陳 瑞，趙金莉，孔若嵐，周 龍，楊盈欣，孔 慧*，趙 琰*

生地黃炭納米類成分的發(fā)現(xiàn)及其對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用

陳 瑞1, 2，趙金莉1，孔若嵐1，周 龍1，楊盈欣1，孔 慧1*，趙 琰1*

1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京 100029 2. 江西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 治未病科，江西 南昌 330000

從生地黃炭（dried，DRC）中發(fā)現(xiàn)并提取生地黃炭納米類成分（driednano-components，DRC-NCs），利用2,4,6-三硝基苯磺酸/乙醇溶液誘導(dǎo)的大鼠潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）模型評(píng)價(jià)其治療作用及可能的作用機(jī)制。利用馬弗爐高溫煅燒生地黃，并經(jīng)過萃取、濾過、透析得到DRC-NCs。利用透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）、X射線衍射（X-ray diffraction，XRD）技術(shù)、紫外-可見分光光譜、熒光光譜、傅里葉變換紅外光譜以及X射線光電子能譜技術(shù)等對(duì)DRC-NCs進(jìn)行表征。利用CCK-8細(xì)胞毒性試驗(yàn)評(píng)價(jià)DRC-NCs的安全性。利用大鼠UC模型，通過比較大鼠一般情況、疾病活動(dòng)指數(shù)（disease activity index，DAI）、結(jié)腸組織損傷程度、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、結(jié)腸組織中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）及白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-10、丙二醛（malondialdehyde，MDA）的水平、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的活力，以評(píng)價(jià)DRC-NCs的治療作用及其機(jī)制。DRC-NCs在TEM下分散度良好，為近球形且粒徑大小均一，粒徑分布集中在1.1～2.6 nm，晶格間距為0.354 nm，主要由C、N、O等元素構(gòu)成，表面含有氨基、羥基、羧基等基團(tuán)。DRC-NCs的細(xì)胞毒性很低，安全質(zhì)量濃度在2 500.00 μg/mL以內(nèi)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DRC-NCs可以改善UC模型大鼠的一般情況，顯著降低模型大鼠的DAI評(píng)分，減輕結(jié)腸損傷，升高胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。DRC-NCs可以降低TNF-α及IL-6的水平、升高IL-10的水平、降低大鼠結(jié)腸組織中MDA的水平及MPO的活力、提高SOD的活力。DRC-NCs具有治療UC的作用，其作用機(jī)制可能與降低炎癥因子和氧化應(yīng)激水平，提高抗炎和抗氧化能力有關(guān)。這不僅為中藥炭藥的探索開發(fā)提供了一個(gè)獨(dú)特的研究角度，也為臨床應(yīng)用生地黃炭治療UC提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

生地黃炭；納米類成分；物質(zhì)基礎(chǔ)；潰瘍性結(jié)腸炎；炎癥因子；氧化應(yīng)激；表征；納米材料

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種以腹痛、腹瀉、黏液膿血便為主要臨床表現(xiàn)的非特異性炎癥性腸病，其病理機(jī)制涉及炎癥因子表達(dá)失衡、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、腸黏膜屏障受損等方面[1-4]。UC在我國的發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)[5]，若未能及時(shí)有效干預(yù)，可能發(fā)展成結(jié)腸癌，據(jù)相關(guān)研究記載，結(jié)腸癌已經(jīng)成為我國第2大惡性腫瘤，位居癌癥死亡原因的第4位[6]，而UC患者發(fā)生結(jié)腸癌的幾率是正常人群的3～5倍[7-8]。因此，必須采取有效的干預(yù)措施來預(yù)防和治療UC，以防止其發(fā)展。目前，治療UC的方法雖多，但大多患者經(jīng)治療后仍易反復(fù)發(fā)作，病情遷延，難以治愈[9]，氨基水楊酸類藥物是目前治療UC的主流藥物，臨床上常存在患者不耐受的現(xiàn)象，且易出現(xiàn)皮疹、肝功能不全等不良反應(yīng)[10]。其次是皮質(zhì)激素類的藥物、免疫抑制劑，臨床可見多種不良反應(yīng)，如高血壓及腎臟毒性等[11]。另外，治療UC還有生物制劑[12]，但對(duì)于生物制劑的應(yīng)用與安全性等，還有待更深一步的研究。因此，UC發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，發(fā)病人數(shù)較多，病理危害較大，且目前治療手段存在一定的局限性，因此，有必要開發(fā)一種療效更佳，不良反應(yīng)更少的治療藥物。

