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        載姜黃素的透明質(zhì)酸-熊果酸-硫辛酸交聯(lián)納米粒的制備及其體外抗腫瘤活性

        2023-08-17 17:57:14郭晨曦史薇馮旭曼楊雅欣龔法伍劉占軍
        現(xiàn)代藥物與臨床 2023年7期
        關(guān)鍵詞:載藥硫辛酸果酸

        郭晨曦,史薇,馮旭曼,楊雅欣,龔法伍,劉占軍

        華北理工大學(xué) 藥學(xué)院,河北 唐山 063210

        在水溶液中,具有兩親性的分子可自組裝成納米粒,暴露出與周圍水分子接觸的親水鏈,而將其疏水鏈隱藏在里面,為主藥特別是疏水藥物提供空間[1]。透明質(zhì)酸能夠主動靶向許多癌細(xì)胞過度表達(dá)的細(xì)胞表面受體CD44 受體,可作為構(gòu)建納米粒的親水鏈[2]。熊果酸作為一種抗癌活性成分,可與姜黃素表現(xiàn)出協(xié)同抗腫瘤作用[3],但較低的水溶性和生物利用度限制了其臨床應(yīng)用,需引入納米技術(shù)制成納米級制劑,以提高藥物的臨床療效[4]。硫辛酸具有含二硫鍵的硫辛環(huán)結(jié)構(gòu),可發(fā)生硫醇/二硫醚的氧化還原反應(yīng)[5]。在催化量1,4-二硫代蘇糖醇的水性條件下,硫辛酸的硫辛環(huán)易開環(huán),聚合形成線性聚硫化物[6]。谷胱甘肽在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的濃度為2~10 mmol/L,在細(xì)胞外的濃度為2~20 μmol/L,細(xì)胞外濃度明顯高于細(xì)胞外,納米粒中的硫–硫鍵結(jié)構(gòu)斷裂以響應(yīng)腫瘤細(xì)胞內(nèi)高濃度谷胱甘肽的細(xì)胞質(zhì)環(huán)境[7]。熊果酸具有抗癌活性、強疏水性,所以將其作為疏水鏈,通過共價鍵接枝到具有腫瘤靶向性的透明質(zhì)酸親水骨架上,構(gòu)建兩親性偶聯(lián)物,同時在親水骨架上接枝具有二硫鍵結(jié)構(gòu)的交聯(lián)劑硫辛酸,催化生成線性聚硫醚結(jié)構(gòu),進行交聯(lián),自組裝后載姜黃素,構(gòu)建具有氧化還原響應(yīng)和腫瘤靶向性的納米粒。基于以上,本實驗對兩親性透明質(zhì)酸-熊果酸-硫辛酸交聯(lián)物(hyaluronic acid-ursolic acidlipoic acid conjugate,LA-HU)自組裝形成的納米粒包載姜黃素的工藝進行研究,并對載姜黃素的透明質(zhì)酸-熊果酸-硫辛酸交聯(lián)納米粒(curcumin-loaded hyaluronic acid-ursolic acid-lipoic acid cross-linked nanoparticles,Cur/cLA-HU NPs)進行評價。

        1 儀器和試劑

        ZEN3690 型激光粒度分析儀(英國Malvern 儀器公司);F-320 熒光分光光度計(天津港東科技股份有限公司);Lambda 35 紫外可見光分光光度計(珀金埃爾默儀器有限公司);Agilent 1260-API500高效液相色譜儀(美國安捷倫公司);iMark 全自動酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad 公司);I70-S8F2 熒光倒置顯微鏡(日本Olympus 公司);JEM-2800 場發(fā)射透射電子顯微鏡(日本電子株式會社);實驗透析袋MD44(相對分子質(zhì)量3 500,北京怡康盛世生物科技有限公司)。

