龍麗君，劉思思，曾慧杰，李昌珠，張 崗，馬英姿，李依民*

灰氈毛忍冬家族基因克隆及表達分析

龍麗君1, 2，劉思思2，曾慧杰2，李昌珠2，張 崗3, 4，馬英姿1*，李依民3, 4*

1. 中南林業(yè)科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410004 2. 湖南省林業(yè)科學(xué)院省部共建木本油料資源利用國家重點實驗室，湖南 長沙 410004 3. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)陜西省中醫(yī)藥管理局“秦藥”研發(fā)重點實驗室，陜西 西安 712046 4. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)省部共建特色秦藥資源研究開發(fā)國家重點實驗室（培育），陜西 咸陽 712083

克隆獲得灰氈毛忍冬家族基因（），并對其進行生物信息學(xué)、時空表達特異性和蛋白原核表達等特性分析。根據(jù)灰氈毛忍冬轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)設(shè)計特異性引物，通過PCR技術(shù)克隆基因全長；運用生物信息學(xué)方法分析其編碼蛋白的序列特征；利用實時熒光定量技術(shù)（reverse-transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）分別檢測該基因在灰氈毛忍冬2個品種“龍花”和“金翠蕾”葉片、花早期和晚期中的表達水平；最后構(gòu)建pTOPO-D1-LmSVP原核表達載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）中進行蛋白表達?；蛉L1472 bp，開放閱讀框（open reading frame，ORF）長720 bp，編碼239個氨基酸，蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為26 712.63。進化樹分析表明，LmSVP蛋白與中華獼猴桃、小?？Х鹊腟VP蛋白親緣關(guān)系最近。qRT-PCR結(jié)果顯示，基因在“龍花”和“金翠蕾”品種中的表達均存在組織特異性表達，其在葉中的表達量顯著高于花中；而在花發(fā)育不同時期，基因表達量沒有明顯差異。在大腸桿菌中成功表達出蛋白，蛋白表達結(jié)果顯示其相對分子質(zhì)量約為26 710，與預(yù)測相符合。通過對基因的全長克隆、序列分析和表達特性鑒定，為進一步研究該基因在調(diào)控花蕾型灰氈毛忍冬蕾期長及花冠不開放的功能提供實驗基礎(chǔ)。

灰氈毛忍冬；；；基因克??；表達分析；原核表達

灰氈毛忍冬Hand.- Mazz.為忍冬科（Caprifoliaceae）忍冬屬L.多年生常綠藤本或灌木，是中國傳統(tǒng)中藥“山銀花”的主要基原植物之一，其藥用部位為干燥花蕾及初開的花，具有很高的藥用價值和經(jīng)濟價值。其味甘、性寒，具有解熱抗毒、疏風(fēng)散熱之功效，多用于治療熱毒血病、風(fēng)熱感冒、溫病發(fā)熱等主要病癥[1]?；覛置潭饕行С煞譃榫G原酸類化合物，且總綠原酸含量以花蕾期最高，其量隨著花冠展開而降低[2-3]。普通灰氈毛忍冬花冠展開、蕾期短，不利于藥材采摘，很大程度上降低了其產(chǎn)量和品質(zhì)[4]；但近年來選育出的花蕾型灰氈毛忍冬新品種“金翠蕾”“銀翠蕾”和“龍花”等，其花期花冠一直不展開，花蕾整齊均呈棒狀，花期長達15～25 d，其優(yōu)良性狀更有利于實際生產(chǎn)[5-6]。為更好地指導(dǎo)實際生產(chǎn)，花蕾型灰氈毛忍冬蕾期長、花冠不展開現(xiàn)象背后的原因亟待研究。

基因在植物花器官發(fā)育、調(diào)控開花時間等方面有著十分重要的作用[7]。屬于基因家族的（）基因為開花抑制基因，最早從擬南芥的早花突變體中鑒別出來[8]，在大多數(shù)雙子葉植物中起到調(diào)控開花時間和花序發(fā)育的作用[9]。同源基因廣泛存在于各種植物中，但其所具備的功能可能因物種而異。目前，研究人員已從蝴蝶蘭H. G. Reichenbach.[10]、梅花(L.) Link.[11]、中國水仙subsp.(M. Roem.) Masamura & Yanagih.[12]以及細葉百合DC[13]等多種植物中克隆得到同源基因，并證實其在擬南芥中過表達能延遲開花以及參與花序形態(tài)結(jié)構(gòu)和花器官發(fā)育等生命活動的調(diào)控[8]，但尚未見基因克隆的相關(guān)報道，對其在灰氈毛忍冬開花誘導(dǎo)等花器官發(fā)育過程中的功能也尚不清楚。

