巴穆登，阿布力克木·吾拉音，吳朝陽

新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院 急診創(chuàng)傷外科，新疆 烏魯木齊 830001

急性胰腺炎是一種胰腺炎性疾病，其發(fā)病率和死亡率都很高。急性胰腺炎的全球發(fā)病率為0.034%，并且在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢[1]。通常大多數(shù)患者表現(xiàn)為輕度急性胰腺炎，具有自限性，癥狀一般在1 周內(nèi)消退；約有20%的患者將發(fā)展為中度或重度急性胰腺炎，伴有胰腺/胰周組織壞死和/或器官衰竭，此類患者死亡率高達20%～40%[1]。隨著臨床管理水平的不斷提高，急性胰腺炎的全球總死亡率在持續(xù)下降，目前約為2%[1-2]。膽結(jié)石繼發(fā)的胰腺導(dǎo)管阻塞為急性胰腺炎最常見的病因；其次為酒精；其他原因包括內(nèi)鏡逆行胰膽管造影和各種藥物引發(fā)病理性細胞通路和細胞器功能障礙，上述病因均將導(dǎo)致急性胰腺炎的標志性事件胰腺腺泡細胞死亡，以及局部或全身炎癥反應(yīng)的發(fā)生[3]。肥胖、膽石癥、高三酰甘油血癥和糖尿病與急性胰腺炎獨立相關(guān)[4]。

雖然急性胰腺炎的全球疾病負擔沉重，但目前仍未有治療或預(yù)防急性胰腺炎的有效藥物[5]。急性胰腺炎的臨床管理包括準確的診斷，適當?shù)姆衷\和高質(zhì)量的支持治療，對并發(fā)癥的監(jiān)測和治療，以及預(yù)防復(fù)發(fā)。在支持治療中，最為有效的是急性胰腺炎發(fā)病后最初的12～24 h 積極的進行補液治療；超出24 h，則臨床意義不大。其次為急性胰腺炎發(fā)病24 h 后給予適當?shù)倪M食和腸內(nèi)營養(yǎng)治療、內(nèi)鏡治療、在急性胰腺炎發(fā)病4 周后才開始進行的廣譜抗生素治療，以及對積液和壞死的處理[4-5]。

巨自噬/自噬是一種進化上保守的途徑，負責清除細胞溶質(zhì)蛋白質(zhì)聚集體、受損細胞器或入侵微生物。自噬的激活是機體應(yīng)對外在（環(huán)境）和內(nèi)在（代謝）壓力，在進化上保守的適應(yīng)機制，其失調(diào)會導(dǎo)致各種疾病狀態(tài)，如神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病、傳染性、自身免疫性疾病和癌癥等[6-7]。在多項實驗動物急性胰腺炎模型研究和急性胰腺炎患者的胰腺腺泡細胞中，能夠觀察到積聚有大量液泡，而這已被證明是與自噬功能異常相關(guān)的病理性液泡。由于自噬過程受損，這些液泡中含有未被正常降解的受損的長壽命蛋白質(zhì)和其他損傷細胞器，并且這些病理性液泡將相互融合，在急性胰腺炎組織中呈現(xiàn)為空泡化的胰腺腺泡細胞[8-9]。特別是自噬功能異常后，胞質(zhì)內(nèi)過早激活的胰蛋白酶原未被及時降解，將進一步破壞胰腺腺泡細胞胞質(zhì)細胞器，自噬泡內(nèi)大量未降解脂質(zhì)的積累還導(dǎo)致腺泡細胞脂質(zhì)代謝異常，加劇腺泡細胞的炎癥水平[10]。亞精胺是一種天然多胺，可激活細胞的保護性巨自噬/自噬[11-12]。外源性補充亞精胺可延長包括酵母、線蟲、果蠅和小鼠在內(nèi)的多個物種的壽命，并維持個體健康。在人類最近的流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明，增加對富含亞精胺的食物的攝取能夠降低與心血管疾病和癌癥相關(guān)的總體死亡率[13]。亞精胺對自然衰老大鼠和D-半乳糖誘導(dǎo)的加速衰老模型具有明顯的神經(jīng)保護作用。亞精胺通過上調(diào)衰老大鼠腦組織的自噬和線粒體自噬水平，降低腦組織中的促氧化劑和氧化應(yīng)激水平，減少神經(jīng)炎癥來對抗衰老引起的神經(jīng)損傷[12]。在研究擬向急性胰腺炎小鼠模型腹膜內(nèi)注射亞精胺治療或腹膜內(nèi)注射給予亞精胺＋線粒體自噬抑制劑環(huán)孢菌素A 處理，通過測定模型小鼠胰腺炎緩解情況，評價亞精胺的療效，并探索其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 20 只6～7 周齡雄性C57BL/6J 小鼠，體質(zhì)量18.0～20.0 g，購自新疆維吾爾自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心（批號79011345）。飼養(yǎng)于恒溫（22～25 ℃）、恒濕、具備12/12 h 光暗循環(huán)的標準SPF 級動物房。每4 只小鼠一個鼠籠。小鼠自由進食和飲水。在造模實驗開始前，先對小鼠進行適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。動物實驗經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會審核批準，審批號KY202205130129。