        姜黃素(質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%,批號C400271)、甲醇(分析純)、二甲基亞砜(分析純)、無水乙醇(分析純)均購于阿拉丁有限公司;0.1%磷酸鹽溶液由實驗室自配;甲醇、乙腈(色譜純,北京邁瑞達(dá)科技有限公司);LA-HU(實驗室自制,相對分子質(zhì)量1.17×104,熊果酸取代度為10.5%,硫辛酸取代度為13.6%);DMEM 高糖培養(yǎng)基(Eallbio,批號NG190320EL)、胰酶(Eallbio,批號N190823CF)、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT,Eallbio,批號190114)均購于北京中生奧邦生物科技有限公司;胎牛血清(FBS,天津康源生物技術(shù)有限公司);人肝癌細(xì)胞HepG2 受贈于華北理工大學(xué)的齊亞娟教授實驗室。

        2 方法

        2.1 制備流程

        稱取LA-HU 10 mg,溶于5 mL 水和二甲基亞砜混合溶液中,攪拌混勻。稱取姜黃素3 mg,加入1 mL 藥物溶劑溶解。將姜黃素溶液滴加入到LAHU 聚合物溶液中,磁力攪拌混勻后于100 W 下進行超聲處理,純水過夜透析,離心后過0.45 μm 濾膜,即得非交聯(lián)載姜黃素納米粒(curcumin-loaded hyaluronic acid-ursolic acid-lipoic acid nanoparticles,Cur/LA-HU NPs)。使用催化劑催化納米粒內(nèi)部分子內(nèi)二硫鍵斷裂,重構(gòu)聚硫環(huán),構(gòu)建交聯(lián)載姜黃素納米粒Cur/cLA-HU NPs。

        2.2 姜黃素的HPLC 測定方法的建立

        2.2.1色譜條件 Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5.0 μm);流動相為甲醇–0.1%磷酸水溶液(80∶20);紫外檢測波長為425 nm;體積流量為1.0 mL/min;進樣量為10 μL;柱溫為30 ℃。

        2.2.2樣品處理 精密量取100 μL Cur/cLA-HU NPs 的PBS 溶液置離心管中,并加入100 μL 二甲基亞砜和4 mL 甲醇,超聲1 h 進行破乳,離心后取上清,過0.22 μm 濾膜。

        2.2.3藥物測定 方法學(xué)試驗參考文獻(xiàn)報道[8]。以姜黃素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),得到回歸曲線方程Y=102 100 171X—236 390.604,R2=0.999 8,姜黃素在10.0~100.0 μg/mL 線性關(guān)系良好。取濾液進樣測定,代入回歸曲線方程計算Cur/cLA-HU NPs 中姜黃素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

        2.3 載藥量和包封率的計算

        將所得的姜黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定結(jié)果代入公式,計算載藥量(DL)和包封率(EE)。

        DL=納米粒包載的藥物質(zhì)量/載藥納米粒質(zhì)量

        EE=納米粒包載的藥物質(zhì)量/藥物投料質(zhì)量

        2.4 超聲法單因素考察最佳載藥工藝

        從超聲次數(shù)、藥物溶劑、姜黃素與載體LA-HU的質(zhì)量比(藥質(zhì)比)3 個因素進行單因素變量比較,測定納米粒的DL 和EE,確定載藥非交聯(lián)的最佳制備條件。

        2.4.1超聲次數(shù)的考察 固定LA-HU 的質(zhì)量為10 mg,姜黃素的投料量為3 mg,以甲醇為溶劑,于100 W 功率下對LA-HU 溶液進行超聲處理,結(jié)果見表1。超聲3 次后的載藥量和包封率較超聲2、4次都高,結(jié)果更理想。超聲3、4 次后的沉淀比超聲2 次少,可能是因為超聲時間較長,破壞聚合物結(jié)構(gòu)后藥物與聚合物接觸程度更大,被包裹住的藥量更多。超聲4 次的載藥量和包封率較超聲3 次略小,且差距不大,所以采用超聲3 次作為實驗操作。

        表1 不同超聲次數(shù)對納米粒DL 和EE 的影響(,n =3)Table 1 Effect of different ultrasonic times on DL and EE of nanoparticles (,n =3)

        表1 不同超聲次數(shù)對納米粒DL 和EE 的影響(,n =3)Table 1 Effect of different ultrasonic times on DL and EE of nanoparticles (,n =3)

