田高輝，張琴星，史江舟，趙芬芳，王 寧，趙家旋，盧玉琳，徐 瑤

1.武漢科技大學生命科學與健康學院生物醫(yī)學研究院，湖北 武漢 430081；

2.天津科技大學生物工程學院，天津 300457

隨著分子生物學的發(fā)展，各種可以人為操縱DNA和RNA的工具也得到了長足發(fā)展，并改變了現(xiàn)代醫(yī)學的發(fā)展進程［1］?；虔煼軌蛸x予細胞或有機體在自然狀態(tài)下不存在的能力［2］。在基因改造方面，慢病毒是最典型的代表，因為其具有進入細胞并將遺傳物質(zhì)運送到細胞的天然能力［3］。慢病毒載體經(jīng)過幾十年的發(fā)展，目前已經(jīng)進入了第三代慢病毒載體階段。第一代慢病毒載體包含人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）基因組的大部分，以及一種病毒的包膜蛋白，最常見的是水泡性口炎病毒糖蛋白（vesicular stomatitis virus glycoprotein，VSV-G）［4］，VSV-G可以識別在細胞上廣譜表達的低密度脂蛋白受體［5-6］，因此使得該慢病毒載體可轉(zhuǎn)導廣泛的細胞；第二代慢病毒載體去除了輔助毒性因子VIF、VPR、VPU和NEF［4］，提高了其安全性且不影響慢病毒轉(zhuǎn)運遺傳物質(zhì)的能力；第三代慢病毒載體將病毒基因組gag和pol分裂成單獨的質(zhì)粒［7］，進一步降低了由基因重組導致的的復制型慢病毒產(chǎn)生的概 率。

嵌合抗原受體T（chimeric antigen receptor T，CAR-T）細胞技術是通過分子生物學和基因工程改造技術，將靶向特異性抗原的單鏈抗體的輕重鏈可變區(qū)序列在患者的T細胞膜上表達，進而特異性地殺死腫瘤細胞，達到治療癌癥的目的［8-9］。慢病毒載體的出現(xiàn)極大地推動了CAR-T細胞治療的發(fā)展。目前，已有多種CAR-T細胞治療進入臨床應用階段［10］。研究［11-13］表明，CAR-T細胞在治療B細胞惡性腫瘤方面取得了前所未有的療效，最顯著的是應用抗CD19 CAR-T細胞治療B細胞急性淋巴細胞白血病的完全緩解率高達90%。

對于霍奇金淋巴瘤，CD30是一個理想的候選靶點，因為其在霍奇金淋巴瘤腫瘤細胞中表達豐富且具有特異性，在正常組織中表達有限［14］?？笴D30 CAR-T細胞是最近新興的靶向CD30分子的CAR-T細胞，對霍奇金淋巴瘤有很好的治療作用［15］。有臨床研究［16-17］表明，抗CD30 CAR-T用于治療復發(fā)或難治性霍奇金淋巴瘤，淋巴清除后產(chǎn)生高應答率并持續(xù)一般時間，具有極好的安全性和極小的毒性。隨著抗CD30 CAR-T細胞研究的進行，利用慢病毒載體制備CAR-T細胞的技術研究取得了很大進展，然而原代T細胞抗CD30 CAR慢病毒轉(zhuǎn)導條件還沒有進行全面細致的研究。

影響慢病毒靜止轉(zhuǎn)導的因素通常有感染復數(shù)（multiplicity of infection，MOI）、溫育密度、轉(zhuǎn)導前活化時間和轉(zhuǎn)導體系高度等［18-20］。本實驗旨在優(yōu)化抗CD30 CAR-T細胞的慢病毒轉(zhuǎn)導參數(shù)，以制備出高質(zhì)量的抗CD30 CAR-T細胞，以期為臨床試驗所需的大量細胞的制備提供依據(jù)，同時也為其他靶點CAR-T細胞的轉(zhuǎn)導優(yōu)化提供參 考。