鑒于基因在植物開花及花器官發(fā)育過程中的重要作用，本研究利用前期獲得的灰氈毛忍冬轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，篩選出基因，根據(jù)其序列設(shè)計特異性引物，利用實時熒光定量技術(shù)（reverse-transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）技術(shù)，克隆基因全長，對其進行生物信息學(xué)分析。并分析了該基因在灰氈毛忍冬“龍花”和“金翠蕾”品種不同組織、花不同發(fā)育時期的相對表達量，構(gòu)建原核表達載體并轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）進行表達，初步了解了該基因的相關(guān)特性。以期為研究基因在花蕾型灰氈毛忍冬花器官發(fā)育中的功能提供理論依據(jù)，為進一步研究花蕾型灰氈毛忍冬蕾期長、花冠不展開的分子機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與試劑

1.1 材料

所用植物材料采自湖南省林業(yè)科學(xué)院試驗林場，經(jīng)湖南省林業(yè)科學(xué)院王曉明研究員鑒定為灰氈毛忍冬Hand. - Mazz.的“龍花”和“金翠蕾”品種。隨機選擇3株生長健壯、無病蟲害的植株，采集灰氈毛忍冬“龍花”和“金翠蕾”的早晚期花蕾和幼嫩葉片，液氮速凍，保存于?80 ℃超低溫冰箱備用。

1.2 主要試劑

EASYspin Plus多糖多酚復(fù)雜植物RNA快速提取試劑盒、瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒、Zero Background pTOPO-TA/Blunt Simple Cloning Kit、pTOPO-D1 Directional Expression Kit、DL2000 Plus DNA Marker、6×DNA Loading Buffer等均購自北京艾德萊生物科技有限公司，HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）、Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase等均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，大腸桿菌菌株DH5α感受態(tài)細胞、BL21（DE3）感受態(tài)細胞、蛋白Marker等均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，異丙基- β--硫代半乳糖苷（IPTG）、5×蛋白上樣緩沖液、新型考馬斯亮藍快速染色液、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒等均購自北京酷萊搏科技有限公司。引物由湖南擎科生物技術(shù)有限公司合成，序列見表1。

表1 引物序列

Table 1 Primer sequences

引物名稱序列（5’-3’）產(chǎn)物長度/bp引物用途 LmSVP-FGCGGTACGTGATGCTCTTGATACA1472cDNA全長克隆 LmSVP-RATGGCTTACACTCGTTAGAGAAGGC LmSVP-qFCCTTCCCTCACCTCACCTTACCT127qRT-PCR LmSVP-qRTGTCACTTGCCTTGCCGTTATGT 18S-FCTTCGGGATCGGAGTAATGA118內(nèi)參基因 18S-RGCGGAGTCCTAGAAGCAACA LmSVP-yFCACCATGGCTAGAGAGAAGATAAAG720原核表達 LmSVP-yRCTAAAAGGGAAGCGCTAACTT

2 方法

2.1 總RNA的提取與cDNA第1條鏈的合成

參照EASYspin Plus多糖多酚復(fù)雜植物RNA快速提取試劑盒操作說明制備樣品的總RNA，1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，Nanodrop 2000檢測RNA濃度和質(zhì)量。以提取的RNA樣品為模板，按照HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）操作說明，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 LmSVP基因cDNA全長克隆

根據(jù)前期獲得的灰氈毛忍冬轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（PRJNA 667821）相關(guān)信息[14-15]，選取具有完整開放閱讀框（open reading frame，ORF）的序列，應(yīng)用Primer Premier 6設(shè)計基因的特異性引物L(fēng)mSVP-F和LmSVP-R，引物序列信息見表1。將“2.1”項得到的cDNA原液稀釋20倍作為模板進行PCR擴增，反應(yīng)體系（25 μL）：2×Phanta Max Buffer 12.5 μL，dNTP Mix 0.5 μL，SVP-F和SVP-R各1 μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 0.5 μL，cDNA模板1.5 μL，ddH2O 8.0 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃徹底延伸5 min；12 ℃持續(xù)。反應(yīng)結(jié)束后，PCR擴增產(chǎn)物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，并按瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物?；厥债a(chǎn)物與pTOPO載體連接并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，涂布于含有氨芐青霉素（Amp）的LB固體培養(yǎng)基平板上，倒置培養(yǎng)過夜。挑取單菌落，振蕩培養(yǎng)4～5 h，進行PCR鑒定選出陽性克隆，送至長沙擎科生物公司測序。