1.1.2試劑 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶生物素-dUTP缺口末端標記（TUNEL）試劑盒（DAB 法）（貨號T10245）購自南京博恩生物（中國）公司。小鼠血清白細胞介素-6（IL-6，貨號ml063160）、腫瘤細胞壞死因子-α（TNF-α，貨號ml002095）、白細胞介素-1β（IL-1β，貨號ml037875）和超敏C 反應(yīng)蛋白（CRP，貨號ml038364）ELISA 試劑盒購自上海酶聯(lián)生物（中國）公司。抗原修復(fù)液（貨號R20911）購自上海源葉生物（中國）公司。山羊血清購自上海名勁生物（中國）公司。兔抗小鼠髓過氧化物酶（MPO）單抗（ab208670）、兔抗小鼠細胞質(zhì)基質(zhì)型LC3（LC-3Ⅰ）/Ⅱ多抗（ab128025）、兔抗小鼠泛素結(jié)合蛋白（p62）單抗（ab109012）、兔抗小鼠NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NLRP3）單抗（ab263899）、兔抗小鼠pro-半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase-1）＋p10＋p12 單抗（ab179515）、兔抗小鼠IL-1β單抗（ab254360）、兔抗小鼠PTEN 誘導(dǎo)假定激酶1（PINK1）單抗（ab300623）、兔抗小鼠Parkin 多抗（ab73015）、山羊抗兔IgG H&L（HRP）二抗（ab6721）兔抗小鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單抗（Ab9485）均購自Abcam 公司。蛋白酶抑制劑（貨號P2714）和磷酸酶抑制劑（貨號P2850）、亞精胺（貨號S2501）、環(huán)孢菌素A（貨號Y0002292）購自Sigma-Aldrich（美國）公司。RIPA 裂解液（貨號89900）和JC-1 染料（貨號T3168）購自Thermo Fisher（美國）公司。組織線粒體提取試劑盒（貨號C0010-50）購自北京普利萊生物（中國）公司。

1.1.3儀器 ECLIPSE Ni-E 光學(xué)顯微鏡購自Nikon（日本）公司。Infinite F50 熒光酶標儀購自Tecan（美國）公司。

1.2 方法

1.2.1急性胰腺炎小鼠模型構(gòu)建 通過每小時向小鼠腹膜內(nèi)注射1 次50 μg/kg 的蛙皮素（蛙皮素溶于無菌生理鹽水中），連續(xù)注射10 次，構(gòu)建急性胰腺炎小鼠模型。在末次注射結(jié)束后24 h，眼眶靜脈叢采集小鼠外周靜脈血，通過ELISA 測定血清胰蛋白酶水平，以及細胞因子IL-6、TNF-α、IL-1β、CRP的水平判定造模成功的情況。

1.2.2分組和處理 動物實驗分組為對照組、模型組、亞精胺組、亞精胺＋環(huán)孢菌素A 組，每組5 只。模型組小鼠按照1.2.1 項下急性胰腺炎小鼠模型構(gòu)建的方法注射蛙皮素建模；對照組按照同模型組的處理方式注射等體積無菌生理鹽水；亞精胺組在模型小鼠連續(xù)10 次注射蛙皮素結(jié)束后，立即腹膜內(nèi)注射100 mmol 的亞精胺（溶于200 μL PBS 中）[13]；亞精胺＋環(huán)孢菌素A 組在模型小鼠給予亞精胺治療的同時，腹膜內(nèi)注射10 mg/kg 的環(huán)孢菌素A[14]。

1.2.3蘇木精–伊紅（HE）染色 采用CO2窒息法安樂死小鼠后，迅速取小鼠胰腺組織，然后將其于4 ℃在4%甲醛中固定48 h[15]。然后對固定好的組織進行石蠟包埋和切片，切片厚度為4 μm。隨后使用HE 染色試劑盒對切片進行HE 染色。在Nikon光學(xué)顯微鏡下，以200 倍放大觀察組織切片中10 個不同的視野，以評估胰腺組織損傷的嚴重程度。

