俞軍，胡陽生

1 安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院藥學部，合肥 230012；2 安徽省公共衛(wèi)生臨床中心

新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）是指新型冠狀病毒感染導致的肺炎，主要通過呼吸道黏膜形式傳播，可以導致發(fā)熱、呼吸困難、疼痛等癥狀［1］。目前，新型冠狀病毒已經(jīng)在全球范圍內(nèi)傳播且發(fā)展迅速，為做好COVID-19診療工作，中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會制定了《新型冠狀病毒感染診療方案》并更新至試行第十版，并提出針對不同病情嚴重程度的COVID-19患者給予中醫(yī)藥治療［2］。丹皮為毛茛科植物牡丹的干燥根皮，是安徽銅陵等地區(qū)產(chǎn)出的著名道地藥材，也是《新型冠狀病毒感染診療方案（試行第十版）》中藥方劑中的重要組成藥材，其作用為解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎，劑型包括片劑、注射劑、軟膏劑等，長期應用無明顯不良反應［3-5］。2023年1月—4月，本研究采用網(wǎng)絡藥理學方法探索丹皮的有效成分、核心靶點及作用機制，聯(lián)合分子對接技術對COVID-19的藥物靶點3CL蛋白酶和血管緊張素轉化酶2（ACE2）進行探究，為COVID-19的臨床用藥和以丹皮有效成分為先導化合物的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 丹皮有效成分及作用靶點篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺（TCMSP，https：//tcmsp-e.com/index.php）檢索關鍵詞“丹皮”，以口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18為篩選條件［6］，獲取丹皮的有效成分及其相關作用靶點信息，應用Uniprot數(shù)據(jù)庫對靶點名稱進行標準化及縮寫。

1.2 COVID-19相關靶點篩選 通過GeneCards?（https：//www.genecards.org/）和OMIM?（https：//omim.org/）數(shù)據(jù)庫，檢索關鍵詞“COVID-19”，獲得疾病相關靶點。

1.3 丹皮治療COVID-19的潛在靶點篩選 將“1.1”獲取的丹皮有效成分作用靶點和“1.2”獲取的COVID-19相關靶點繪制Venn圖，獲得丹皮治療COVID-19的潛在靶點。

1.4 丹皮治療COVID-19的核心靶點篩選 將“1.3”得到的丹皮治療COVID-19的潛在靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫（https：//cn.string-db.org/），選擇“Multiple protein”和“Homo sapiens”，獲取靶點蛋白在生物系統(tǒng)中的相互作用關系，繪制蛋白互作網(wǎng)絡（PPI）圖。運用R語言對PPI結果進行計數(shù)，獲得核心蛋白的相關信息。

1.5 丹皮治療COVID-19的主要活性成分篩選采用Cytoscape（v.3.7.1）軟件繪制COVID-19-丹皮—有效成分—靶點網(wǎng)絡圖。該網(wǎng)絡圖表示COVID-19與丹皮及其有效成分和作用靶點之間的相互作用，圖中同種顏色圖形大小代表degree值的大小，其值越大表明丹皮對于COVID-19的治療越重要，篩選丹皮治療COVID-19的主要活性成分。

1.6 丹皮治療COVID-19潛在靶點的相關功能及通路富集分析 通過R語言及“RSQLite”“BiocManager”“Colorspace”“Stringi”“DOSE”“ClusterProfiler”“Pathview”等軟件包，將丹皮治療COVID-19的潛在靶點名稱轉換為基因ID，分別進行GO功能富集分析（主要進行分子功能富集分析）和KEGG通路富集分析，繪制富集分析圖，并展示排名前15位的富集分析結果。

1.7 丹皮治療COVID-19的主要活性成分與COVID-19藥物治療靶點的結合能力觀察 采用分子—蛋白對接技術。通過PubChem數(shù)據(jù)庫收集COVID-19-丹皮—有效成分—靶點網(wǎng)絡圖中丹皮的主要活性成分及臨床常用于治療COVID-19的藥物奈瑪特韋（Nirmatrelvir）、瑞德西韋（Remdesivir）的3D結構圖，PDB數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）下載COVID-19的藥物治療靶點3CL蛋白酶（PDBID：7E18）和ACE2（PDBID：7EFP）的蛋白結構。采用Discovery Studio2019軟件進行分子配體處理，以及蛋白去除水分子、加氫、刪除配體等處理，通過LibDock進行分子—蛋白對接，計算結合能，結合能數(shù)值越低表示結合能力越穩(wěn)定。