生地黃是玄參科地黃屬植物地黃Libosch.的新鮮或干燥塊根[13]，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具體記載為“味甘，寒。主折跌絕筋，傷中，逐血痹，填骨髓，長肌肉，作湯，除寒熱積聚，除痹?！鄙攸S炭（dried，DRC）最早見于葉天士《臨證指南醫(yī)案》[14]中，明清醫(yī)家在治療痢疾、下血、腸紅等病時(shí)多用生地黃炭，如清代王士雄治療腸紅時(shí)方中用生地黃炭（3兩）治痔血腸紅，便血久治不瘳；丁甘仁治療脾寒腸濕之血痢時(shí)，用黃土湯加味，以溫運(yùn)中陽而清濕熱，使陽氣得以上升，陰血不致下泄，其將方中干地黃易為生地黃炭。現(xiàn)代研究認(rèn)為[15-16]，生地黃炭可以通過影響機(jī)體的內(nèi)、外源性凝血途徑，降低纖維蛋白原含量，全血高切、中切、低切黏度以及血漿黏度促進(jìn)血液凝固而發(fā)揮止血作用，且炒炭后因?yàn)樘康奈叫裕€可增強(qiáng)止血作用。

隨著納米材料學(xué)的深入研究，研究者們成功從數(shù)十種中草藥中提取并制備了碳點(diǎn)，且經(jīng)過一系列實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)了其良好的生物活性。如焦三仙碳點(diǎn)的降糖作用[17]、黃柏碳點(diǎn)的保腎作用[18]、金銀花碳點(diǎn)的抗炎作用[19]、艾葉碳點(diǎn)的抗寒作用[20]、白芍碳點(diǎn)的保肝作用[21]、甘草碳點(diǎn)的抗?jié)冏饔肹22]等。通過大量藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，納米類成分為炭藥發(fā)揮作用的物質(zhì)基礎(chǔ)[23]。對(duì)生地黃的炮制歷史梳理總結(jié)后發(fā)現(xiàn)，生地黃炭的炮制記載以“燒灰”（《太平圣惠方》）、“燜煅”（《圣濟(jì)總錄》）為主，這與中藥碳點(diǎn)制備過程極為相似，且生地黃炭臨床應(yīng)用廣泛，療效突出，然而，生地黃炭的物質(zhì)基礎(chǔ)及藥理藥效研究較少。基于中藥碳點(diǎn)的研究，本研究從納米材料學(xué)角度出發(fā)，運(yùn)用納米技術(shù)和方法研究生地黃炭。

本研究發(fā)現(xiàn)生地黃炭中存在納米類成分，并將其提取分離出，命名為生地黃炭納米類成分（driednano-components，DRC-NCs），利用HPLC法排除生地黃炭中小分子存在的干擾，利用低分辨透射電子顯微鏡（low resolution transmission electron microscopy，LRTEM）、高分辨透射電子顯微鏡（high resolution transmission electron microscopy，HRTEM）、X射線衍射（X-ray diffraction，XRD）技術(shù)、紫外-可見吸收光譜（UV- Vis）、熒光光譜（fluorescence spectrum，F(xiàn)L）、傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）以及X射線光電子能譜（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）技術(shù)獲取DRC- NCs的形貌特征和成分測(cè)定。通過CCK-8細(xì)胞實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)DRC-NCs的安全性，為臨床安全用藥提供參考。通過觀察和比較大鼠UC模型的一般情況、疾病活動(dòng)指數(shù)（disease activity index，DAI）評(píng)分、結(jié)腸組織病理變化及結(jié)腸組織中細(xì)胞因子和氧化應(yīng)激指標(biāo)的水平，以評(píng)價(jià)DRC-NCs對(duì)UC的治療作用。

1 儀器與材料

1.1 儀器

T1612型馬弗爐，北京中科澳博科技股份有限公司；1260 Infinity型高效液相色譜儀，美國Agilent Technologies公司；Tecnai G220型透射電子顯微鏡，美國FEI公司；JEN-1230型高分辨透射電子顯微鏡，日本Electron Optics Laboratory公司；CECIL型紫外可見分光光度計(jì)，英國Cambridge公司；F-4500型熒光分光光度計(jì)，日本Hitachi公司；JEN-1230型傅里葉變換紅外光譜儀，美國Thermo Fisher Scientific公司；D8 Discover X射線衍射儀，美國布魯克公司；ESCALAB 250Xi X射線光電子能譜儀，美國Thermo公司。