1 材料和方法

1.1 試劑

抗CD30 CAR慢病毒和CD30檢測蛋白為武漢波睿達生物科技有限公司贈予，人原代T細胞從人外周血中提取，人CD3磁珠和人T cell TransAct購自德國Miltenyi公司，T25和T75細胞培養(yǎng)瓶購自美國Corning公司，轉(zhuǎn)導試劑聚凝胺（Polybrene）購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司，胎牛血清購自上海吉泰依科賽生物科技有限公司，DMEM-Basic、RPMI-1640及TexMACSTMGMP培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司。

流式抗體：7-AAD、PE抗人CD25抗體和Alexa Fluor 488 Donkey抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）抗體購自美國Biolegend公司，BV421抗人CD69抗體購自深圳市達科為生物技術股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 人原代T細胞的分離

采集健康人群外周血，經(jīng)等體積的生理鹽水稀釋后，緩慢加到已預先加入20 mL淋巴細胞分離液的50 mL離心管中，700×g離心20 min，離心時調(diào)節(jié)離心機升降參數(shù)至最低，離心后將環(huán)狀乳白色淋巴細胞層用移液器吸出，得到單個核細胞。以10 μL/2×107個細胞的比例加入人CD3磁珠，加入4倍體積的分選緩沖液后4 ℃溫育15 min，用5 mL分選緩沖液重懸，將懸液通過磁力柱，T細胞會通過磁珠被吸附到柱子上，用2 mL分選緩沖液洗兩遍柱子后，在柱子中加入5 mL分選緩沖液，用力快速推動柱子上的活塞將T細胞沖洗下來，收集沖洗下來的細胞。

1.2.2 慢病毒轉(zhuǎn)導T細胞

1.2.2.1 不同MOI對T細胞轉(zhuǎn)導的影響

取需要數(shù)目的生長狀況良好的原代T細胞于6孔板中，采用MOI為0.00、0.25、0.50、1.00、1.50、3.00的梯度對T細胞進行轉(zhuǎn)導，轉(zhuǎn)導時補加Polybrene使其終濃度為5 μg/mL。轉(zhuǎn)導后持續(xù)監(jiān)測CAR-T細胞的增殖情況，通過流式細胞術檢測轉(zhuǎn)導效率和細胞存活率。

1.2.2.2 轉(zhuǎn)導時T細胞溫育密度對T細胞轉(zhuǎn)導的影 響

確定最優(yōu)的MOI后，采用0.2×1 07、0.5×107、1.0×107、2.0×107個/mL的溫育密度轉(zhuǎn)導T細胞，轉(zhuǎn)導后監(jiān)測CAR-T細胞的增殖情況，通過流式細胞術檢測轉(zhuǎn)導效率和細胞存活 率。

1.2.2.3 轉(zhuǎn)導前T細胞活化時間對T細胞轉(zhuǎn)導的影 響

確定最優(yōu)的MOI和溫育密度后，選用人T cell TransAct刺激T細胞0、8、16、24、48及72 h后，轉(zhuǎn)導T細胞，轉(zhuǎn)導后監(jiān)測CAR-T細胞的增殖情況，通過流式細胞術檢測T細胞激活情況、轉(zhuǎn)導效率和細胞存活率。

1.2.2.4 轉(zhuǎn)導體系高度對T細胞轉(zhuǎn)導的影響

轉(zhuǎn)導相同數(shù)量的T細胞，分別用T25和T75培養(yǎng)瓶作為容器，使轉(zhuǎn)導體系高度分別為0.16和0.53 mm，轉(zhuǎn)導后監(jiān)測CAR-T細胞的增殖情況，通過流式細胞術檢測轉(zhuǎn)導效率，采用鈣黃綠素釋放法檢測抗CD30 CAR-T細胞的體外殺傷效率。

1.2.3 流式細胞術檢測

收集大于5×105個CAR-T細胞于流式管中，向每管中加入1 ～ 2 mL流式緩沖液，500×g離心5 min，去掉上清液，重復洗2遍，用流式緩沖液配制好工作濃度的染色抗體重懸細胞，4 ℃避光染色30 min后，加入1 mL流式緩沖液終止染色，500×g離心5 min，棄去上清液，重復洗2遍，加2 μL 7-AAD抗體于100 μL流式緩沖液中重懸細胞，2 ～ 3 h內(nèi)通過流式細胞術分析檢測。