2 結果

2.1 丹皮治療COVID-19的有效成分及潛在靶點篩選結果 初步獲得丹皮有效成分6個，即槲皮素、丁子香萜、谷甾醇、山奈酚、（+）-兒茶素和單體5-｛［5-（4-甲氧基苯基）-2-呋喃］亞甲基｝巴比妥酸（簡稱巴比妥酸）；初步獲得丹皮作用靶點237個，去除重復靶點后共篩選出相關靶點150個，見表1。通過GeneCards?和OMIM?數(shù)據(jù)庫獲得COVID-19相關靶點731個，除去重復靶點后共得到716個。通過Venny圖獲得丹皮治療COVID-19的潛在靶點36個，見OSID碼圖1。

表1 丹皮有效成分及靶點篩選結果

2.2 丹皮治療COVID-19的核心靶點篩選結果排名前30位的核心靶點主要包括血管內(nèi)皮細胞生長因子受體（VEGFR）、表皮生長因子受體（EGFR）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（NOS3），炎癥相關蛋白主要包括白細胞介素（IL）-6、IL-1B、IL-10、IL-2，趨化因子配體2（CCL2）、CXC趨化因子配體10（CXCL10），絲裂原激活蛋白激酶8（MAPK8）、信號轉導與轉錄激活因子1（STAT1）、C反應蛋白（CRP）、CD40配體（CD40LG）、聚-ADP-核糖聚合酶1（PARP1）、前列腺素G/H合酶2（PTGS2）、纖溶酶原激活物抑制劑1（SERPINE1）、中性粒細胞胞質(zhì)溶膠因子1（NCF1）；凋亡相關蛋白如基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）、胱天蛋白酶8（CASP8）、熱休克蛋白β1（HSPB1）、芳香烴受體（AHR）、血紅素加氧酶（HMOX1），脂類代謝相關蛋白如過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG）、糖原合酶激酶3β（GSK3B）、超氧化物歧化酶1（SOD1），其他還有雄激素受體（AR）、雌激素受體1（ESR1）、選擇素E（SELE）。丹皮治療COVID-19潛在靶點的PPI圖見OSID碼圖2。

2.3 丹皮治療COVID-19的主要活性成分篩選結果 丹皮治療COVID-19的主要活性成分排名先后順序為槲皮素、山奈酚、巴比妥酸和（+）-兒茶素，排名前10位的靶點分別為PPARG、PTGS2、ESR1、受體蛋白酪氨酸激酶（INSR）、AHR、SELE、細胞色素p450 3A4酶（CYP3A4）、HMOX1、STAT1和B淋巴細胞瘤2（BCL2）。COVID-19-丹皮—有效成分—靶點網(wǎng)絡圖見OSID碼圖3。

2.4 丹皮治療COVID-19潛在靶點的GO和KEGG富集分析結果 共獲得61條GO功能富集分析結果和109條KEGG通路富集分析結果，見OSID碼圖4。GO功能富集結果顯示，分子功能主要與細胞因子受體結合活性、DNA結合轉錄因子結合活性、信號受體激活因子活性、轉錄輔助激活因子、核受體活性、生長因子受體結合、激酶調(diào)控活性、蛋白磷酸化結合等相關。KEGG通路富集分析結果顯示，丹皮治療COVID-19主要與脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、IL-17信號通路、缺氧誘導因子1（HIF-1）信號通路、腫瘤壞死因子（TNF）家族信號通路、C-型凝集素受體信號通路等相關。

2.5 丹皮治療COVID-19的主要活性成分與COVID-19藥物治療靶點的結合能力 山奈酚與COVID-19藥物治療靶點3CL蛋白酶、ACE2分子對接時均未發(fā)現(xiàn)對接位點，因此沒有結合能。與3CL蛋白酶結合穩(wěn)定的先后順序為巴比妥酸、奈瑪特韋、槲皮素和（+）-兒茶素，其結合能分別為-185.854 1、-163.508 3、-109.417 0、-69.357 3 kJ/mol，其中巴比妥酸較奈瑪特韋具有更低的結合能。與ACE2結合穩(wěn)定的先后順序為槲皮素、瑞德西韋、（+）-兒茶素和巴比妥酸，其結合能分別為-201.222 1、-168.723 3、-110.665 9、-107.239 8 kJ/mol，其中槲皮素較瑞德西韋具有更低的結合能。分子—蛋白對接圖見OSID碼圖5。