2.3 LmSVP基因生物信息學(xué)分析

基于基因的測序結(jié)果，應(yīng)用NCBI的ORF finder工具查找ORF以及推導(dǎo)編碼的氨基酸序列。通過Prot Param在線工具（http://web.expasy.org/ protparam/）分析LmSVP蛋白的理化性質(zhì)；利用Prot Scale（https://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/ protscale. pl/）軟件預(yù)測LmSVP蛋白的親疏水性；使用TMHMM（https://services.healthtech. dtu.dk/service. php?TMH MM-2.0）分析LmSVP蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域；應(yīng)用SignalP 4.1（https:// services.health tech.dtu.dk/service.php? SignalP-4.1）預(yù)測LmSVP蛋白的信號肽；采用WOLF PSO RT（https://wolfpsort.hgc.jp/）在線預(yù)測LmSVP蛋白亞細胞定位情況；利用Netphos 3.1 server（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php? NetPhos-3.1）對LmSVP蛋白的磷酸位點進行預(yù)測分析；使用NCBI網(wǎng)站CD-Search（https://www. ncbi.nlm. nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）在線分析蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域；通過SOPMA（http:// npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）和SWISS-MODE L（https:// swissmodel. expasy.org/）預(yù)測LmSVP蛋白的二、三級結(jié)構(gòu)；運用DNA STAR 7.1中的MegAlign 程序進行氨基酸序列對比分析；借助MEGA-X中的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2.4 LmSVP基因的表達分析

根據(jù)基因cDNA全長序列，設(shè)計qRT-PCR的特異性引物L(fēng)mSVP-qF和LmSVP-qR（表1），以18 S rRNA作為內(nèi)參基因。提取灰氈毛忍冬“龍花”和“金翠蕾”品種葉片、早期花蕾（花蕾平均長14.49 mm）以及晚期花蕾（花蕾平均長41.85 mm）的總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進行實時熒光定量分析。反應(yīng)體系：2×RealStar Green Fast Mixture PCR 5 μL，F(xiàn)orward primer 0.4 μL，Reverse primer 0.4 μL，cDNA 1 μL，H2O 3.2 μL。擴增程序：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后進行熔解曲線分析，熔解曲線為95 ℃ 5 s，56 ℃ 5 s，95 ℃持續(xù)，每個樣品重復(fù)3次，用2?ΔΔCt法計算基因的相對表達量。利用SPSS26.0進行數(shù)據(jù)的差異顯著分析。

2.5 LmSVP基因原核表達載體的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達

根據(jù)測序所得CDS序列，設(shè)計原核表達引物SVP-yF和SVP-yR（表1），以稀釋20倍的cDNA為模板，經(jīng)PCR擴增、1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，對PCR擴增產(chǎn)物進行切膠回收，回收產(chǎn)物按照pTOPO-D1一步法定向原核表達試劑盒操作說明于37 ℃連接5 min，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，涂布于含有Amp的LB固體培養(yǎng)基上，次日挑選單菌落進行PCR鑒定、測序及提取重組質(zhì)粒。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）中，挑取單克隆進行菌液驗證，將驗證正確的原核表達工程菌液按照1∶100比例在50 mL LB液體培養(yǎng)基（含Amp）中培養(yǎng)，培養(yǎng)至菌液600為0.6時向培養(yǎng)基中加入終濃度為0.6、0.8、1.0 mmol/L的異丙基-β--硫代半乳糖苷（IPTG）進行誘導(dǎo)，37 ℃培養(yǎng)4 h。誘導(dǎo)結(jié)束后，5000 r/min離心15 min，去上清，加入1×PBS（pH 7.5）緩沖液重懸菌體，冰浴條件下超聲破碎20 min，徹底破碎后，12 000 r/min離心20 min。分別取上清、沉淀加入蛋白上樣緩沖液，沸水煮沸10 min，經(jīng)12.0% SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白表達情況。