1.2.4 鈣黃綠素釋放法檢測抗CD30 CAR-T細胞的細胞毒性

選取L428細胞系作為陽性靶細胞，人骨髓瘤細胞系K562作為陰性靶細胞，效應細胞為抗CD30 CAR-T細胞。將經(jīng)鈣黃綠素標記、濃度為5×104個/mL的靶細胞接種于U底96孔培養(yǎng)板中，100 μL/孔。按不同效靶比（25∶1、5∶1、1∶ 1）加入各組效應細胞，體積為100 μL/孔。設置陽性對照組（加入裂解液）和陰性對照組（加入磷酸緩沖鹽溶液）。各組均設3個復孔，在37 ℃生化培養(yǎng)箱中溫育2.5 ～ 3.0 h。后將96孔板以700×g離心10 min，從各孔吸取150 μL上清液對應轉(zhuǎn)移到預先標記好的新的平底96孔板中，置于酶標儀（參數(shù)設置：激發(fā)光波長為485/20，發(fā)射光波長為530/25）掃描讀取熒光值。根據(jù)以下公式計算各組效應細胞的細胞毒性：特異性裂解百分比（%）=（實驗組熒光值－陰性對照組熒光值）/（陽性對照組熒光值－陰性對照組熒光值）×100%。實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學處理

本研究采用GraphPad Prism 8軟件進行數(shù)據(jù)分析，實驗數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同MOI對于抗CD30 CAR-T細胞轉(zhuǎn)導的影 響

MOI對于T細胞轉(zhuǎn)導效率具有決定性的影響，因此我們首先從該條件開始進行轉(zhuǎn)導條件的優(yōu)化。根據(jù)本課題組以往研究［17］，分別采用MOI為0.00、0.25、0.50、1.00、1.50、3.00的梯度對健康人群外周血來源的新鮮T細胞進行轉(zhuǎn)導。通過流式細胞術檢測不同MOI對于抗CD30 CAR-T細胞轉(zhuǎn)導效率的影響，結(jié)果顯示，MOI為1.00、1.50和3.00組在第8天的轉(zhuǎn)導效率顯著高于0.00、0.25和0.50組［（25.60±3.51）%、（26.33±5.32）%和（32.67±6.47）%vs（1.00±0.00）%、（9.17±2.23）%和（14.50±4.81）%，P＜0.01］，1.00、1.50和3.00組間差異無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05，圖1A），各組CAR-T細胞在轉(zhuǎn)導第8天的細胞存活率均為80%左右，組間差異無統(tǒng)計學意義 ［（84.67±5.20）%、（81.17±2.79）%、（79.50±2.74）%、（79.67±1.63）%、（79.00±1.55）%和（77.83±1.72）%，P＞ 0.05，圖1B］。

圖1 不同MOI對于抗CD30 CAR-T細胞轉(zhuǎn)導的影響Fig.1 Effects of different MOI on transduction of anti-CD30 CAR-T cell

本實驗還研究了不同MOI對抗CD30 CAR-T細胞增殖能力的影響，結(jié)果顯示，不同MOI對于抗CD30 CAR-T細胞的增殖能力的影響差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖1C），但1.00、1.50和3.00組在第16天的抗CD30 CAR-T有效細胞數(shù)（T細胞數(shù)×轉(zhuǎn)導效率）顯著高于0.00、0.25和0.50組（P均＜0.01）；1.00、1.50、3.00組間差異無統(tǒng)計學意義（圖1D）。根據(jù)不同MOI的轉(zhuǎn)導條件下，轉(zhuǎn)導效率、抗CD30 CAR-T細胞總數(shù)和有效細胞數(shù)等3個方面的情況，綜合慢病毒成本，最終選擇MOI=1.00作為慢病毒轉(zhuǎn)導T細胞的關鍵參 數(shù)。

