劉勝京，王 福，高慶和，于文曉，郭 俊，楊九天，趙子維，馬東岳，郭 軍

寧泌泰膠囊對良性前列腺增生模型大鼠的治療作用及機制研究

劉勝京，王 福，高慶和，于文曉，郭 俊，楊九天，趙子維，馬東岳，郭 軍*

中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院 男科，北京 100091

探討寧泌泰膠囊對良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）大鼠的治療作用及作用機制。SD大鼠隨機分為對照組、模型組及寧泌泰膠囊低、中、高劑量（0.21、0.41、0.82 g/kg）組和非那雄胺（0.45 mg/kg）組，每組8只。大鼠隔天sc 50 mg/kg丙酸睪酮復制BPH大鼠模型，連續(xù)30 d，造模同時給予相應藥物。給藥結束后，稱定大鼠體質量和前列腺濕質量，計算前列腺指數；采用蘇木素-伊紅（HE）和Masson染色觀察大鼠前列腺組織病理情況及纖維化程度；免疫組化法檢測大鼠前列腺組織增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）表達；免疫熒光法檢測大鼠前列腺組織雄激素受體（androgen receptor，AR）和表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）表達；ELISA檢測大鼠前列腺組織白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平。與對照組比較，模型組大鼠前列腺指數顯著升高（＜0.001）；前列腺組織病理顯示被膜增厚，腺體密度增加，腺上皮分泌旺盛，形成密集的皺褶或乳頭狀結構；Masson染色可見間質內纖維組織增生及血管增生，前列腺組織PCNA表達顯著升高（＜0.001）；前列腺組織AR和EGF表達顯著升高（＜0.001），IL-6和TNF-α水平顯著升高（＜0.05）。與模型組比較，給予藥物干預后，前列腺增生程度明顯減弱，間質內纖維組織及血管增生減少，前列腺組織PCNA表達顯著下降（＜0.01、0.001）；前列腺組織AR和EGF表達顯著降低（＜0.001），IL-6和TNF-α水平顯著降低（＜0.05、0.01）。寧泌泰膠囊可降低BPH大鼠前列腺指數，改善增生的前列腺腺體結構，減少間質纖維組織增生，抑制BPH大鼠前列腺組織PCNA增殖。其作用機制可能與抑制前列腺組織AR、EGF表達、降低前列腺組織促炎細胞因子水平有關。

寧泌泰膠囊；良性前列腺增生；增殖；雄激素受體；表皮生長因子；促炎細胞因子

良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）是導致中老年男性排尿障礙最常見的泌尿系統疾病，以前列腺體積增大及下尿路癥狀（lower urinary tract symptoms，LUTS）為主要臨床表現，嚴重影響患者生活質量[1]。隨著全球人口老齡化的加劇，BPH發(fā)病率高且呈上升趨勢[2]。目前藥物治療以α受體阻滯劑和5α-還原酶抑制劑為一線治療方式，但仍有患者療效不佳[3-4]。中醫(yī)認為本病屬于“精癃”“癃閉”“淋證”等范疇，治療BPH有較好的優(yōu)勢[5-6]。

研究表明寧泌泰膠囊單用或聯合化學藥使用均可顯著改善BPH患者LUTS癥狀，可改善患者國際前列腺癥狀評分（international prostate symptom score，IPSS）評分，減輕臨床癥狀，控制病情發(fā)展[7-11]。但目前寧泌泰膠囊治療BPH的機制尚不清楚。本研究探討寧泌泰膠囊對丙酸睪酮誘導的BPH模型大鼠的治療作用及作用機制，為其臨床及后續(xù)藥物研究提供參考。

1 材料

1.1 動物

1.2 藥品與試劑

寧泌泰膠囊（國藥準字Z20025442，批號220309）由貴陽新天藥業(yè)股份有限公司提供；非那雄胺片（國藥準字J20150143，批號H20160290）購自杭州默沙東制藥有限公司；增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗體（批號10205-1-IG）購自美國Proteintech公司；雄激素受體（androgen receptors，AR）抗體（批號68492）購自美國CST公司；表皮細胞生長因子（epidermal growth factor，EGF）抗體（批號ab94898）購自英國Abcam公司；山羊抗兔IgG抗體（批號bs-0295G-AF488）購自Bioss公司；Masson染色試劑盒（批號GPB1828）購自Genepool公司；白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒（批號EIA-3756）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（批號EIA-3655）購自Biotech公司。