3 結(jié)果與分析

3.1 LmSVP基因全長cDNA克隆

從灰氈毛忍冬轉(zhuǎn)錄組中獲得該基因的全長序列，以灰氈毛忍冬cDNA作為模板進行PCR擴增。以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，結(jié)果顯示在靠近Marker的1500 bp附近出現(xiàn)了一條清晰明顯的條帶，與預(yù)期大小相符，見圖1。陽性克隆經(jīng)測序比對，與轉(zhuǎn)錄組中序列一致，測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上利用Blast功能進行比對，顯示序列為STMADS11亞家族成員基因，將該基因命名為，基因登錄號為OQ507619。通過ORF- Finder分析，基因全長1472 bp，包含1個720 bp的ORF區(qū)，編碼239個氨基酸，其中5'UTR為382 bp，3'UTR為370 bp。

3.2 LmSVP基因生物信息學(xué)分析

3.2.1基因編碼氨基酸理化性質(zhì)分析 通過ExPASy ProtParam在線軟件對基因編碼蛋白進行預(yù)測分析，推測其分子式為C1146H1902N326O372S16，相對分子質(zhì)量為26 712.63，等電點為6.16，不穩(wěn)定系數(shù)為45.60＞40，屬于不穩(wěn)定蛋白，帶正電殘基（Arg＋Lys）為33，帶負電殘基（Asp＋Glu）為35，脂肪系數(shù)83.26，親水性平均系數(shù)為?0.501，應(yīng)用ProtScale在線分析其蛋白親/疏水性，結(jié)果表明LmSVP蛋白親/疏水氨基酸分布整體上是負值大于正值，親水區(qū)域所占比例大于疏水區(qū)域，推測其為親水性蛋白。利用WOLF PSORT在線預(yù)測亞細胞定位情況，結(jié)果表明LmSVP蛋白定位于細胞核（nucleus）中。運用在線軟件TMHMM2.0分析，發(fā)現(xiàn)編碼的氨基酸1～239全部在膜外，不具有跨膜區(qū)域。SignalP 4.1軟件預(yù)測LmSVP蛋白不具有信號肽序列，屬于非分泌型蛋白。

M-Marker 1, 2-LmSVP全長擴增片段

通過Netphos 3.1 server軟件在線預(yù)測蛋白的磷酸化位點，結(jié)果顯示編碼的氨基酸序列可能發(fā)生磷酸化的位點有25個。其中包括絲氨酸（Ser）位點14個，蘇氨酸（Thr）位點10個，酪氨酸（Tyr）位點1個。

3.2.2 LmSVP蛋白結(jié)構(gòu)域、二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 利用NCBI網(wǎng)站CD-Search在線分析LmSVP蛋白保守結(jié)構(gòu)域，LmSVP第2～75個氨基酸為高度保守的MADS結(jié)構(gòu)域，第95～170個氨基酸為中度保守的K-box結(jié)構(gòu)域，具有基因家族共有的典型結(jié)構(gòu)域，見圖2。

通過SOPMA在線軟件預(yù)測LmSVP蛋白的二級結(jié)構(gòu)（圖3-A），結(jié)果顯示LmSVP蛋白的構(gòu)成成分及比例分別為：α螺旋（alpha helix）占59%，無規(guī)則卷曲（random coil）占28.03%，延伸鏈（extended strand）占10.46%，β轉(zhuǎn)角（beta turn）占2.51%，α-螺旋和無規(guī)則卷曲為該蛋白二級結(jié)構(gòu)的主要組成元件。

圖2 LmSVP蛋白結(jié)構(gòu)域

藍色-α螺旋 紅色-延伸鏈 紫色-無規(guī)卷曲 綠色-β轉(zhuǎn)角

使用SWISS-MODEL在線軟件對LmSVP進行同源建模，構(gòu)建其三維結(jié)構(gòu)模型（圖3-B）。選擇7nb0.1.A作為同源蛋白模板構(gòu)建LmSVP模型，序列相似性為73.58%，整體評分為0.72。