1.2 材料

生地黃，產(chǎn)地河北，批號(hào)201222012，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院趙琰教授鑒定，為玄參科地黃屬植物地黃Libosch.的干燥塊根，購自北京仟草中藥飲片有限公司；柳氮磺胺吡啶腸溶片（salazosulfapyridine，SASP，0.25 g/片），購自上海信誼嘉華藥業(yè)有限公司；5% 2,4,6-三硝基苯磺酸溶液（2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid solution，TNBS），購自美國Sigma公司；乙醇和其他分析級(jí)化學(xué)試劑均購于北京化學(xué)試劑公司；透析膜（截留相對(duì)分子質(zhì)量1000）購自北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司；大鼠白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-10 EELISA試劑盒，購自武漢云克隆生物科技有限公司；總蛋白（total protein，TP）測(cè)定試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒，購自南京建成生物科技有限公司；本實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水，由北京中醫(yī)藥大學(xué)提供。

1.3 動(dòng)物與細(xì)胞

SD大鼠，雄性，SPF級(jí)，體質(zhì)量（200±20）g，由北京斯貝福生物技術(shù)有限公司提供，質(zhì)量合格證編號(hào)為110324211107181812。實(shí)驗(yàn)正式開始前，所有動(dòng)物飼養(yǎng)在同一環(huán)境下，環(huán)境溫度為（24.0±1.0）℃，相對(duì)濕度維持在55%～65%，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，實(shí)驗(yàn)期間，動(dòng)物自由飲食，明暗循環(huán)飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前12 h所有動(dòng)物禁食不禁水。本實(shí)驗(yàn)相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循北京中醫(yī)藥大學(xué)有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用的規(guī)定，均符合3R原則。RAW264.7巨噬細(xì)胞購自國家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享平臺(tái)。

2 方法與結(jié)果

2.1 DRC-NCs的制備

稱取500 g生地黃干燥品于干燥潔凈的坩堝中，鋁箔紙封口并加蓋，置于馬弗爐中，關(guān)好爐門。設(shè)定馬弗爐燒制程序：第1階段5 min內(nèi)升溫至70 ℃，并保持25 min；第2階段30 min內(nèi)升溫至350 ℃，保持1 h，待馬弗爐自然冷卻后取出。將燒制的生地黃炭粉碎，稱取生地黃炭粉末50 g，放于燒杯中，加入30倍去離子水，置于水浴鍋中煎煮，溫度為100 ℃，時(shí)間1 h，共煎煮2次?；旌?次水煎液，先用定性濾紙粗濾，然后用0.22 μm的有機(jī)系微孔濾膜濾過，濃縮濾液，將濃縮液裝入可截留相對(duì)分子質(zhì)量為1000的透析膜中，透析72 h以上。待透析袋外液體透明取出袋內(nèi)液體，定容為1 g/mL，4 ℃冰箱中保存，備用。

2.2 HPLC分析

HPLC常用來檢測(cè)中藥提取液的小分子成分，這些小分子成分常常被認(rèn)為是中藥發(fā)揮作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)利用HPLC檢測(cè)生地黃生藥中含有的小分子成分在DRC-NCs中是否依舊存在。色譜條件：色譜柱為Reliasil-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫25 ℃；體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長334 nm；流動(dòng)相為乙腈-0.1%乙酸水溶液，梯度洗脫：0～20 min，10%～25%乙腈；20～30 min，25%乙腈；30～45 min，25%～10%乙腈；45～50 min，25%乙腈；進(jìn)樣量10 μL；采集時(shí)間50 min。生地黃與DRC-NCs的HPLC圖譜如圖1所示，可見在生地黃中含有益母草苷、梓醇、毛蕊花糖苷等多種小分子化合物[24-25]，成分復(fù)雜，而經(jīng)過炭化、提取、分離得出的DRC-NCs的HPLC圖譜為一條直線，說明在DRC-NCs中不含有傳統(tǒng)意義上認(rèn)為的小分子化合物。