1.3 儀器

3-30K型高速冷凍離心機（美國Sigma公司）；MDF-C8V型?80 ℃低溫冰箱（日本SANYO公司）；ELx800型酶標儀（美國Bio-Tek公司）；QL-902型渦旋振蕩儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；Nikon Eclipse Ti-SR型倒置熒光顯微鏡（日本尼康公司）；Pannoramic MIDI全景掃描儀（匈牙利3D HISTECH公司）。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

48只雄性SD大鼠隨機分為對照組、模型組及寧泌泰膠囊低、中、高劑量（0.21、0.41、0.82 g/kg，分別相當于臨床劑量的0.5、1、2倍）組和非那雄胺（0.45 mg/kg，臨床等效劑量）組，每組8只。因丙酸睪酮為脂溶性，采用花生油為溶劑配制丙酸睪酮溶液。除對照組外，其余大鼠隔天sc 50 mg/kg丙酸睪酮復制BPH大鼠模型[12]，對照組于同樣位置隔天sc等量花生油，連續(xù)30 d。造模同時，各給藥組ig相應藥物，對照組和模型組ig等體積純凈水，1次/d，連續(xù)30 d。

2.2 標本采集

末次給藥后，稱定大鼠體質量并記錄，麻醉后完整切除大鼠前列腺組織，于提前預冷的生理鹽水中漂洗，仔細剝離剔除脂肪等組織后，稱定前列腺組織濕質量，前列腺組織于4%多聚甲醛溶液中固定。采用取血針抽取大鼠腹主動脈血于促凝管，放置分層后，3000 r/min離心10 min，取上清，全程避免震蕩，將血清移到1.5 mL EP管，標記后?80 ℃冰箱保存。

2.3 大鼠前列腺指數測定

取材時稱定大鼠體質量及前列腺濕質量，計算前列腺指數[13]。

前列腺指數＝(前列腺濕質量/大鼠體質量)×1000

2.4 蘇木素-伊紅（HE）及Masson染色觀察大鼠前列腺組織病理變化及纖維化程度

取各組大鼠相同部位的前列腺組織，常規(guī)固定，經脫水、透明、浸蠟、包埋、切片后，分別進行HE及Masson染色。采用HE染色評價各組大鼠前列腺組織病理情況，觀察各組前列腺上皮增生情況、腺體結構以及腺體周圍間質細胞及纖維組織增生情況。采用Masson染色評價各組大鼠前列腺組織纖維化程度。

在水利工程施工建設環(huán)節(jié)，要加大對軟土地基處理的重視力度，并且積極采集土地基地的試驗數據，從而提高試驗數據的應用價值，從根源消除質量安全隱患，強化整體工程建設質量。

2.5 免疫組化法檢測大鼠前列腺組織PCNA表達

將包埋好的前列腺組織蠟塊進行切片，脫蠟后用PBS緩沖液沖洗，于EDTA緩沖液中修復，3%過氧化氫溶液培養(yǎng)切片，3%牛血清白蛋白封閉，滴加PCNA抗體（1∶150），4 ℃孵育過夜；滴加二抗，4 ℃孵育后加入DAB溶液，完全顯色后，蘇木素復染，1%鹽酸乙醇分化，氨水返藍，流水沖洗。切片經梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固后，于顯微鏡下觀察并拍照。

2.6 免疫熒光法檢測大鼠前列腺組織AR及EGF表達

將包埋好的前列腺組織切片，PBS沖洗后，加1%牛血清白蛋白及0.1%聚山梨醇-100，封閉，PBS清洗。滴加AR及EGF抗體，4 ℃孵育過夜；清洗后，滴加熒光二抗，室溫避光孵育45 min；清洗后，滴加DAPI，室溫避光孵育10 min，清洗后，指甲油封片，于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.7 ELISA檢測大鼠前列腺組織促炎細胞因子IL-6及TNF-α水平

按照ELISA試劑盒說明書檢測各組大鼠前列腺組織促炎細胞因子IL-6及TNF-α水平。

2.8 統計學分析

3 結果

3.1 寧泌泰膠囊對BPH大鼠前列腺指數的影響

在造模及給藥過程中，各組均未見大鼠死亡，各組大鼠體質量未見明顯差異。正常情況下各組大鼠前列腺指數較為恒定，如果前列腺組織發(fā)生增生或者發(fā)生充血水腫，則前列腺指數增大[14]。如圖1所示，與對照組比較，模型組前列腺指數明顯升高（＜0.001）；與模型組比較，各給藥組前列腺指數均顯著降低（＜0.001）。