1.2.4TUNEL 染色 使用TUNEL 試劑盒進行染色確定胰腺腺泡細胞凋亡的情況。具體實驗操作步驟遵循試劑盒的說明書進行。在Nikon 光學(xué)顯微鏡下對完成TUNEL 染色的切片進行觀察和拍照。使用Image-Pro Plus v6.0 對圖像進行分析，將具有深棕色細胞核的腺泡細胞計數(shù)為TUNEL 陽性細胞。

1.2.5ELISA 法檢測炎性因子水平 從小鼠眼眶靜脈叢采集血液樣本，將血樣加入至肝素抗凝管中，輕輕混勻后，保存于4 ℃冰箱，并于24 h 內(nèi)進行ELISA 測定。使用ELISA 試劑盒對血清IL-6、TNF-α、IL-1β、CRP 的水平進行測定，具體的測定步驟按照試劑盒的說明書進行。

1.2.6免疫組織化學(xué)染色（IHC）事先制備好胰腺組織切片，方法如前1.2.3 項下所述。將切片完全浸沒入抗原修復(fù)液中，使用微波爐高火加熱至沸騰，然后繼續(xù)加熱10 min；再從微波爐取出，將抗原修復(fù)液自然冷卻至室溫。取出切片，向切片滴加3%的雙氧水，室溫下避光封閉30 min；再向切片上滴加含4%山羊血清的封閉緩沖液，室溫下封閉切片1 h；然后向切片滴加髓過氧化物酶（MPO）一抗工作液（稀釋度為1∶250），4 ℃下共同孵育過夜；次日向切片滴加山羊抗兔IgG H&L（HRP）二抗工作液（稀釋度為1∶500），室溫下共同孵育1 h。再向切片滴加生物素底物，室溫下共同孵育30 min；向切片滴加DAB 顯色液，室溫下避光顯色5～10 min。然后在Nikon 光學(xué)顯微鏡下鏡檢、觀察和拍照。

1.2.7Western blotting 法檢測相關(guān)蛋白表達 使用添加有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA 裂解液裂解胰腺組織。使用含5%脫脂奶粉的TBS 溶液，在室溫下封閉PVDF 膜1 h。向PVDF 膜上滴加一抗工作液，并在4 ℃條件下使膜與一抗工作液共同孵育過夜。次日，向PVDF 膜上滴加二抗工作液，并在室溫下使膜與二抗工作液共同孵育1 h。向PVDF 膜上滴加ECL 超敏化學(xué)發(fā)光底物，對目的條帶進行顯影。使用Image J v1.8.0 對目的條帶LC-3Ⅰ、LC-3Ⅱ、p62、NLRP3、Caspase-1、cleaved-Caspase-1、IL-1β、PINK1、Parkin 和GAPDH 的灰度值進行定量分析。

1.2.8線粒體膜電勢測定 使用組織線粒體提取試劑盒從胰腺組織中提取線粒體。使用染料JC-1 測定線粒體膜電位的水平。具體方法為將組織用PBS沖洗去除殘余血液，然后在冰冷的線粒體裂解試劑中將胰腺組織勻漿。隨后將勻漿液以1 000 ×g，在4 ℃條件下離心5 min。棄沉淀，收集含有線粒體的上清液，再以3 500 ×g在4 ℃條件下離心10 min。再次棄沉淀，收集純化好的含有線粒體的上清液，置于冰上備用。向此純化好的含有線粒體的上清液中加入JC-1 染色液。將上述混合液以每孔200 μL的體積加入至96 孔板中。每組樣品設(shè)置5 個復(fù)孔，分別對應(yīng)每個分組中的5 只小鼠。同時制備標準曲線孔。使用熒光酶標儀對每孔的熒光強度進行測定，根據(jù)標準曲線對樣品孔中膜電位進行定量。

1.2.9統(tǒng)計學(xué)分析 定量數(shù)據(jù)以5 次獨立樣本測定結(jié)果的表示。使用GraphPad Prism v6.0 軟件對計量數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。多組間差異的比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。