        2.4.2藥物溶劑的考察 固定LA-HU 的質(zhì)量為10 mg,姜黃素的投料量為3 mg,使用溶劑甲醇、無水乙醇和二甲基亞砜溶解姜黃素,于100 W 功率下對LA-HU 溶液進行超聲處理,結(jié)果見表2。作為藥物溶劑,甲醇的載藥量和包封率最高,乙醇次之,二甲基亞砜最低。甲醇作藥物溶劑時,溶液的沉淀少,說明整個納米體系較穩(wěn)定,所以以甲醇作為藥物良溶劑來進行接下來的實驗。

        表2 不同藥物溶劑對納米粒DL 和EE 的影響(,n=3)Table 2 Effects of different drug solvents on DL and EE of nanoparticles (,n =3)

        表2 不同藥物溶劑對納米粒DL 和EE 的影響(,n=3)Table 2 Effects of different drug solvents on DL and EE of nanoparticles (,n =3)

        2.4.3藥質(zhì)比的考察 固定LA-HU 的質(zhì)量為10 mg,姜黃素的投料量為3 mg,以甲醇為溶劑,以不同藥質(zhì)比(1∶10、2∶10、3∶10、4∶10、5∶10)對Cur/cLA-HU NPs 進行載藥。結(jié)果見表3。藥質(zhì)比增加的同時,載藥量也隨之增加,但包封率先增后減。藥質(zhì)比增加到2∶10 時,包封率最大,包封效果最好;但是藥質(zhì)比達(dá)到5∶10 時,包封率比之前減小,可能是因為藥物與載體的接觸程度在藥質(zhì)比4∶10 已達(dá)到了飽和,以致藥物無法再包載,造成損失。所以采用藥質(zhì)比4∶10 的條件進行以下實驗。

        表3 不同藥質(zhì)比對納米粒DL 和EE 的影響(,n=3)Table 3 Effects of different drug-to-carrier ratios on DL and EE of nanoparticles (,n =3)

        表3 不同藥質(zhì)比對納米粒DL 和EE 的影響(,n=3)Table 3 Effects of different drug-to-carrier ratios on DL and EE of nanoparticles (,n =3)

        2.4.4最佳載藥工藝 以單因素變量法篩選出優(yōu)化工藝:以甲醇為藥物姜黃素有機溶劑,以藥質(zhì)比4∶10 進行投料,超聲于100 W 下次數(shù)為3 次,每次處理3 min,超聲程序設(shè)置為開2 s、停4 s。

        2.5 交聯(lián)納米粒的制備

        向非交聯(lián)載藥納米粒的溶液中加入適量的二硫代蘇糖醇(其中硫辛酰基基團物質(zhì)的量比例的10%),在氮氣保護下磁力攪拌,純水透析過夜,離心15 min 去沉淀,過0.45 μm 濾膜即得交聯(lián)后的載藥納米粒,測定納米粒的DL 和EE。結(jié)果見表4。Cur/cLA-HU NPs 的包封率為(87.91±1.51)%,載藥量為(16.64±0.45)%。載藥交聯(lián)納米粒的載藥量和包封率都略高于載藥非交聯(lián)納米粒。

        表4 交聯(lián)對納米粒DL 和EE 的影響(,n =2)Table 4 Effect of cross-linking on DL and EE in nanoparticles(,n =2)

        表4 交聯(lián)對納米粒DL 和EE 的影響(,n =2)Table 4 Effect of cross-linking on DL and EE in nanoparticles(,n =2)

        2.6 Cur/cLA-HU NPs 的粒徑、電位、PDI 測定

        使用透射掃描電鏡觀察Cur/cLA-HU NPs 的形態(tài)。將納米粒溶液用適量水和乙醇的混合溶液稀釋,滴少量溶液于樣品臺的碳支持膜上,室溫環(huán)境中待其干燥后,進行拍照。通過電鏡觀察Cur/cLAHU NPs 的外觀形態(tài),見圖1??梢钥闯鲈摷{米粒顏色比周圍環(huán)境暗,是球形結(jié)構(gòu)。通過激光粒度儀進行粒徑、電位、PDI 的考察,結(jié)果Cur/cLA-HU NPs粒徑為(172.3±2.57)nm,PDI 為(0.174±0.021),分散均勻,Zeta 電位為(?35.3±2.12)mV。