與對照組比較：#P＜0.05 ###P＜0.001；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001，下圖同

3.2 寧泌泰膠囊對BPH大鼠前列腺組織病理變化的影響

如圖2所示，對照組大鼠前列腺組織結構完整，腺腔規(guī)則，腺體上皮和間質形態(tài)正常且排列整齊。模型組可見大鼠前列腺組織被膜增厚，腺體密度增加，腺上皮分泌旺盛，形成密集的皺褶或乳頭狀結構，充滿腺腔，管壁增厚；部分腺體周圍纖維組織及小血管增生。給予寧泌泰膠囊或非那雄胺干預后，大鼠前列腺增生程度明顯減弱。

3.3 寧泌泰膠囊對BPH大鼠前列腺間質纖維化程度的影響

Masson染色后大鼠前列腺間質膠原纖維呈藍色，肌纖維呈紅色，可用于區(qū)分膠原纖維和肌纖維，并可顯示膠原纖維含量及纖維化程度。如圖3所示，對照組大鼠前列腺組織間質未見明顯纖維組織增生，可見少量小血管。模型組間質內可見纖維組織增生及血管增生（＜0.001）。給予寧泌泰膠囊或非那雄胺干預后，間質內纖維組織及小血管增生減少（＜0.01、0.001），表明寧泌泰膠囊能夠有效減輕前列腺組織纖維化程度。

圖2 寧泌泰膠囊對BPH大鼠前列腺組織病理變化的影響(HE染色)

3.4 寧泌泰膠囊對BPH大鼠前列腺組織PCNA表達的影響

PCNA與DNA合成有關，被認為是細胞增殖的標志性抗原，可作為評價細胞增殖狀態(tài)的指標，在BPH模型大鼠中，PCNA蛋白高表達[14]。如圖4所示，與對照組比較，模型組大鼠前列腺組織PCNA蛋白高表達（＜0.001）；給予寧泌泰膠囊或非那雄胺藥物干預后，PCNA蛋白表達減弱（＜0.001）。

3.5 寧泌泰膠囊對BPH大鼠前列腺組織AR表達的影響

研究發(fā)現，BPH患者AR表達顯著增加[15]。如圖5所示，與對照組比較，模型組前列腺組織AR表達顯著升高（＜0.001）；給予寧泌泰膠囊干預后，前列腺組織AR表達顯著降低（＜0.001）。

3.6 寧泌泰膠囊對BPH大鼠前列腺組織EGF表達的影響

EGF為與BPH密切相關的表皮生長因子，可刺激前列腺細胞增殖，參與調節(jié)上皮細胞分化[16]。如圖6所示，與對照組比較，模型組前列腺組織EGF蛋白表達顯著升高（＜0.001）；給予寧泌泰膠囊干預后，EGF蛋白表達顯著降低（＜0.001）。

圖3 寧泌泰膠囊對BPH大鼠前列腺間質纖維化程度的影響(Masson染色)

圖4 寧泌泰膠囊對BPH大鼠前列腺組織PCNA表達的影響

圖5 寧泌泰膠囊對BPH大鼠前列腺組織AR表達的影響(×100)

圖6 寧泌泰膠囊對BPH大鼠前列腺組織EGF表達的影響(×100)

3.7 寧泌泰膠囊對BPH大鼠前列腺組織IL-6和TNF-α水平的影響

慢性炎癥在BPH的發(fā)生與進展中起著重要的作用[17]。如圖7所示，與對照組比較，模型組前列腺組織促炎細胞因子IL-6和TNF-α水平顯著升高（＜0.05）；與模型組比較，寧泌泰膠囊中、高劑量組IL-6和TNF-α水平均顯著降低（＜0.05、0.01）。