3.2.3氨基酸序列同源性比對和系統(tǒng)進化分析 運用DNASTAR 7.1中的MegAlign程序?qū)蚓幋a蛋白與5種植物的LmSVP蛋白進行多序列比對分析（圖4）。結(jié)果表明，LmSVP與可可L.（XP_007018219.2）、榴蓮Murr.（XP_022768443.1）、酸棗Mill. var.(Bunge) Hu ex H. F. Chow.（XP_015885971.1）、葡萄L.（XP_002285687.1）、小?？Х萀.（XP_027090010.1）SVP蛋白的一致性分別為70.29%、67.36%、66.11%、66.53%和69.26%。LmSVP與可可（XP_007018219.2）的SVP蛋白序列相似性最高為70.29%。

為了進一步了解LmSVP蛋白的系統(tǒng)進化情況，從NCBI數(shù)據(jù)庫中挑選16條與LmSVP氨基酸序列具有一定同源性的MADS-box家族的氨基酸序列，運用MEGA-X 構(gòu)建LmSVP蛋白的NJ進化樹。結(jié)果顯示（圖5），LmSVP蛋白與中華獼猴桃Planch.和小粒咖啡L.的蛋白聚類在同一分支上，表明LmSVP蛋白可能與雙子葉植物獼猴桃科、茜草科SVP蛋白在功能上更為接近。

圖4 LmSVP與其他植物SVP蛋白的多序列比對分析

圖5 LmSVP蛋白的NJ系統(tǒng)進化樹

3.3 LmSVP基因的組織特異性表達

以灰氈毛忍冬18S rRNA為內(nèi)參基因，利用qRT-PCR技術(shù)對灰氈毛忍冬“龍花”和“金翠蕾”品種不同組織部位（花、葉）及不同花發(fā)育時期基因的表達情況進行分析，見圖6。結(jié)果顯示，無論是在葉片中還是花蕾早期和晚期，“金翠蕾”品種中基因表達量整體高于“龍花”品種；基因在灰氈毛忍冬2個品種“龍花”和“金翠蕾”不同組織部位的表達存在極顯著差異（＜0.01），葉片中表達量顯著高于花中的表達量；基因在灰氈毛忍冬不同花期的表達量差異不明顯，變化較平緩。

3.4 LmSVP重組蛋白的表達

將測序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒pTOPO-D1- LmSVP及pTOPO-D1空載轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞，挑取單克隆于37 ℃培養(yǎng)，當(dāng)菌液的600值達到0.6左右時加入終濃度分別為0.6、0.8、1.0 mmol/L的IPTG進行誘導(dǎo)，37 ℃培養(yǎng)4 h，菌液超聲波破碎后分別取上清、沉淀進行SDS-PAGE電泳檢測。結(jié)果（圖7）顯示，pTOPO- D1空載體經(jīng)誘導(dǎo)后無特異性條帶產(chǎn)生，而重組質(zhì)粒pTOPO-D1-LmSVP經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后在沉淀中產(chǎn)生一條約26 710的特異性條帶，與LmSVP預(yù)測蛋白相對分子質(zhì)量（26 710）一致，說明LmSVP重組蛋白在大腸桿菌中成功表達。菌液上清中無特異性條帶產(chǎn)生，說明表達的LmSVP以包涵體的形式存在，其原因可能是由于外源基因的高效表達，導(dǎo)致新生肽鏈的合成速度超過了正確折疊的速度，從而形成非結(jié)晶、無定形的蛋白質(zhì)聚集體。

圖6 LmSVP基因在灰氈毛忍冬“龍花”和“金翠蕾”品種不同發(fā)育期中表達模式

M-Marker 1-空載體pTOPO-D1 2-經(jīng)0.6 mmol·L?1 IPTG誘導(dǎo)的上清 3-經(jīng)0.6 mmol·L?1 IPTG誘導(dǎo)的沉淀 4-經(jīng)0.8 mmol·L?1 IPTG誘導(dǎo)的上清 5-經(jīng)0.8 mmol·L?1 IPTG誘導(dǎo)的沉淀 6-經(jīng)1.0 mmol·L?1 IPTG誘導(dǎo)的上清 7-經(jīng)1.0 mmol·L?1 IPTG誘導(dǎo)的沉淀