1-梓醇 2-益母草苷 3-毛蕊花糖苷

2.3 DRC-NCs的表征

利用TEM、HRTEM、XRD觀察DRC-NCs的外觀形態(tài)、粒徑大小分布、微觀結(jié)構(gòu)及晶格間距等特征。圖2-A所示為DRC-NCs在50 nm下的粒徑分布，分散度良好，外貌形態(tài)為近球形，粒徑大小均一。圖2-B為DRC-NCs的粒徑分布圖，利用Image J軟件對(duì)100個(gè)顆粒進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得出其粒徑分布在0.8～3.2 nm，集中在1.1～2.6 nm，平均尺寸在1.75 nm左右。圖2-C為DRC-NCs的高倍電鏡圖，可看到DRC-NCs中存在明顯的晶格，其晶格間距為0.354 nm。如2-D所示，測(cè)得DRC-NCs的衍射角度2＝25.102°。

利用UV-Vis及FL分析DRC-NCs的光學(xué)特征。紫外光譜如圖2-E所示，DRC-NCs在200～250 nm有吸收峰，推測(cè)與DRC-NCs中存在π-π*躍遷有關(guān)。DRC-NCs的熒光光譜可知，其最大激發(fā)波長為288 nm，在此條件下最大發(fā)射波長為449 nm（圖2-F）。

利用XPS及FTIR分析DRC-NCs表面官能團(tuán)信息。紅外圖譜見圖2-G。DRC-NCs的吸收峰在 3 444.28、2 917.93、2 850.01、2 360.79、1 635.06、1 541.52、1 467.89、1 384.34、1 112.55 cm?1，其中3444 cm?1處的吸收峰表示O-H的伸縮振動(dòng)，2960～2850 cm?1的吸收峰為CH3-和CH2-的伸縮振動(dòng)；2360 cm?1附近的吸收峰為-NH、-NH2的伸縮振動(dòng)峰；1650～1560 cm?1的峰為-NH2的伸縮振動(dòng)峰；1580～1491 cm?1為-NH-的吸收峰；1380 cm?1處的吸收峰為CH3-對(duì)稱彎曲振動(dòng)，1150～1070 cm?1附近的峰推測(cè)為C-O-C的伸縮振動(dòng)引起的，可見DRC-NCs的表面含有O-H、CH3-、CH2-、-NH、-NH2、C-O-C等基團(tuán)。

XPS結(jié)果如圖3所示，DRC-NCs在284.25、399.17、531.28 eV處有明顯的3個(gè)峰（圖3-A），表明其主要含有C（66.99%）、N（3.74%）、O（28.89%）3種元素。圖3-B為C 1s的XPS圖譜，峰值在283.86、284.10、285.47、287.42 eV處，分別對(duì)應(yīng)C-C、C＝C、C-N/C-O、C＝N鍵。圖3-C為O 1s的XPS圖譜，530.67、532.01 eV處的峰分別對(duì)應(yīng)C＝O、C- OH鍵。圖3-D為N 1s的XPS圖譜，峰值在399.12、399.48 eV處，分別對(duì)應(yīng)C-N-C、N-C鍵[26-28]。

A-TEM圖 B-粒徑分布圖 C-HR-TEM圖 D-XRD圖譜 E-紫外光譜圖 F-熒光光譜圖 G-紅外光譜圖

a-DRC-NCs元素峰圖 b-碳 c-氧 d-氮

2.4 CCK-8實(shí)驗(yàn)

2.4.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 吸取RAW264.7細(xì)胞懸浮液10 μL，將其平鋪到細(xì)胞計(jì)數(shù)板上。計(jì)數(shù)完成后，將細(xì)胞懸浮液稀釋成1×105個(gè)/mL，然后將其鋪在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，邊緣加入100 μL/孔的PBS緩沖液，放入條件為5%、37 ℃的培養(yǎng)箱中孵育。培養(yǎng)24 h后，棄去上清液，在對(duì)照組中加入細(xì)胞培養(yǎng)基，給藥組中加入不同質(zhì)量濃度（10 000.00、5 000.00、2 500.00、1 250.00、625.00、312.50、156.25、78.13、39.06 μg/mL）的DRC-NCs溶液，放入培養(yǎng)箱中孵育24 h。取出細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入10 μL CCK-8試劑（空白組），于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)波長為450 nm處吸光度（）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率＝(e－b)/(c－b)

e、b、c分別表示在450 nm波長下給藥組、空白組、對(duì)照組的吸光度（）

2.4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 從表1可以看出，在DRC-NCs質(zhì)量濃度為2 500.00 μg/mL時(shí)，細(xì)胞活力已超過對(duì)照組的100%，而當(dāng)DRC-NCs質(zhì)量濃度大于2 500.00 μg/mL時(shí)DRC-NCs對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞的活性有一定的影響，即在大于該質(zhì)量濃度時(shí)DRC-NCs有一定的細(xì)胞毒性作用。而在質(zhì)量濃度低于2 500.00 μg/mL時(shí)，DRC-NCs對(duì)細(xì)胞有一定的促增殖作用。對(duì)DRC-NCs進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)有利于其進(jìn)一步的開發(fā)和利用。