4 討論

BPH是最常見的泌尿系統疾病之一，其病因為前列腺間質及腺體成分增生，前列腺體積增大，壓迫尿道，尿道狹窄而出現LUTS癥狀[1]。BPH發(fā)病率及癥狀往往隨年齡遞增且進行性加重，導致患者出現排尿困難甚至尿潴留等問題，嚴重影響中老年男性生活質量。目前隨著我國老齡化社會逐步到來，BPH的患病率也在逐年增加，給患者、家庭及社會帶來了巨大的醫(yī)療經濟負擔[2]。目前臨床上對BPH的治療方法主要為手術及藥物治療，由于BPH患者多為中老年，生理機能減弱，手術存在一定損傷以及術后依然可能存在一定并發(fā)癥等問題，患者身心負擔較重，因此藥物治療仍為輕中度及部分重度BPH患者的首選治療方式[1]。

圖7 寧泌泰膠囊對BPH大鼠前列腺組織IL-6和TNF-α水平的影響(, n = 8)

中醫(yī)藥是治療BPH等重要手段之一，因其多靶點調控方式發(fā)揮較好的治療優(yōu)勢[18-20]。寧泌泰膠囊由四季紅、白茅根、大風藤、三顆針、仙鶴草、木芙蓉葉、連翹組成，方中四季紅為君藥，清熱利濕、利尿通淋、解毒散瘀。白茅根甘寒清潤、涼血止血；大風藤苦寒清熱、涼血解毒；連翹辛涼宣散、消癰開結，三者俱為臣藥。三顆針、仙鶴草清熱利濕、收斂止血，木芙蓉葉解毒、消腫，佐助君臣。由此而成清熱解毒、利濕通淋之專方[10,21]。諸多臨床研究證實寧泌泰膠囊單用或者聯合α受體阻滯劑/5α-還原酶抑制劑治療BPH具有較好的臨床療效[7-11]。本研究結果顯示，寧泌泰膠囊可明顯降低模型大鼠前列腺指數，抑制前列腺組織的病理增生、間質纖維化和PCNA蛋白的增殖，其療效與陽性對照藥物非那雄胺相當，在動物層面進一步證明了寧泌泰膠囊治療BPH的有效性。

目前BPH的發(fā)病機制尚不完全明確，可能與性激素、生長因子、炎癥細胞、脂質過氧化等有關[1,16,22-23]。課題組前期通過對寧泌泰膠囊進行網絡藥理學及分子對接研究，認為寧泌泰膠囊可能通過調節(jié)前列腺組織細胞生長、調節(jié)性激素水平、抑制促炎細胞因子表達和抑制生長因子相關受體等機制，從而起到多靶點治療BPH的作用[24]。前列腺是雄激素依賴性器官，雄激素是調控前列腺生長、結構維持及功能完整的重要激素。在前列腺內，睪酮可直接與AR結合產生生物活性，還可在5α-還原酶的催化作用下轉化為活性更強的雙氫睪酮（dihydrotestosterone，DHT）促使前列腺的增生[25]。本研究發(fā)現，寧泌泰膠囊可抑制BPH模型大鼠前列腺組織AR表達，表明寧泌泰膠囊可能通過抑制模型大鼠AR表達，通過影響雄激素及其受體作用來抑制BPH的發(fā)生。

前列腺的基質成分在調控前列腺生長方面起非常重要的作用?；|細胞分泌蛋白參與調節(jié)上皮細胞的分化，而BPH的形成可能因抑制細胞增殖的基質成分缺乏所致[26]。前列腺的間質和上皮都能合成和分泌生長因子，并通過這些生長因子以旁分泌的形式相互影響及調節(jié)上皮和間質的分化和生長[27]。近年來研究顯示，BPH與多種生長因子的異常表達有關，生長因子參與前列腺基質-上皮相互作用，其中EGF為經典的表皮生長因子，可通過作用于細胞膜上的受體，促進細胞分裂從而導致前列腺上皮細胞增生[28]。本研究發(fā)現寧泌泰膠囊可顯著降低BPH模型大鼠中前列腺組織EGF表達，說明寧泌泰膠囊可能通過抑制前列腺組織EGF表達，影響前列腺基質-上皮相互作用，從而達到抑制BPH的作用。