4 討論

轉(zhuǎn)錄因子在植物花器官發(fā)育過程中發(fā)揮著極其重要的作用，其在不同植物中所具備的功能存在較大差異[16]，基因作為基因家族的重要成員，在許多植物中均被證實能夠參與調(diào)控植物開花、花器官發(fā)育及休眠等生物過程。近年來，科研人員針對基因?qū)χ参锘òl(fā)育的調(diào)控作用進行了廣泛研究，基因過表達會阻礙下游開花基因（）、（）、（）等的表達，從而延遲植物開花[17]，例如百合過量表達至擬南芥后，延遲了植株開花[18]。目前已從臘梅(L.) Link[19]、日本矮牽牛(L.) Choisy.[20]、德國鳶尾L.[21]、棉花L[22]和薔薇Thunb.[23]等植物中分離得到同源基因，基因參與許多觀賞植物的成花機理研究已被報道，而有關(guān)基因是否參與調(diào)控灰氈毛忍冬花發(fā)育進程的研究尚未見報道。

本研究通過對花蕾型灰氈毛忍冬“龍花”基因家族基因進行研究，成功克隆獲得灰氈毛忍冬基因全長, 并命名為，該基因全長1472 bp，具有完整的ORF 720 bp，氨基酸239個，預(yù)測其為親水性蛋白，亞細胞定位于細胞核中。結(jié)構(gòu)域預(yù)測該蛋白具有高度保守的MADS結(jié)構(gòu)域和中度保守的K-box結(jié)構(gòu)域，與其他植物基因編碼的保守結(jié)構(gòu)域相同[24-26]，屬于基因家族。系統(tǒng)進化樹分析表明，LmSVP蛋白與中華獼猴桃Planch.、小?？Х萀. SVP蛋白聚為一支，說明三者親緣關(guān)系較近。

不同植物中基因調(diào)控植物成花的功能不同，一般在花發(fā)育初期發(fā)揮作用，從而決定花分生組織的特異性[27]。組織特異性分析顯示，基因在芍藥Pall.不同組織器官中均有表達，但表達量有差異，在根中高表達，特別是在須根中；在花瓣中痕量表達[28]。獼猴桃中同源基因僅在營養(yǎng)器官中大量表達，尤其是在葉、莖尖和腋芽中，在花朵中不表達[29]。本研究中基因在2品種灰氈毛忍冬葉和花中的表達量存在顯著差異，其中在葉中的表達量最高，這與前人的研究結(jié)果類似。對灰氈毛忍冬花發(fā)育不同時期的表達分析結(jié)果顯示，在“龍花”和“金翠蕾”這2種花蕾型灰氈毛忍冬中，基因在花早期和花晚期的表達量無明顯差異。此處由于材料限制，只針對基因在兩種花蕾型灰氈毛忍冬中的表達情況進行研究，未來應(yīng)收集更多植物材料進行研究探討。

迄今，尚無報道LmSVP重組蛋白的原核表達體系，為更進一步研究基因在灰氈毛忍冬花器官發(fā)育中的功能，本研究成功構(gòu)建了pTOPO-D1- LmSVP載體，并且在大腸桿菌BL21（DE3）中進行表達，成功獲得分子量約為26 710的重組LmSVP蛋白。但是由于原核表達系統(tǒng)高效表達時，表達的重組蛋白常常出現(xiàn)不能自發(fā)折疊這一現(xiàn)象，二硫鍵不能正確配對，蛋白間過多的非特異性結(jié)合，無法達到足夠的溶解性，即以包涵體的形式存在[30]。為了使重組蛋白具有生物活性，需對包涵體進行復(fù)性處理[31]。在本實驗條件下，LmSVP重組蛋白以包涵體的形式存在。后續(xù)將采取復(fù)性等方式，以獲得有生物學(xué)活性的LmSVP重組蛋白，從而對LmSVP重組蛋白的功能進行深入研究。本研究為進一步通過轉(zhuǎn)基因驗證基因的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)，為從分子水平探索花蕾型灰氈毛忍冬蕾期長、花冠不展開等優(yōu)良性狀以及培育灰氈毛忍冬優(yōu)良新品種提供了理論依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 中國藥典[S]. 一部. 2020: 30-31.

[2] 楊苗, 馬逾英, 周娟, 等. 細氈毛忍冬采收期動態(tài)研究[J]. 時珍國醫(yī)國藥, 2009, 20(1): 34-35.