2.5 DRC-NCs對(duì)UC的作用

2.5.1 造模及給藥 將雄性SD大鼠隨機(jī)分為6組，分別為空白組、模型組、陽性藥組（SASP組，將SASP研碎后，用去離子水配成42 mg/mL的混懸液）及DRC-NCs低、中、高劑量組?？瞻捉M以等量0.9%氯化鈉溶液灌腸，其余各組參照文獻(xiàn)方法[29]制備大鼠的UC模型，大鼠禁食不禁水12 h后，以4%的水合氯醛溶液腹腔注射以麻醉大鼠，將一次性的灌腸硅膠管插入大鼠肛門大約8 cm處，緩慢推入TNBS/乙醇溶液（5% TNBS溶液與50%乙醇溶液等體積配制，現(xiàn)用現(xiàn)配），劑量為3 mL/kg。造模成功后，空白組及模型組給等體積生理鹽水；SASP組給SASP混懸液420 mg/kg；DRC-NCs低、中、高劑量組（1、2、4 mg/kg）分別經(jīng)ig給DRC-NCs溶液0.01 mL/g。每日1次，共給藥7 d。末次給藥后12 h，禁食不禁水，腹主動(dòng)脈取血，脫頸處死大鼠，距離肛門2 cm處收集結(jié)腸組織，剪取適量結(jié)腸組織，用4%多聚甲醛固定，其余結(jié)腸組織置于?80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 不同質(zhì)量濃度的DRC-NCs對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率的影響(, n = 6)

2.5.2 大鼠一般情況與疾病活動(dòng)指數(shù)（disease activity index，DAI） 每日定時(shí)稱量大鼠體質(zhì)量并觀察其精神狀態(tài)、飲食、活動(dòng)、皮毛光澤、大便性狀、便血等情況，按照表2進(jìn)行DAI評(píng)分[30]?？瞻捉M大鼠精神狀態(tài)良好，飲食正常，反應(yīng)靈敏，動(dòng)作敏捷，毛發(fā)干凈有光澤，大便正常，墊料干燥且無明顯臭味，鼠籠干凈。模型組大鼠精神萎靡，飲食量減少，反應(yīng)遲鈍，活動(dòng)度差，毛發(fā)黯淡缺乏光澤，大便稀溏，有時(shí)可見肉眼膿血便，墊料濕潤且有明顯的臭味，鼠籠清潔度差。SASP組及DRC-NCs組大鼠精神狀態(tài)可，較模型組有很大改善，飲食量增加，活動(dòng)度增加，毛發(fā)逐漸恢復(fù)光澤，大便逐漸成形，鼠籠清潔度一般。

各組大鼠的DAI評(píng)分如表3所示。給藥第1天，各組大鼠的DAI評(píng)分大致在同一水平上，給藥第2、3天，模型組和DRC-NCs低劑量組的DAI評(píng)分呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢(shì)，在第4～7天DAI評(píng)分逐漸下降；SASP組、DRC-NCs中、高劑量組從第2天給藥起，DAI評(píng)分呈下降趨勢(shì)，至第7天DAI評(píng)分明顯低于模型組。DRC-NCs可以顯著降低模型大鼠的DAI，對(duì)UC有一定的治療作用。