2.2 不同溫育密度對于抗CD30 CAR-T細胞轉(zhuǎn)導的影響

溫育密度會影響細胞與慢病毒之間的接觸［19］，可能會進一步影響轉(zhuǎn)導效率，因此本研究選取不同的溫育密度對轉(zhuǎn)導條件進行優(yōu)化。通過流式細胞術檢測不同溫育密度對抗CD30 CAR-T細胞轉(zhuǎn)導效率和細胞存活率的影響，結(jié)果顯示，各組抗CD30 CAR-T細胞在轉(zhuǎn)導第8天的轉(zhuǎn)導效率和細胞存活率差異均無統(tǒng)計學意義［轉(zhuǎn)導效率：（24.00±8.51）%、（25.50±7.87）%、（25.33±8.09）%和（24.50±7.58）%，P＞0.05；細胞存活率：（81.17±1.94）%、（83.50±2.07）%、（83.67±2.66）%和（80.83±3.49）%，P＞0.05，圖2A、2B］。細胞增殖實驗顯示，不同溫育密度得到的抗CD30 CAR-T細胞之間的增殖情況差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05，圖2C）；0.2×107組在第16天的抗CD30 CAR-T有效細胞數(shù)顯著低于0.5×107、1.0×107和2.0×107組（P＜0.05），但0.5×107、1.0×107、2.0×107組之間差異無統(tǒng)計學意義（圖2D）。

圖2 不同溫育密度對于抗CD30 CAR-T細胞轉(zhuǎn)導的影響Fig.2 Effects of different incubation densities on transduction of anti-CD30 CAR-T

本實驗還研究了不同溫育密度對于抗CD30 CAR-T細胞毒性作用的影響，結(jié)果顯示，0.5×107、1.0×107組抗CD30 CAR-T細胞的細胞毒性顯著高于2.0×107組［（46.00±1.41）%vs（45.00±1.41）%vs（35.50±2.12）%，P＜0.05，圖2E］。綜上所述，根據(jù)轉(zhuǎn)導效率、細胞存活率、抗CD30 CAR-T有效細胞數(shù)及體外殺傷效率等情況得出最佳溫育密度為0.5×107和1.0×107個/mL，從生產(chǎn)成本方面考慮，最終選擇MOI=1.0、溫育密度為1.0×107個/mL作為慢病毒轉(zhuǎn)導T細胞的關鍵參數(shù)。

2.3 不同活化時間對于抗CD30 CAR-T細胞轉(zhuǎn)導的影響

T細胞的激活水平與慢病毒轉(zhuǎn)導效率密切相關［21］。T細胞的激活狀態(tài)可以根據(jù)CD25和CD69的表達水平來衡量［22］，通過流式細胞術檢測不同轉(zhuǎn)導前活化時間對CD25和CD69的表達情況，結(jié)果顯示，在加入人T cell TransAct刺激后，T細胞被激活（圖3A）。T細胞的持續(xù)激活會影響其存活率，結(jié)果顯示，持續(xù)刺激72 h后T細胞的活率低于80%，顯著低于其他組［（97.00±0.00）%、（95.67±1.53）%、（93.00±3.46）%、（90.33±3.06）%、（85.67±5.51）%和（77.00±5.57）%，P＜0.01，圖3B］。轉(zhuǎn)導后通過流式細胞術檢測不同活化時間對抗CD30 CAR-T細胞轉(zhuǎn)導效率的影響，結(jié)果顯示，24、48和72 h組抗CD30 CAR-T細胞的轉(zhuǎn)導效率顯著高于0、8和16 h組［（35.00±5.15）%、（42.60±9.45）%、（41.20±8.64）%、（51.83±9.20）%、（56.50±7.87）%和（55.75±2.22）%，P＜0.05］，但24、48和72 h組間的轉(zhuǎn)導效率差異無統(tǒng)計學意義［（51.83±9.20）%、（56.50±7.87）%和（55.75±2.22）%，P＞ 0.05，圖3C］。

圖3 不同活化時間對抗CD30 CAR-T細胞轉(zhuǎn)導的影響Fig.3 Effects of different activation times on transduction of anti-CD30 CAR-T