[3] 耿世磊, 寧熙平, 吳鴻, 等. 山銀花不同發(fā)育階段花結(jié)構(gòu)與綠原酸含量變化關(guān)系研究 [J]. 云南植物研究, 2005, 27(3): 279-287.

[4] 孫夢姍, 周日寶, 彭曉丹, 等. 灰氈毛忍冬不同品種開花時期內(nèi)源乙烯動態(tài)變化的研究 [J]. 中成藥, 2013, 35(9): 1969-1972.

[5] 蔡嘉洛. 氈毛忍冬蕾期延長相關(guān)基因AGL15的克隆與表達 [D]. 長沙: 湖南中醫(yī)藥大學(xué),2016 .

[6] 徐玉琴, 王珊, 劉湘丹, 等. 灰氈毛忍冬花蕾總RNA提取方法的研究 [J]. 中醫(yī)藥導(dǎo)報, 2015, 21(24): 31-34.

[7] Liu C, Chen H Y, Er H L,. Direct interaction of AGL24 and SOC1 integrates flowering signals in Arabidopsis [J]., 2008, 135(8): 1481-1491.

[8] Hartmann U, H?hmann S, Nettesheim K,. Molecular cloning of SVP: A negative regulator of the floral transition in Arabidopsis [J]., 2000, 21(4): 351-360.

[9] Lee J H, Yoo S J, Park S H,. Role of SVP in the control of flowering time by ambient temperature in Arabidopsis [J]., 2007, 21(4): 397-402.

[10] 張燕, 許申平, 梁芳, 等. 蝴蝶蘭Ph SVP的克隆及其在花發(fā)育過程中的表達分析 [J]. 園藝學(xué)報, 2020, 47(6): 1111-1125.

[11] 李玉舒, 楊煒茹, 程堂仁, 等. 梅花2個SVP基因的克隆與表達分析 [J]. 西北植物學(xué)報, 2019, 39(7): 1163-1171.

[12] Li X F, Wu W T, Zhang X P,. Narcissus tazetta SVP-like gene NSVP1 affects flower development in Arabidopsis [J]., 2015, 173: 89-96.

[13] 汪王, 蘇小霞, 楊柳慧, 等. 細葉百合LpSVP基因的克隆及其表達分析 [J]. 西北林學(xué)院學(xué)報, 2018, 33(4): 89-94.

[14] 劉思思, 喬中全, 曾慧杰, 等. 灰氈毛忍冬轉(zhuǎn)錄組SSR位點分析及EST-SSR標(biāo)記開發(fā) [J]. 分子植物育種, 2021, 19(9): 3015-3021.

[15] 劉思思, 喬中全, 劉新民, 等. 花蕾型和普通型灰氈毛忍冬花冠開裂過程的轉(zhuǎn)錄組比較分析 [J]. 分子植物育種, 2021, 19(6): 1822-1829.

[16] 王力娜, 范術(shù)麗, 宋美珍, 等. 植物MADS-box基因的研究進展 [J]. 生物技術(shù)通報, 2010(8): 12-19.

[17] Blümel M, Dally N, Jung C. Flowering time regulation in crops—What did we learn from Arabidopsis? [J]., 2015, 32: 121-129.

[18] Tang X L, Liang M X, Han J J,. Ectopic expression of LoSVP, a MADS-domain transcription factor from lily, leads to delayed flowering in transgenic Arabidopsis [J]., 2020, 39(2): 289-298.

[19] 候慧芳. 蠟梅CpFUL-like基因的克隆及功能研究 [D]. 重慶: 西南大學(xué), .

[20] Kikuchi R, Sage-Ono K, Kamada H,. PnMADS1, encoding an StMADS11-clade protein, acts as a repressor of flowering in[J]., 2008, 133(4): 786-793.

[21] 王銀杰, 張永俠, 劉清泉, 等. 德國鳶尾IgSVP基因的克隆及其表達分析 [J]. 分子植物育種, 2022, 20(23): 7697-7702.

[22] 張文香, 龐朝友, 范術(shù)麗, 等. 棉花SVP-like基因GhMADS29的克隆與表達分析 [J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 43(15): 28-31.

[23] 任閩. 薔薇RmSVP基因的進化分析及功能鑒定 [D]. 南京: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2020.

[24] 陳微, 惠林沖, 李威亞, 等. 洋蔥AcSVP基因的克隆及其表達分析 [J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2020, 32(6): 17-22.