2 結(jié)果

2.1 亞精胺對急性胰腺炎小鼠胰腺組織損傷程度的影響

如圖1 染色結(jié)果所示，與對照組胰腺組織相比，模型組胰腺組織呈現(xiàn)出炎癥表型，表現(xiàn)為胰腺組織中浸潤了大量中性粒細胞（圖中紅色箭頭所示），腺泡細胞腫脹和壞死；亞精胺組胰腺組織的炎癥程度大大減弱，表現(xiàn)為幾乎不存在中性粒細胞的大量浸潤，腺泡細胞腫脹程度明顯減弱，基本無腺泡細胞壞死；亞精胺＋環(huán)孢菌素A 組胰腺組織的炎癥程度呈嚴重狀態(tài)，表現(xiàn)為存在大量中性粒細胞浸潤（圖中紅色箭頭所示），腺泡細胞嚴重腫脹。

圖1 HE 染色觀察亞精胺對急性胰腺炎小鼠胰腺組織的影響（×200）Fig.1 Effect of spermidine on pancreatic tissue of mice with acute pancreatitis observed by HE staining(×200)

如圖2 TUNEL 染色結(jié)果所示，與對照組胰腺組織相比，模型組胰腺組織TUNEL 染色陽性細胞數(shù)明顯增多，胰腺組織中浸潤大量中性粒細胞（圖中紅色箭頭所示）。與模型組相比，亞精胺組胰腺組織TUNEL 染色陽性細胞數(shù)明顯減少，胰腺組織中僅浸潤少量中性粒細胞（圖中紅色箭頭所示）。與亞精胺組相比，亞精胺＋環(huán)孢菌素A 組胰腺組織TUNEL 染色陽性細胞數(shù)明顯增多，胰腺組織中存在中性粒細胞大量浸潤（圖中紅色箭頭所示）。

圖2 TUNEL 染色觀察亞精胺對急性胰腺炎小鼠胰腺組織的影響（×200）Fig.2 Effect of spermidine on pancreatic tissue of mice with acute pancreatitis was observed by TUNEL staining (×200)

2.2 亞精胺對急性胰腺炎小鼠血清炎性因子和胰腺組織MPO 水平的影響

如圖3 血清ELISA 結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組小鼠血清IL-6、TNF-α、IL-1β、CRP 的水平明顯升高（P＜0.05）。與模型組相比，亞精胺組小鼠血清IL-6、TNF-α、IL-1β、CRP 的水平明顯降低（P＜0.05）。與亞精胺組相比，亞精胺＋環(huán)孢菌素A組血清IL-6、TNF-α、IL-1β、CRP 的水平明顯升高（P＜0.05）。

圖3 ELISA 法測定亞精胺對急性胰腺炎小鼠血清炎性因子水平的影響（，n =5）Fig.3 Effect of spermidine on serum inflammatory factors in mice with acute pancreatitis was determined by ELISA (,n =5)

如圖4 IHC 染色結(jié)果所示，與對照組相比，模型組MPO IHC 陽性染色細胞數(shù)明顯增多。與模型組相比，亞精胺組MPO IHC 陽性染色細胞數(shù)明顯降低。與亞精胺組相比，亞精胺＋環(huán)孢菌素A 組MPO IHC 陽性染色細胞數(shù)明顯增多。

圖4 IHC 檢測亞精胺對急性胰腺炎小鼠胰腺組織MPO 的影響（×200）Fig.4 Effect of spermidine on MPO in pancreatic tissue of mice with acute pancreatitis detected by IHC (×200)

2.3 亞精胺對急性胰腺炎小鼠胰腺組織的巨自噬水平

如圖5 所示，與對照組相比，模型組胰腺組織中巨自噬標志物LC-3Ⅰ/Ⅱ值明顯增高，p62 表達水平明顯降低（P＜0.05）。與模型組相比，亞精胺組胰腺組織中LC-3Ⅰ/Ⅱ值明顯增高，p62 的表達水平明顯降低（P＜0.05）。與亞精胺組相比，亞精胺＋環(huán)孢菌素A 組胰腺組織中LC-3Ⅰ/Ⅱ值明顯降低，p62 的表達水平明顯增高（P＜0.05）。

圖5 亞精胺對急性胰腺炎小鼠胰腺組織相關(guān)蛋白的影響（，n =5）Fig.5 Effects of spermidine on pancreatic tissue-related proteins in mice with acute pancreatitis (,n =5)

與對照組相比，模型組胰腺組織中炎癥小體標志物NLRP3、IL-1β、cleaved-Caspase-1 的表達水平明顯增高（P＜0.05）。與模型組相比，亞精胺組胰腺組織中NLRP3、IL-1β、cleaved-Caspase-1 的表達水平明顯降低（P＜0.05）。與亞精胺組相比，亞精胺＋環(huán)孢菌素A 組胰腺組織中NLRP3、IL-1β、cleaved-Caspase-1 的表達水平明顯增高（P＜0.05）。Caspase-1 的表達水平在各組間沒有明顯差異。