2.5.3 結(jié)腸組織病理學(xué)觀察 結(jié)腸組織充分固定后，脫水，石蠟包埋切片，脫蠟后HE染色，用光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)腸組織的潰瘍、炎性細(xì)胞浸潤等病理學(xué)特征。各組大鼠結(jié)腸組織病理切片如圖4所示?？瞻捉M大鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)完整，黏膜細(xì)胞排列整齊，未見有炎性細(xì)胞浸潤。模型組大鼠結(jié)腸黏膜增厚，黏膜不完整，細(xì)胞排列不規(guī)則，有大量紅細(xì)胞及炎性細(xì)胞浸潤，肌層增厚。SASP組大腸黏膜不完整，細(xì)胞排列稀疏，有少量紅細(xì)胞及炎性細(xì)胞浸潤。DRC- NCs低劑量組大鼠結(jié)腸黏膜增厚，細(xì)胞排列不規(guī)則，細(xì)胞間有炎性細(xì)胞及少量紅細(xì)胞浸潤。DRC-NCs中劑量組大鼠結(jié)腸黏膜增厚，黏膜上皮較為完整，腺體排列較為規(guī)則，炎性細(xì)胞浸潤明顯減少。DRC-NCs高劑量組大鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)基本正常，稍有增厚，細(xì)胞排列較為整齊，炎性細(xì)胞浸潤明顯減少。

表2 DAI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

Table 2 DAI scoring criteria

得分體質(zhì)量下降率大便性狀便血情況 0＜1%正常（成形）陰形 1[1%，5%)介于兩者之間介于兩者之間 2[5%，10%)松散，呈糊狀，半成形隱血 3[10%，15%)介于兩者之間介于兩者之間 4≥15%稀水樣血便

表3 DRC-NCs對(duì)UC大鼠DAI評(píng)分的影響(, n = 8)

與空白組比較：##＜0.01；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01，表5、6同

##< 0.01control group;*< 0.05**< 0.01model group, same as tables 5 and 6

圖4 DRC-NCs對(duì)UC大鼠結(jié)腸組織病理改變的影響(×100)

2.5.4 胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)計(jì)算 免疫因素在UC的發(fā)病中占有重要的作用，脾臟和胸腺作為重要的免疫器官，測(cè)定胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)可以了解到機(jī)體的免疫情況。

胸腺指數(shù)＝胸腺質(zhì)量/大鼠體質(zhì)量

脾臟指數(shù)＝脾臟質(zhì)量/大鼠體質(zhì)量

模型大鼠的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)如表4所示。與空白組相比，模型組的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均降低，提示TNBS/乙醇溶液造的UC模型對(duì)大鼠的免疫系統(tǒng)有一定的抑制作用。與模型組相比，SASP組（＞0.05）與DRC-NCs組（＜0.01）胸腺指數(shù)均升高；SASP組及DRC-NCs低、中、高劑量組脾臟指數(shù)均能明顯升高（＜0.05、0.01），提示SASP與DRC- NCs對(duì)模型大鼠的免疫系統(tǒng)有一定的干預(yù)作用。

表4 DRC-NCs對(duì)UC大鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)的影響(, n = 8)

2.5.5 結(jié)腸組織中細(xì)胞因子水平 用ELISA法測(cè)定各組大鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-6、IL-10的水平。各組大鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-6、IL-10的水平如表5所示。與空白組相比，模型組大鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-6的水平升高（＜0.01）；與模型組相比，SASP組、DRC-NCs低、中、高劑量組大鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-6的水平均降低（＜0.05、0.01）。模型組大鼠結(jié)腸組織中IL-10的水平較空白組降低（＜0.01）；與模型組相比，SASP組、DRC-NCs中、高劑量組大鼠結(jié)腸組織中IL-10的水平均升高（＜0.01），DRC-NCs低劑量組升高不明顯（＞0.05）。綜上，SASP和DRC-NCs可以降低UC大鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-6的水平，升高IL-10的水平，且尤以DRC-NCs中劑量組效果最佳。

表5 DRC-NCs對(duì)UC大鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-6、IL-10水平的影響(, n = 8)

2.5.6 抗氧化水平 精準(zhǔn)稱取大鼠結(jié)腸組織的質(zhì)量，在冰水浴中按照組織質(zhì)量-生理鹽水體積（1∶9）的比例制備組織勻漿液，并用高速冷凍離心機(jī)（3000 r/min，離心半徑7.75 cm）離心10 min，取上清液按照試劑盒的說明，測(cè)定SOD活力、MDA的含量及MPO活力。各組大鼠結(jié)腸組織中SOD活力、MDA含量及MPO活力如表6所示。與空白組相比，模型組大鼠結(jié)腸組織中SOD的活力明顯降低（＜0.01）；與模型組相比，SASP組及DRC-NCs中、高劑量組大鼠結(jié)腸組織中SOD的活力均升高（＜0.01），DRC-NCs低劑量組與模型組無差異。模型組大鼠結(jié)腸組織中MDA含量和MPO活力較空白組顯著升高（＜0.01）；與模型組相比，SASP組及DRC-NCs中、高劑量組大鼠結(jié)腸組織中MDA含量和MPO活力均降低（＜0.05、0.01），DRC-NCs低劑量組MPO活性明顯降低（＜0.01）?？梢?，DRC-NCs在一定程度上可以降低UC大鼠結(jié)腸組織中MDA含量和MPO活力，提高SOD活力，減輕氧化應(yīng)激對(duì)結(jié)腸組織的損傷。