3 討論

本研究通過網(wǎng)絡藥理學的方法共獲得丹皮有效成分6個，包括槲皮素、丁子香萜、谷甾醇、山奈酚、（+）-兒茶素、巴比妥酸；通過分子對接的方法證實，相比于奈瑪特韋和瑞德西韋，槲皮素與3CL蛋白酶、ACE2具有較低的結合能，對接更穩(wěn)定，這與已有的研究結果相似［7］。槲皮素具有廣泛的抗病毒和抗炎特性，可干擾病原體發(fā)揮毒性的多個步驟，如病毒進入、病毒復制、蛋白質(zhì)組裝等，當與維生素C聯(lián)合用藥時，可用于COVID-19患者呼吸道感染的預防和早期治療［8］。此外，抑制IL-17及其信號通路是槲皮素作用于COVID-19的機制之一，并在臨床取得較好的治療效果［9］。相比于瑞德西韋或法比拉韋單獨用藥，當槲皮素聯(lián)合用藥時可縮短COVID-19患者的住院時間，降低血清標志物堿性磷酸酶、CRP、乳酸脫氫酶的水平，升高血紅蛋白水平和呼吸頻率［10］。但與其他多數(shù)中藥來源的有效成分一樣，槲皮素存在生物利用度相對較低等問題。一種磷脂遞送形式的槲皮素（槲皮素植物體?）應用于12例健康志愿者的臨床試驗結果發(fā)現(xiàn)，槲皮素的生物利用度被提高約20倍，且沒有明顯的不良反應，為以槲皮素及其先導化合物的臨床治療藥物的開發(fā)提供了重要參考［11-12］。

MISHRA等［13］收集了75種美國FDA批準的潛在抗COVID-19藥物，與3CL蛋白酶、ACE2等藥物治療靶點進行分子對接和分子動力學模型篩選，最終顯示（+）-兒茶素對多種靶蛋白具有更好的結合力和良好的分子相互作用，可作為潛在的抗COVID-19的多靶點藥物［14］。此外，兒茶素衍生物也具有抗COVID-19的潛力。ARIF等［15］以（+）-兒茶素作為先導化合物，通過乙酸酯化等合成獲得3種兒茶素衍生物，與奈非那韋相比，這3種兒茶素衍生物與3CL蛋白酶均具有較穩(wěn)定的結合能。有研究進一步對（+）-兒茶素的化學結構引入不同基團，如酯基、乙?；袜彵饺踊龋Y果顯示均可以提高其抑制COVID-19的活性［16］。

研究發(fā)現(xiàn)，COVID-19患者肺部顯示出細胞膜破壞相關的嚴重內(nèi)皮損傷等血管特征。ACKERMANN等［17］對7例死亡的COVID-19患者肺部組織進行基因表達檢測，結果發(fā)現(xiàn)VEGFR、HSPB1、IL-6、CXCL10、TNF超家族成員1A（TNFR1）/12A、SERPINE1、HMOX1等基因表達均升高，而上述基因均為丹皮治療COVID-19的重要靶點，可作為后續(xù)的研究基礎。此外，VEGFR也是COVID-19恢復期治療COVID-19合并肺纖維化的重要靶點之一［18］。一項納入6例重癥COVID-19患者的研究顯示，在患者血液和肺氣管吸入物中分離的中性粒細胞可形成炎癥小體，隨后小體激活釋放的自分泌IL-1B前饋循環(huán)可導致成人呼吸窘迫綜合征、細胞因子風暴和微血管血栓的發(fā)展，并最終引起多器官衰竭［19］。COVID-19感染伴動脈粥樣硬化的特征是脂質(zhì)及其相關蛋白的滲透、沉積和氧化，內(nèi)皮損傷、激活并促進炎癥的維持［20］。一項美國紐約多家醫(yī)院納入的5 700例COVID-19患者的隊列研究發(fā)現(xiàn)，有心血管基礎疾病的患者比沒有基礎疾病的患者病死率明顯升高［21］。槲皮素可以改善動脈粥樣硬化，減少炎癥淋巴細胞和巨噬細胞的動脈浸潤［22］。（+）-兒茶素可通過降低巨噬細胞、內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞中活性氧的產(chǎn)生，降低血漿中三酰甘油的水平及促進動脈粥樣硬化基因IL-1B、IL-6、MMPs等表達，最終發(fā)揮治療脂質(zhì)升高和動脈粥樣硬化的作用［23］。

綜上所述， 丹皮通過有效成分槲皮素、巴比妥酸、（+）-兒茶素、山奈酚作用于PPARG、PTGS2、ESR1等核心靶點對COVID-19發(fā)揮治療作用，其機制主要與脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、IL-17、TNF等通路有關。本研究探討了丹皮及其有效成分對COVID-19的作用靶點及信號通路，為以丹皮為組成成分的中藥方劑及未來以丹皮有效成分作為先導化合物治療COVID-19的藥物研發(fā)等提供了研究基礎。