2.4 亞精胺對小鼠胰腺組織的線粒體自噬水平的影響

如圖6A 線粒體膜電勢水平結(jié)果所示，與對照組相比，模型組小鼠線粒體跨膜電位明顯降低（P＜0.05）；與模型組相比，亞精胺組線粒體跨膜電位明顯升高（P＜0.05）；與亞精胺組相比，亞精胺＋環(huán)孢菌素A 組線粒體跨膜電位明顯降低（P＜0.05）。如圖6B、C 結(jié)果所示，與對照組相比，模型組胰腺組織中PINK1 和p-Parkin 表達水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，亞精胺組胰腺組織中PINK1和p-Parkin 的表達水平明顯升高（P＜0.05）；與亞精胺組相比，亞精胺＋環(huán)孢菌素A 組胰腺組織中PINK1 和p-Parkin 的表達水平明顯降低（P＜0.05）。Parkin 的表達水平在各組間沒有明顯差異。

圖6 亞精胺對急性胰腺炎小鼠胰腺組織線粒體自噬水平的影響（，n =5）Fig.6 Effect of spermidine on mitochondrial autophagy in pancreatic tissue of mice with acute pancreatitis (,n =5)

3 討論

急性胰腺炎發(fā)病機制的核心細胞事件為病理性胞質(zhì)內(nèi)鈣信號增強，線粒體功能障礙，腺泡細胞和巨噬細胞內(nèi)胰蛋白酶原過早激活，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）受損和自噬受損[4,11,16-17]。腺泡細胞中Ca2+濃度的病理性升高是急性胰腺炎的中心事件，它介導(dǎo)促細胞死亡和促炎途徑，如胰蛋白酶原的過早激活、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體功能障礙[18]。細胞質(zhì)內(nèi)Ca2+超載導(dǎo)致線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔在高電導(dǎo)狀態(tài)下打開，這一過程導(dǎo)致生成ATP 所必需的線粒體膜電勢喪失，引起ATP 合成停滯[18-19]。而ATP 的耗竭又將導(dǎo)致ATP–依賴性細胞保護機制，如自噬和UPR 功能受損；以及引起ATP–依賴性光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+通道（SERCAs）和質(zhì)膜Ca2+通道（PMCA）的功能被破壞，使得細胞無法清除過多的胞質(zhì)Ca2+而使有毒的高濃度的Ca2+永久存在于胞質(zhì)內(nèi)。繼發(fā)于細胞內(nèi)Ca2+超載，線粒體功能障礙將最終導(dǎo)致腺泡細胞壞死。本次研究中也顯示，與對照組相比，模型組腺泡細胞內(nèi)的線粒體膜電勢水平明顯降低，表明線粒體功能明顯受損。已有研究證明，在急性胰腺炎和重癥急性胰腺炎小鼠模型中，線粒體功能均受損。PINK1 和PARK2 基因敲除小鼠對重癥急性胰腺炎的發(fā)作更敏感[20]。許多學(xué)者認為，提高線粒體自噬水平，及時、有序的清除局部受損的線粒體和壞死腺泡細胞，將損傷局限在小范圍內(nèi)，防止繼發(fā)性損傷和炎癥反應(yīng)的擴大，對防止急性胰腺炎的惡化十分關(guān)鍵。線粒體自噬屬于巨自噬，涉及選擇性靶向和吞噬線粒體，通過溶酶體降解去除受損線粒體。該途徑的激活是因線粒體受損的程度超出了其他質(zhì)量控制方法能夠解決的能力，或者在細胞需要去除線粒體以用于代謝或發(fā)育等目的的情況下[21]。因受損的線粒體不僅缺乏制造ATP 和其他生物活性物質(zhì)的能力，而且還會釋放更高水平的活性氧自由基（ROS）。這又會成為反饋信號，進一步增強ROS 的積累，激活NLRP3炎癥小體，并使細胞對蛋白質(zhì)和DNA 的氧化損傷敏感。同時，缺陷線粒體的積累還將通過釋放前–死亡分子導(dǎo)致細胞死亡[22]。因此，在線粒體損傷的情況下，線粒體自噬去除故障線粒體，可將胞內(nèi)線粒體種群維持在最佳狀態(tài)[21]。亞精胺是一種小分子細胞巨自噬/線粒體自噬誘導(dǎo)劑。亞精胺通過誘導(dǎo)自噬，吞噬和更新衰老和受損神經(jīng)元，提高實驗動物和人類個體的認知能力，在阿爾茲海默癥和帕金森病中起到保護功效[23-25]。亞精胺通過誘導(dǎo)自噬和抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致的小鼠肺泡細胞死亡緩解博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化[26]。但亞精胺是否能夠用于緩解急性胰腺炎尚未有明確報道。在本次研究中，給予急性胰腺炎小鼠模型以亞精胺治療，或給予急性胰腺炎小鼠模型以亞精胺＋線粒體自噬抑制劑環(huán)孢菌素A 處理，結(jié)果顯示，給予急性胰腺炎小鼠模型以亞精胺治療，與模型組相比，亞精胺組腺泡細胞內(nèi)線粒體膜電勢水平明顯升高。使用Western blotting 法針對線粒體自噬相關(guān)蛋白表達水平的檢測也表明，與對照組相比，模型組PINK1 和p-Parkin的表達水平明顯增強；與模型組相比，亞精胺組PINK1 和p-Parkin 的表達水平進一步上調(diào)。這表明當急性胰腺炎發(fā)生后，線粒體自噬被激活，而亞精胺處理能夠進一步增強這種線粒體自噬的水平。與此同時，與模型組相比，亞精胺組腺泡細胞內(nèi)巨自噬水平明顯上調(diào)，表現(xiàn)為LC-3Ⅰ/Ⅱ的水平進一步增強，p62 的表達水平進一步降低。腺泡細胞內(nèi)NLRP3 炎癥小體的水平明顯降低，表現(xiàn)為與模型組相比，亞精胺組腺泡細胞中NLRP3、IL-1β、cleaved-Caspase-1 的表達水平均明顯降低；小鼠全身性炎癥水平明顯下調(diào)，表現(xiàn)為與模型組相比，亞精胺組小鼠血清IL-6、TNF-α、IL-1β、CRP 的水平均明顯降低；小鼠胰腺組織MPO 陽性細胞數(shù)量明顯減少。與模型組相比，HE 染色顯示亞精胺組胰腺組織的炎癥程度大大減弱，幾乎不存在中性粒細胞的大量浸潤，腺泡細胞腫脹程度明顯減弱；TUNEL 染色顯示亞精胺組胰腺組織TUNEL 染色陽性細胞數(shù)明顯減少。而使用環(huán)孢菌素A 抑制線粒體自噬后，亞精胺緩解急性胰腺炎小鼠胰腺組織損傷的功效被大大阻斷。表現(xiàn)為與亞精胺組相比，亞精胺＋環(huán)孢菌素A 組上述檢測指標均發(fā)生逆轉(zhuǎn)。