        圖1 Cur/cLA-HU NPs 的TEM 圖Fig.1 TEM image of Cur/cLA-HU NPs

        2.7 Cur/cLA-HU NPs 的體外釋放實驗

        采用動態(tài)膜透析法模擬細(xì)胞在不同條件下的藥物釋放,研究Cur/cLA-HU NPs 在pH 7.4 還原型谷胱甘肽(GSH)不同濃度下的還原響應(yīng)性。取5 mL Cur/cLA-HU NPs 溶液密封于透析袋中,浸泡入50 mL 含有兩種不同濃度(10 μmol/L、10 mmol/L)GSH 的PBS 緩沖溶液中,在37 ℃、100 r/min 的水浴中振蕩,在預(yù)定的時間取出1 mL 釋放介質(zhì),補充等體積介質(zhì),測定納米粒的DL 和EE,計算累積釋放率[8],結(jié)果見圖2。

        圖2 姜黃素在GSH 不同濃度條件下的釋放(,n=2)Fig.2 Drug release of curcumin under different GSH conditions (,n =2)

        可見Cur/cLA-HU NPs 在pH 7.4、10 mmol/L 的GSH 溶液中,在12 h 內(nèi)姜黃素達(dá)到約40%的累積釋放率,在72 h 內(nèi)姜黃素累積釋放率達(dá)66%左右;而在10 μmol/L GSH 中,Cur/cLA-HU NPs 在12 h內(nèi)姜黃素的累積釋放率只有16%左右,低于10 mmol/L GSH 溶液條件下的累積釋藥量。結(jié)果表明,在高濃度GSH 的環(huán)境下,GSH 誘導(dǎo)二硫鍵斷裂,Cur/cLA-HU NPs 結(jié)構(gòu)被破壞,從而快速釋放姜黃素,而在低濃度GSH 的環(huán)境下,納米粒的釋藥較慢,提示Cur/cLA-HU NPs 具有還原響應(yīng)性,釋放藥物的快慢受到GSH 濃度的影響。

        2.8 細(xì)胞攝取試驗

        用含有姜黃素、Cur/LA-HU NPs 和Cur/cLA-HU NPs 的新鮮培養(yǎng)基處理貼壁的HepG2 細(xì)胞,使6 孔板中各孔姜黃素的質(zhì)量濃度均為10 μg/mL,通過熒光倒置顯微鏡觀察HepG2 細(xì)胞的熒光強度。精密稱取姜黃素1 mg,置于100 mL 量瓶內(nèi),加新鮮培養(yǎng)基定容,得到10 μg/mL 姜黃素培養(yǎng)基溶液。精密稱取Cur/LA-HU NPs、Cur/cLA-HU NPs 各0.6 mg,置于10 mL 量瓶內(nèi),加新鮮培養(yǎng)基定容,得姜黃素質(zhì)量濃度為10 μg/mL 的培養(yǎng)基溶液。因姜黃素具有熒光特性,所以通過熒光倒置顯微鏡可以進行追蹤顯示綠色熒光的姜黃素,無需使用其他熒光染料進行標(biāo)記。如圖3 所示,在6 h 時,相比于姜黃素溶液,Cur/LA-HU NPs、Cur/cLA-HU NPs 具有較強的熒光,說明納米粒靶向腫瘤細(xì)胞,且被細(xì)胞快速攝取,胞內(nèi)GSH 誘導(dǎo)二硫鍵斷裂,釋藥速度加快,顯示更強的熒光;由于Cur/cLA-HU NPs 的載藥量和包載率均高于Cur/LA-HU NPs,Cur/cLA-HU NPs在HepG2 細(xì)胞中的熒光稍強,且被更多的細(xì)胞快速攝取。

        圖3 姜黃素、Cur/LA-HU NPs 和Cur/cLA-HU NPs 的細(xì)胞攝取Fig.3 Cell uptake of curcumin,Cur/LA-HU NPs,and Cur/cLA-HU NPs

