)定，所以以甲醇作為藥物良溶劑來進行接下來的實驗。

表2 不同藥物溶劑對納米粒DL 和EE 的影響（，n=3）Table 2 Effects of different drug solvents on DL and EE of nanoparticles (,n =3)

表2 不同藥物溶劑對納米粒DL 和EE 的影響（，n=3）Table 2 Effects of different drug solvents on DL and EE of nanoparticles (,n =3)

2.4.3藥質(zhì)比的考察 固定LA-HU 的質(zhì)量為10 mg，姜黃素的投料量為3 mg，以甲醇為溶劑，以不同藥質(zhì)比（1∶10、2∶10、3∶10、4∶10、5∶10）對Cur/cLA-HU NPs 進行載藥。結(jié)果見表3。藥質(zhì)比增加的同時，載藥量也隨之增加，但包封率先增后減。藥質(zhì)比增加到2∶10 時，包封率最大，包封效果最好；但是藥質(zhì)比達(dá)到5∶10 時，包封率比之前減小，可能是因為藥物與載體的接觸程度在藥質(zhì)比4∶10 已達(dá)到了飽和，以致藥物無法再包載，造成損失。所以采用藥質(zhì)比4∶10 的條件進行以下實驗。

表3 不同藥質(zhì)比對納米粒DL 和EE 的影響（，n=3）Table 3 Effects of different drug-to-carrier ratios on DL and EE of nanoparticles (,n =3)

表3 不同藥質(zhì)比對納米粒DL 和EE 的影響（，n=3）Table 3 Effects of different drug-to-carrier ratios on DL and EE of nanoparticles (,n =3)

2.4.4最佳載藥工藝 以單因素變量法篩選出優(yōu)化工藝：以甲醇為藥物姜黃素有機溶劑，以藥質(zhì)比4∶10 進行投料，超聲于100 W 下次數(shù)為3 次，每次處理3 min，超聲程序設(shè)置為開2 s、停4 s。

2.5 交聯(lián)納米粒的制備

向非交聯(lián)載藥納米粒的溶液中加入適量的二硫代蘇糖醇（其中硫辛酰基基團物質(zhì)的量比例的10%），在氮氣保護下磁力攪拌，純水透析過夜，離心15 min 去沉淀，過0.45 μm 濾膜即得交聯(lián)后的載藥納米粒，測定納米粒的DL 和EE。結(jié)果見表4。Cur/cLA-HU NPs 的包封率為（87.91±1.51）%，載藥量為（16.64±0.45）%。載藥交聯(lián)納米粒的載藥量和包封率都略高于載藥非交聯(lián)納米粒。

表4 交聯(lián)對納米粒DL 和EE 的影響（，n =2）Table 4 Effect of cross-linking on DL and EE in nanoparticles(,n =2)

表4 交聯(lián)對納米粒DL 和EE 的影響（，n =2）Table 4 Effect of cross-linking on DL and EE in nanoparticles(,n =2)

2.6 Cur/cLA-HU NPs 的粒徑、電位、PDI 測定

使用透射掃描電鏡觀察Cur/cLA-HU NPs 的形態(tài)。將納米粒溶液用適量水和乙醇的混合溶液稀釋，滴少量溶液于樣品臺的碳支持膜上，室溫環(huán)境中待其干燥后，進行拍照。通過電鏡觀察Cur/cLAHU NPs 的外觀形態(tài)，見圖1?？梢钥闯鲈摷{米粒顏色比周圍環(huán)境暗，是球形結(jié)構(gòu)。通過激光粒度儀進行粒徑、電位、PDI 的考察，結(jié)果Cur/cLA-HU NPs粒徑為（172.3±2.57）nm，PDI 為（0.174±0.021），分散均勻，Zeta 電位為（?35.3±2.12）mV。