PINK1/Parkin 驅(qū)動的線粒體自噬是最具特征的線粒體自噬經(jīng)典途徑[27]。在健康線粒體中，PINK1被導(dǎo)入線粒體內(nèi)膜，在那里它暴露于線粒體蛋白酶髓磷脂蛋白0（MPP）和早老素相關(guān)菱形樣蛋白（PARL）并被其切割降解。當線粒體膜電勢喪失，線粒體去極化，或錯誤折疊的線粒體蛋白積累后，PINK1 向內(nèi)膜的導(dǎo)入被阻止。因此PINK1 被穩(wěn)定在線粒體外膜表面，然后通過其激酶活性，將p-Parkin 和線粒體外膜表面數(shù)種泛素化蛋白因子[28]。然后，p-Parkin 被募集到這些線粒體和泛素化途徑中的多種表面蛋白上，這些蛋白中的一些作為自噬受體的信號，而另一些則是蛋白酶體的作用靶點，隨后參與降解損傷線粒體，而這些都是線粒體自噬過程必不可少的成分[29]。該途徑還包含1個放大環(huán)，其中p-Parkin 促進其被進一步的募集和磷酸化，導(dǎo)致更多的p-Parkin 被泛素化和依次在線粒體外膜表面的積累，建立降解信號[30-31]。本次研究中結(jié)果也明確顯示，使用環(huán)孢菌素A 阻斷線粒體自噬后，PINK1 和p-Parkin 的水平明顯降低，說明其介導(dǎo)的線粒體自噬過程被顯著抑制，亞精胺的功效被抵消。綜上所述，亞精胺可能通過促進線粒體自噬來發(fā)揮保護急性胰腺炎小鼠胰腺組織功效的。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突