        2.9 細(xì)胞毒性實驗

        將HepG2 細(xì)胞以5×103cells/well 的密度接種于96 孔板中,孵育過夜。精密稱取姜黃素、熊果酸、空白交聯(lián)納米粒(cLA-HU NPs)和Cur/cLAHU NPs,配制0.1、0.2、1.0、5.0、10.0、50.0 μg/mL的溶液。熊果酸/姜黃素溶液(UA/Cur)中姜黃素質(zhì)量濃度分別為0.10、0.2、1.0、5.0、10.0、50.0 μg/mL,對應(yīng)其中熊果酸質(zhì)量濃度分別為0.060、0.12、0.61、3.04、6.08、30.43 μg/mL。實驗組分別加入姜黃素溶液、熊果酸溶液、熊果酸/姜黃素溶液、cLA-HU NPs溶液和Cur/cLA-HU NPs 溶液,對照組加入等體積培養(yǎng)液,培養(yǎng)24 h 后,每孔加5 mg/mL MTT 溶液10 μL 后培養(yǎng)4 h,終止培養(yǎng),并棄舊細(xì)胞液,每孔加入150 μL 二甲基亞砜,避光,搖床震蕩10 min后于570 nm 處酶標(biāo)儀測定吸光度(A)值,計算細(xì)胞存活率(細(xì)胞存活率=A實驗/A對照),結(jié)果見圖4。

        結(jié)果顯示Cur/cLA-HU NPs 對HepG2 人肝癌細(xì)胞增殖具有明顯抑制作用。姜黃素對細(xì)胞增殖有抑制作用,其抑制作用呈現(xiàn)劑量相關(guān)性[9];而熊果酸抑制作用也呈現(xiàn)劑量相關(guān)性[10]。兩者聯(lián)合用藥后,顯示抑制作用顯著性加強(P<0.01),與文獻(xiàn)報道[3]一致,藥物的聯(lián)合應(yīng)用比單獨用藥對腫瘤細(xì)胞的抑制作用更大。相比于Cur/cLA-HU NPs,cLA-HU NPs的細(xì)胞抑制作用較弱,除了沒有包載姜黃素的原因,可能還由于硫辛酸本身是作為參與機體內(nèi)物質(zhì)代謝的輔酶,具有生物相容性和生物安全性。相比于熊果酸/姜黃素,Cur/cLA-HU NPs 對細(xì)胞的增殖抑制作用更強,是因為透明質(zhì)酸可以與CD44 受體特異性結(jié)合,增加HepG2 細(xì)胞的攝取,并且劑型的改變也有助于細(xì)胞的攝取。

        3 討論

        本實驗優(yōu)化了Cur/cLA-HU NPs 的制備工藝,并對其進行了的體外評價。采用單因素變量法來篩選優(yōu)化非交聯(lián)Cur/LA-HU NPs 的制備工藝。通過非交聯(lián)Cur/LA-HU NPs 溶液載藥量和包封率值的測定,得出最佳制備工藝條件。后經(jīng)催化劑催化交聯(lián)后,制備高載藥率和高包封率的Cur/cLA-HU NPs。可能是在催化劑二硫蘇糖醇的作用下,分子內(nèi)二硫鍵斷裂后形成的具有分子間二硫鍵的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)包載了更多的藥物,使得交聯(lián)納米粒的載藥量和包封率都略高于未交聯(lián)的納米粒。Cur/cLA-HU NPs 粒徑大小合適,且分散均勻,呈球形結(jié)構(gòu)。由于Cur/cLA-HU NPs 具有還原響應(yīng)性,在高濃度GSH的環(huán)境下,其釋藥速度比在低濃度GSH 的環(huán)境下更快。

        MTT 實驗和細(xì)胞攝取實驗表明,姜黃素和熊果酸的聯(lián)合應(yīng)用對腫瘤細(xì)胞的抑制作用比單獨用藥更大,達(dá)到協(xié)同增效作用;Cur/LA-HU NPs 通過透明質(zhì)酸與CD44-受體特異性結(jié)合,增強了細(xì)胞對姜黃素的攝取,為實現(xiàn)藥物的集中累積提供可能。因此Cur/cLA-HU NPs 載藥量和包封率高,其體外抗腫瘤活性稍優(yōu)于姜黃素,具有腫瘤靶向性,安全性好,在遞送疏水性抗癌藥物方面具有良好的應(yīng)用前景,實現(xiàn)腫瘤的靶向治療作用,達(dá)到減毒增效的目的,可為其他腫瘤藥物的開發(fā)提供一種策略。

        利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

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