表6 DRC-NCs對(duì)UC大鼠結(jié)腸組織中SOD、MDA、MPO水平的影響(, n = 8)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)借助納米技術(shù)，首次發(fā)現(xiàn)生地黃炭中含有納米類成分，進(jìn)一步對(duì)其表征發(fā)現(xiàn)，DRC-NCs分散度良好，為近球形且粒徑大小均一，粒徑分布集中在1.1～2.6 nm，晶格間距為0.354 nm，具有紫外和熒光光學(xué)特性，主要由C、N、O等元素構(gòu)成，表面可能含有氨基、羥基、羧基等基團(tuán)，這些基團(tuán)可能與DRC-NCs發(fā)揮藥效活性有著密切的關(guān)系。

HPLC結(jié)果表明，排除了小分子物質(zhì)的干擾。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DRC-NCs的細(xì)胞毒性很低，安全質(zhì)量濃度在2 500.00 μg/mL以內(nèi)。UC動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DRC-NCs可以改善大鼠的一般情況并顯著降低DAI評(píng)分，提高胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)，減輕結(jié)腸損傷，表明DRC-NCs對(duì)UC具有一定的治療作用。

炎癥反應(yīng)常能誘發(fā)或加重UC。IL-6是參與炎癥反應(yīng)的主要細(xì)胞因子，在機(jī)體受炎癥刺激后大量分泌，IL-6過度表達(dá)能夠增加腸上皮細(xì)胞通透性，加重腸道的炎癥反應(yīng)，研究發(fā)現(xiàn)UC活動(dòng)期患者的IL-6水平明顯增加，且與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，經(jīng)過治療癥狀好轉(zhuǎn)后，其水平將會(huì)下降[31-33]，但仍然超出正常范圍[34]。

TNF-α可促進(jìn)血小板活化因子的釋放，從而生成白三烯和氧自由基，并誘導(dǎo)合成NO，加重腸黏膜的損傷，誘導(dǎo)腸道上皮細(xì)胞凋亡[35-36]，此外，可以引起中性粒細(xì)胞聚集，刺激淋巴細(xì)胞，使得IL-8等炎癥因子表達(dá)增加[37]，加重結(jié)腸黏膜組織的炎癥浸潤。研究發(fā)現(xiàn)未經(jīng)治療的UC患者TNF-α基因的表達(dá)較正常對(duì)照組明顯增加[38]。IL-10是抗炎性細(xì)胞因子，其含量的減少可加重促炎性細(xì)胞因子對(duì)腸黏膜的損害，使得腸黏膜局部免疫功能紊亂，腸道功能失調(diào)而發(fā)生炎癥和毒性反應(yīng)[39]。研究表明UC患者活動(dòng)期體內(nèi)的IL-10水平明顯低于正常水平，且隨著病情的加重而減少[40-41]，而緩解期IL-10的含量開始升高，因此，IL-10可以作為判斷UC病情及預(yù)后的關(guān)鍵指標(biāo)之一[42]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DRC-NCs對(duì)炎性細(xì)胞因子的水平有一定的影響，可以下調(diào)促炎細(xì)胞因子TNF-α及IL-6的水平，且上調(diào)抗炎細(xì)胞因子IL-10的水平，調(diào)整促炎因子和抑炎因子間的平衡，從而減輕結(jié)腸損傷。