圖1 Cur/cLA-HU NPs 的TEM 圖Fig.1 TEM image of Cur/cLA-HU NPs

2.7 Cur/cLA-HU NPs 的體外釋放實驗

采用動態(tài)膜透析法模擬細(xì)胞在不同條件下的藥物釋放，研究Cur/cLA-HU NPs 在pH 7.4 還原型谷胱甘肽（GSH）不同濃度下的還原響應(yīng)性。取5 mL Cur/cLA-HU NPs 溶液密封于透析袋中，浸泡入50 mL 含有兩種不同濃度（10 μmol/L、10 mmol/L）GSH 的PBS 緩沖溶液中，在37 ℃、100 r/min 的水浴中振蕩，在預(yù)定的時間取出1 mL 釋放介質(zhì)，補充等體積介質(zhì)，測定納米粒的DL 和EE，計算累積釋放率[8]，結(jié)果見圖2。

圖2 姜黃素在GSH 不同濃度條件下的釋放（，n=2）Fig.2 Drug release of curcumin under different GSH conditions (,n =2)

可見Cur/cLA-HU NPs 在pH 7.4、10 mmol/L 的GSH 溶液中，在12 h 內(nèi)姜黃素達(dá)到約40%的累積釋放率，在72 h 內(nèi)姜黃素累積釋放率達(dá)66%左右；而在10 μmol/L GSH 中，Cur/cLA-HU NPs 在12 h內(nèi)姜黃素的累積釋放率只有16%左右，低于10 mmol/L GSH 溶液條件下的累積釋藥量。結(jié)果表明，在高濃度GSH 的環(huán)境下，GSH 誘導(dǎo)二硫鍵斷裂，Cur/cLA-HU NPs 結(jié)構(gòu)被破壞，從而快速釋放姜黃素，而在低濃度GSH 的環(huán)境下，納米粒的釋藥較慢，提示Cur/cLA-HU NPs 具有還原響應(yīng)性，釋放藥物的快慢受到GSH 濃度的影響。

2.8 細(xì)胞攝取試驗

用含有姜黃素、Cur/LA-HU NPs 和Cur/cLA-HU NPs 的新鮮培養(yǎng)基處理貼壁的HepG2 細(xì)胞，使6 孔板中各孔姜黃素的質(zhì)量濃度均為10 μg/mL，通過熒光倒置顯微鏡觀察HepG2 細(xì)胞的熒光強度。精密稱取姜黃素1 mg，置于100 mL 量瓶內(nèi)，加新鮮培養(yǎng)基定容，得到10 μg/mL 姜黃素培養(yǎng)基溶液。精密稱取Cur/LA-HU NPs、Cur/cLA-HU NPs 各0.6 mg，置于10 mL 量瓶內(nèi)，加新鮮培養(yǎng)基定容，得姜黃素質(zhì)量濃度為10 μg/mL 的培養(yǎng)基溶液。因姜黃素具有熒光特性，所以通過熒光倒置顯微鏡可以進行追蹤顯示綠色熒光的姜黃素，無需使用其他熒光染料進行標(biāo)記。如圖3 所示，在6 h 時，相比于姜黃素溶液，Cur/LA-HU NPs、Cur/cLA-HU NPs 具有較強的熒光，說明納米粒靶向腫瘤細(xì)胞，且被細(xì)胞快速攝取，胞內(nèi)GSH 誘導(dǎo)二硫鍵斷裂，釋藥速度加快，顯示更強的熒光；由于Cur/cLA-HU NPs 的載藥量和包載率均高于Cur/LA-HU NPs，Cur/cLA-HU NPs在HepG2 細(xì)胞中的熒光稍強，且被更多的細(xì)胞快速攝取。

圖3 姜黃素、Cur/LA-HU NPs 和Cur/cLA-HU NPs 的細(xì)胞攝取Fig.3 Cell uptake of curcumin,Cur/LA-HU NPs,and Cur/cLA-HU NPs