目前流行病學、組織病理與治療學方面的研究均提示前列腺中組織炎癥的發(fā)生與BPH的進展相關[29]。目前研究發(fā)現寧泌泰膠囊可通過抗炎、抗氧化，作用CC趨化因子配體2（chemokine C-C motif ligand 2，CCL2）-絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatived protein kinase，MAPK）通路等途徑影響全身和局部免疫，從而改善慢性非細菌性前列腺炎動物模型的系列癥狀[30-31]。IL-6及TNF-α為典型的促炎細胞因子，是炎癥反應過程中出現最早且重要的炎性介質之一，可激活中性粒細胞及淋巴細胞，調節(jié)組織代謝活性并促使其他細胞因子的合成與釋放。本研究發(fā)現，寧泌泰膠囊可降低BPH模型大鼠促炎細胞因子IL-6及TNF-α水平，揭示寧泌泰膠囊可能通過降低促炎細胞因子表達來起到治療BPH的作用。

綜上，寧泌泰膠囊對BPH具有顯著的治療效果，可降低BPH模型大鼠前列腺指數，改善前列腺組織增生病理結構，抑制前列腺組織增殖、間質纖維化和PCNA增殖。其作用機制可能與抑制BPH大鼠前列腺組織AR、EGF和促炎細胞因子表達相關。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Protective effect and mechanism of Ningmitai Capsules on benign prostatic hyperplasia rat model

LIU Sheng-jing, WANG Fu, GAO Qing-he, YU Wen-xiao, GUO Jun, YANG Jiu-tian, ZHAO Zi-wei, MA Dong-yue, GUO Jun

Department of Andrology, Xiyuan Hospital of China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100091, China

To explore the therapeutic effect and mechanism of Ningmitai Capsules (寧泌泰膠囊) on benign prostatic hyperplasia (BPH) rats.SD rats were randomly divided into control group, model group, Ningmitai Capsules low-, medium-, high-dose (0.21, 0.41, 0.82 g/kg) groups and finasteride (0.45 mg/kg) groups, with eight rats in each group. The rat model of BPH was established by sc 50 mg/kg testosterone propionate at intervals of 1 d for 30 d, and the corresponding drugs were given at the same time. After drug administration, body weight and prostate wet weight of rats were weighed, and prostate index was calculated. Hematoxylin-eosin (HE) and Masson staining were used to observe the pathological situation and fibrosis degree of prostate tissue in rats. Immunohistochemical method was used to detect the expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in prostate tissue of rats. The expressions of androgen receptor (AR) and epidermal growth factor (EGF) in prostate tissue of rats were detected by immunofluorescence. The levels of interleukin-6 (IL-6) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) in prostate tissue of rats were detected by ELISA.Compared with control group, prostate index of rats in model group was significantly increased (< 0.001), prostate histopathology showed that basement membrane was thickened, gland density was increased, and glandular epithelium was secreted vigorously, dense folds or papillary structure was formed; Masson staining showed fibrous tissue hyperplasia and vascular hyperplasia in interstitial tissue, and the expression of PCNA in prostate tissue was significantly increased (< 0.001); The expressions of AR and EGF in prostate tissue were significantly increased (< 0.001), levels of IL-6 and TNF-α were significantly increased (< 0.05). Compared with model group, after drug intervention, the degree of hyperplasia of prostate was obviously weakened, the proliferation of interstitial fiber tissue and blood vessels were decreased, and the expression of PCNA in prostate tissue was significantly decreased (< 0.01, 0.001); The expressions of AR and EGF in prostate tissue were significantly decreased (< 0.001), levels of IL-6 and TNF-α were significantly decreased (< 0.05, 0.01).Ningmitai Capsules can reduce prostate index, improve the structure of hyperplastic prostate gland, reduce interstitial fibrous tissue hyperplasia and inhibit PCNA proliferation in prostate tissue of BPH rats. Its mechanism may be related to inhibiting the expressions of AR and EGF in prostate tissue and reducing the levels of proinflammatory cytokines in prostate tissue.

Ningmitai Capsules; benign prostatic hyperplasia; proliferation; androgen receptor; epidermal growth factor; pro-inflammatory cytokines

R285.5

A

0253 - 2670(2023)16 - 5267 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.16.015

2023-03-31

國家自然科學基金資助項目（82104880）；國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥傳承與創(chuàng)新“百千萬”人才工程岐黃學者資助項目（國中醫(yī)藥人教函[2022]6號）

劉勝京，男，博士生，研究方向為中西醫(yī)結合防治前列腺疾病。E-mail: liu-shengjing@qq.com

郭 軍，男，主任醫(yī)師，博士生導師，岐黃學者。Tel: (010)62835134 E-mail: guojun1126@126.com

[責任編輯 李亞楠]