[25] Liu Y Z, Gao Y K, Yuan L,. Molecular characterization and expression patterns of the HkSVP gene reveal distinct roles in inflorescence structure and floral organ development in[J]., 2021, 22(21): 12010.

[26] 高耀輝, 馬斌, 魏光普, 等. 菊花SVP和AGL24基因的克隆及序列分析 [J]. 分子植物育種, 2021, 19(13): 4286-4292.

[27] Gregis V, Sessa A, Dorca-Fornell C,. The Arabidopsis floral meristem identity genes AP1, AGL24 and SVP directly repress class B and C floral homeotic genes [J]. Plant J, 2009, 60(4): 626-637.

[28] 籍鳳嬌, 馬燕, 亓帥, 等. 芍藥PlSVP基因的克隆及其花期調(diào)控功能分析 [J]. 園藝學(xué)報, 2022, 49(11): 2367-2376.

[29] Wu R M, Walton E F, Richardson A C,. Conservation and divergence of four kiwifruit SVP-like MADS-box genes suggest distinct roles in kiwifruit bud dormancy and flowering [J]., 2012, 63(2): 797-807.

[30] Lilie H, Schwarz E, Rudolph R. Advances in refolding of proteins produced in[J]., 1998, 9(5): 497-501.

[31] Francois J, Baneyx R. Recombinant protein expression in[J]., 1999, 10: 411-421.

Cloning and expression analysis offamily genefrom

LONG Li-jun1, 2, LIU Si-si2, ZENG Hui-jie2, LI Chang-zhu2, ZHANG Gang3, 4, MA Ying-zi1, LI Yi-min3, 4

1. School of Life Science and Technology, Central South University of Forestry Science and Technology, Changsha 410004, China 2. State Key Laboratory of Woody Oil Resources Utilization,Hunan Academy of Forestry, Changsha 410004, China 3. Key Laboratory for Research and Development of “Qin Medicine” of Shaanxi Administration of Chinese Medicine, Shaanxi University of Chinese Medicine, Xi’an 712046, China 4. State Key Laboratory of Research and Development of Characteristic Qin Medicine Resources (Cultivation), Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712083, China

To clone thefamily gene() of, analyze the characteristics of bioinformatics, spatiotemporal expression and protein prokaryotic expression.Based on the transcriptome sequencing data ofin the previous study, the full-length cDNA ofwas cloned by PCR. The bioinformatics methods were used to analyze the sequence characteristics of their encoded proteins. Real-time quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) was used to detect the expression level ofin leaves, early and late flowers of the “Longhua” and “Jincuilei” varieties of. And then, the pTOPO-D1-LmSVP prokaryotic expression vector was constructed and transformed intoBL21 (DE3) to express.The full-length ofgene was 1472 bp, containing an open reading frame (ORF) of 720 bp and encoding 239 amino acids. The relative molecular weight of LmSVP protein was 26 712.63. Phylogenetic analysis indicated that the LmSVP protein was most closely related toandThe qRT-PCR results showed that the expression level ofgenes were specific in both “Longhua” and “Jincuilei” variety, and expression in leaves were significantly higher than in flowers. At different stages of flower development, the expression level ofgenes were not significantly different.successfully expressed a recombination protein with molecular weight of about 26 710 in theBL21 (DE3), which was consistent with the prediction.Through the full-length cloning, sequence analysis and expression characterization ofgene, it provided experimental basis for further study on the function ofgene in regulating the bud length and corolla non-opening of.

Hand.-Mazz.;;; gene cloning; expression analysis; prokaryotic expression

R282.12

A

0253 - 2670(2023)16 - 5350 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.16.024

2023-02-03

湖南省自然科學(xué)基金面上項目（2022JJ30326）；湖南省林業(yè)科技創(chuàng)新資金項目（XLKY202208）；湖南省自然科學(xué)基金項目（2020JJ4939）

龍麗君，女，碩士研究生，研究方向為植物學(xué)。E-mail: 2351643604@qq.com

馬英姿，女，教授，從事植物學(xué)及植物資源利用研究。E-mail: ma_yingzi@163.com

李依民，女，副教授，從事中藥資源評價與高效利用研究。E-mail: 2051058@sntcm.edu.cn

[責(zé)任編輯 時圣明]