本實驗進一步研究了不同活化時間對抗CD30 CAR-T細胞增殖情況的影響，結(jié)果顯示，在第11天時，48 h組的有效細胞數(shù)顯著高于其他組（P＜0.05）；但在第15天時差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05，圖3D）。因此，為了更加準確地驗證活化時間對CAR-T細胞的影響，本研究分別選用活化時間為24和48 h進行放大研究。

2.4 24和48 h活化時間對于抗CD30 CAR-T細胞轉(zhuǎn)導影響的放大研究

為進一步驗證上述研究結(jié)果，我們將轉(zhuǎn)導的T細胞起始量由0.5×107個提高到2.0×107個，培養(yǎng)容器從6孔板改為培養(yǎng)瓶，其他條件與上述一致。通過流式細胞術檢測24和48 h活化后CD25和CD69的表達情況，結(jié)果顯示，48 h組CD69陽性細胞比例及其平均熒光強度（mean fluorescence intensity，MFI）均低于24 h組，48 h組CD25陽性細胞比例略高于24 h，但CD25的MFI明顯升高，T細胞被激活（圖4A），此結(jié)果與2.3結(jié)果保持一致。有研究［23］顯示，T細胞大小也與其激活有關，因此本研究檢測了不同活化時間細胞大小的變化，結(jié)果顯示，隨著刺激時間的延長，T細胞逐漸變大，進一步說明T細胞被激活（圖4B）。轉(zhuǎn)導前細胞存活率檢測結(jié)果顯示，24和48 h組間的細胞存活率差異無統(tǒng)計學意義［（81.33±1.15）%vs（82.67±3.51）%，P＞ 0.05，圖4C］。轉(zhuǎn)導后通過流式細胞術檢測兩組轉(zhuǎn)導效率，結(jié)果顯示，24和48 h組間轉(zhuǎn)導效率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖4D）。細胞增殖實驗結(jié)果顯示，48 h組的增殖速率顯著高于24 h組（P＜0.01，圖4E）。綜上所述，根據(jù)轉(zhuǎn)導效率、細胞存活率及細胞增殖速率等情況，最終選擇MOI=1.0、溫育密度為1.0×107個/mL、轉(zhuǎn)導前活化48 h作為慢病毒轉(zhuǎn)導工藝的最佳條件。

圖4 活化時間為24和48 h之間的比較Fig.4 Comparison of activation time between 24 and 48 h

2.5 轉(zhuǎn)導體系高度對于抗CD30 CAR-T細胞轉(zhuǎn)導的影響

轉(zhuǎn)導體系高度為轉(zhuǎn)導體積/底面積。T細胞在轉(zhuǎn)導時迅速沉積在容器底部，導致轉(zhuǎn)導體系頂部溶液中的慢病毒很難與沉積下來的T細胞接觸，進而可能影響T細胞的轉(zhuǎn)導。為了驗證上述猜想，分別采用0.16和0.53 mm兩種轉(zhuǎn)導體系高度對T細胞的轉(zhuǎn)導進行研究。實驗結(jié)果顯示，0.16 mm組在第8天的轉(zhuǎn)導效率顯著高于0.53 mm組［（62.00±1.41）%vs（37.00±2.83）%，P＜0.01，圖5A］。細胞增殖實驗結(jié)果顯示，0.16 mm組抗CD30 CAR-T細胞的增殖倍數(shù)顯著高于0.53 mm組（P＜0.05，圖5B）。

圖5 不同轉(zhuǎn)導體系高度對于抗CD30 CAR-T細胞轉(zhuǎn)導的影響Fig.5 Effects of different height on transduction of anti-CD30 CAR-T

本研究還分析了不同轉(zhuǎn)導體系高度對抗CD30 CAR-T細胞毒作用的影響，結(jié)果顯示，在相同效靶比時，0.16和0.53 mm組對L428腫瘤細胞的殺傷作用差異無統(tǒng)計學意義［效靶比為25∶1時：（14.67±2.08）%vs（17.67±1.53）%，P＞ 0.05，圖5C］。綜上所述，根據(jù)轉(zhuǎn)導效率、增殖倍數(shù)、體外殺傷效率等情況，選擇MOI=1.0、溫育密度為1.0×107個/mL、轉(zhuǎn)導前活化48 h、轉(zhuǎn)導體系高度為0.16 mm作為最終轉(zhuǎn)導優(yōu)化條件。