2.9 細(xì)胞毒性實驗

將HepG2 細(xì)胞以5×103cells/well 的密度接種于96 孔板中，孵育過夜。精密稱取姜黃素、熊果酸、空白交聯(lián)納米粒（cLA-HU NPs）和Cur/cLAHU NPs，配制0.1、0.2、1.0、5.0、10.0、50.0 μg/mL的溶液。熊果酸/姜黃素溶液（UA/Cur）中姜黃素質(zhì)量濃度分別為0.10、0.2、1.0、5.0、10.0、50.0 μg/mL，對應(yīng)其中熊果酸質(zhì)量濃度分別為0.060、0.12、0.61、3.04、6.08、30.43 μg/mL。實驗組分別加入姜黃素溶液、熊果酸溶液、熊果酸/姜黃素溶液、cLA-HU NPs溶液和Cur/cLA-HU NPs 溶液，對照組加入等體積培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h 后，每孔加5 mg/mL MTT 溶液10 μL 后培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，并棄舊細(xì)胞液，每孔加入150 μL 二甲基亞砜，避光，搖床震蕩10 min后于570 nm 處酶標(biāo)儀測定吸光度（A）值，計算細(xì)胞存活率（細(xì)胞存活率＝A實驗/A對照），結(jié)果見圖4。

結(jié)果顯示Cur/cLA-HU NPs 對HepG2 人肝癌細(xì)胞增殖具有明顯抑制作用。姜黃素對細(xì)胞增殖有抑制作用，其抑制作用呈現(xiàn)劑量相關(guān)性[9]；而熊果酸抑制作用也呈現(xiàn)劑量相關(guān)性[10]。兩者聯(lián)合用藥后，顯示抑制作用顯著性加強（P<0.01），與文獻(xiàn)報道[3]一致，藥物的聯(lián)合應(yīng)用比單獨用藥對腫瘤細(xì)胞的抑制作用更大。相比于Cur/cLA-HU NPs，cLA-HU NPs的細(xì)胞抑制作用較弱，除了沒有包載姜黃素的原因，可能還由于硫辛酸本身是作為參與機體內(nèi)物質(zhì)代謝的輔酶，具有生物相容性和生物安全性。相比于熊果酸/姜黃素，Cur/cLA-HU NPs 對細(xì)胞的增殖抑制作用更強，是因為透明質(zhì)酸可以與CD44 受體特異性結(jié)合，增加HepG2 細(xì)胞的攝取，并且劑型的改變也有助于細(xì)胞的攝取。

3 討論

本實驗優(yōu)化了Cur/cLA-HU NPs 的制備工藝，并對其進行了的體外評價。采用單因素變量法來篩選優(yōu)化非交聯(lián)Cur/LA-HU NPs 的制備工藝。通過非交聯(lián)Cur/LA-HU NPs 溶液載藥量和包封率值的測定，得出最佳制備工藝條件。后經(jīng)催化劑催化交聯(lián)后，制備高載藥率和高包封率的Cur/cLA-HU NPs。可能是在催化劑二硫蘇糖醇的作用下，分子內(nèi)二硫鍵斷裂后形成的具有分子間二硫鍵的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)包載了更多的藥物，使得交聯(lián)納米粒的載藥量和包封率都略高于未交聯(lián)的納米粒。Cur/cLA-HU NPs 粒徑大小合適，且分散均勻，呈球形結(jié)構(gòu)。由于Cur/cLA-HU NPs 具有還原響應(yīng)性，在高濃度GSH的環(huán)境下，其釋藥速度比在低濃度GSH 的環(huán)境下更快。

MTT 實驗和細(xì)胞攝取實驗表明，姜黃素和熊果酸的聯(lián)合應(yīng)用對腫瘤細(xì)胞的抑制作用比單獨用藥更大，達(dá)到協(xié)同增效作用；Cur/LA-HU NPs 通過透明質(zhì)酸與CD44-受體特異性結(jié)合，增強了細(xì)胞對姜黃素的攝取，為實現(xiàn)藥物的集中累積提供可能。因此Cur/cLA-HU NPs 載藥量和包封率高，其體外抗腫瘤活性稍優(yōu)于姜黃素，具有腫瘤靶向性，安全性好，在遞送疏水性抗癌藥物方面具有良好的應(yīng)用前景，實現(xiàn)腫瘤的靶向治療作用，達(dá)到減毒增效的目的，可為其他腫瘤藥物的開發(fā)提供一種策略。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突