3 討 論

CAR-T細胞療法是基于免疫細胞的療法之一［24］。由于T細胞具有細胞毒性、體外培養(yǎng)增殖良好、病毒載體易轉(zhuǎn)導等特點［25］，CAR-T細胞現(xiàn)在已經(jīng)成為常見且有效的用于癌癥治療的基因修飾細胞［26］。慢病毒可以高效地將基因整合到靜止期和增殖期的真核細胞的基因組中并穩(wěn)定表達［27］，臨床安全性也高于其他病毒［28］，由于上述原因，目前最成熟的CAR-T基因修飾方法是慢病毒轉(zhuǎn)導法［29］?？笴D30 CAR-T細胞的慢病毒轉(zhuǎn)導條件鮮見報道，因此本實驗通過對MOI、溫育密度、轉(zhuǎn)導前活化時間和轉(zhuǎn)導體系高度等轉(zhuǎn)導條件進行研究，優(yōu)化慢病毒轉(zhuǎn)導T細胞時的參數(shù)，以制備出轉(zhuǎn)導效率更高、功能更強的抗CD30 CAR-T細胞，為抗CD30 CAR-T細胞后續(xù)的臨床研究提供參 考。

本研究結(jié)果顯示，MOI等于1、溫育密度為1.0×107個/mL、轉(zhuǎn)導前活化48 h、轉(zhuǎn)導體系高度為0.16 mm時，轉(zhuǎn)導得到的抗CD30 CAR-T細胞的轉(zhuǎn)導效率更高，增殖效果更好，但對抗CD30 CAR-T細胞的殺傷功能無影響。原代T細胞取材于不同健康人群外周血，因此原代T細胞間可能存在個體差異。MOI轉(zhuǎn)導參數(shù)研究結(jié)果顯示，MOI大于1時，抗CD30 CAR-T細胞的轉(zhuǎn)導效率處于平臺期，可能其他靶點的慢病毒在進行CAR-T細胞轉(zhuǎn)導時也會出現(xiàn)該現(xiàn)象；轉(zhuǎn)導前活化時間決定了T細胞的狀態(tài)，可能會影響T細胞相關基因的表達水平，進而影響慢病毒的轉(zhuǎn)導效果和表觀遺傳修飾；T細胞的直徑只有8 ～ 10 μm，轉(zhuǎn)導體系過高導致上層慢病毒顆粒無法與T細胞接觸，進而影響轉(zhuǎn)導效率。本研究將轉(zhuǎn)導體系高度作為慢病毒靜止轉(zhuǎn)導的研究參數(shù)，同時也驗證了我們的猜想：轉(zhuǎn)導體系的高度趨近于T細胞的直徑時，可能會使慢病毒的轉(zhuǎn)導效率不斷提高。本研究對不同轉(zhuǎn)導條件下的抗CD30 CAR-T細胞的分析評價指標較少，可通過細胞表型、耗竭程度、表觀遺傳及細胞因子等［30-33］進行進一步研究，以提高抗CD30 CAR-T細胞的質(zhì)量。

綜上所述，本研究通過對MOI、溫育密度、轉(zhuǎn)導前活化時間和轉(zhuǎn)導體系高度等轉(zhuǎn)導參數(shù)的研究，最終獲得了最優(yōu)的轉(zhuǎn)導條件：MOI等于1、溫育密度為1.0×107個/mL、轉(zhuǎn)導前活化48 h、轉(zhuǎn)導體系高度為0.16 mm。這樣的轉(zhuǎn)導條件可以顯著提高抗CD30 CAR-T細胞的轉(zhuǎn)導效率，增強抗CD30 CAR-T細胞的增殖能力，且對抗CD30 CAR-T細胞的殺傷能力無顯著影響。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。