過度的氧化應(yīng)激是UC又一重要發(fā)病因素。MDA含量通常反映體內(nèi)氧化應(yīng)激的程度，當(dāng)體內(nèi)的氧自由基含量過高時(shí)，引起細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生大量MDA等過氧化產(chǎn)物，引起細(xì)胞損傷[43-44]。研究顯示UC患者血清中MDA含量明顯升高[45-46]。SOD作為體內(nèi)重要的自由基清除劑[47]，其活性水平常受MDA等過氧化產(chǎn)物的含量的影響，當(dāng)機(jī)體產(chǎn)生大量氧自由基后，SOD大量消耗，活性水平降低，因此，結(jié)腸組織的損傷程度可通過檢測(cè)MDA含量和SOD活性水平判斷[48]。MPO是髓細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，主要存在于中性粒細(xì)胞中，少部分存在于單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中，是中性粒細(xì)胞的衍生蛋白，當(dāng)機(jī)體受到感染或者炎癥刺激時(shí)，中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞就會(huì)釋放出大量的MPO，使機(jī)體的炎癥反應(yīng)增強(qiáng)。因此，MPO的活性可以反映中性粒細(xì)胞在組織的浸潤程度[49]，間接反映機(jī)體的炎癥水平。此外，MPO可產(chǎn)生氧自由基，加重對(duì)組織的損傷[50]。本研究顯示，DRC-NCs可以降低大鼠結(jié)腸組織中MDA的含量及MPO的活力，提高SOD的活力，以增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力，減輕氧化應(yīng)激對(duì)結(jié)腸組織的損傷從而治療UC。

本研究首次利用高溫?zé)峤夥◤纳攸S炭中提取出新型納米類成分DRC-NCs，并且發(fā)現(xiàn)DRC-NCs對(duì)UC具有良好的治療作用，其作用機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)免疫及緩解炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕結(jié)腸損傷程度而發(fā)揮治療作用。本研究為UC的治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為中藥的開發(fā)利用提供了全新的探索模式。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Discovery of driednano-components and their therapeutic effect on ulcerative colitis

CHEN Rui1, 2, ZHAO Jin-li1, KONG Ruo-lan1, ZHOU Long1, YANG Ying-xin1, KONG Hui1, ZHAO Yan1

1. School of Traditional Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China 2. Department of Preventive Treatment of Disease, Jiangxi Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Nanchang 330000, China

To discover and extract driednano-components (DRC-NCs) from dried(DRC), and evaluate its therapeutic effect and possible mechanism in rats with ulcerative colitis (UC) induced by 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid/ethanol solutionts.The driedwas calcined in a muffle furnace at a high temperature to obtain DRC, which was extracted, filtered and dialyzed to obtain DRC-NCs. Transmission electron microscopy, X-ray diffraction, UV-Vis spectroscopy, fluorescence spectrum, Fourier transform infrared spectroscopy and X-ray photoelectron spectroscopy were used to characterize DRC-NCs, and CCK-8 cytotoxicity assay was used to evaluate the safety of DRC-NCs. According to the rat with UC model, the general condition, disease activity index (DAI), colon tissue injury degree, thymus index, spleen index, the content of tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-6 (IL-6), IL-10, malondialdehyde (MDA), and the activity of myeloperoxidase (MPO), and superoxide dismutase (SOD) in the colon tissues of rats were compared to evaluate the therapeutic effect of DRC-NCs and its mechanism.DRC-NCs were well dispersed under TEM, nearly spherical appearance with uniform particle size, with a particle size distribution concentrated at 1.1—2.6 nm and a lattice spacing of 0.354 nm, mainly composed of elements such as C, N and O, and the surface contained amino, hydroxyl and carboxyl groups. DRC-NCs had low cytotoxicity and the safe mass concentration was within 2 500.00 μg/mL. Results of animal experiments showed that DRC-NCs could improve the general condition of model rats, significantly reduce DAI score, alleviate colon injury, and increase thymus index and spleen index. DRC-NCs could decrease the contents of TNF-α and IL-6, increase the content of IL-10, decrease the content of MDA and the activity of MPO in colon tissue, and increase the activity of SOD.DRC-NCs had a certain therapeutic effect on UC, and its mechanism may be related to reducing the levels of inflammatory factors and oxidative stress, and improving the anti-inflammatory and antioxidant capacity. This research not only provides a unique research angle for the exploration and development of Chinese herbal charcoal drugs, but also provides an experimental basis for the clinical application of DRC in the treatment of UC.

dried; nano-components; material basis; ulcerative colitis; inflammatory cytokines; oxidative stress; characterization; nanomaterials

R283.6

A

0253 - 2670(2023)16 - 5172 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.16.006

2023-02-17

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目（2019-JYB-TD-001）

陳 瑞，女，碩士研究生，研究方向?yàn)榻?jīng)典方劑的配伍與應(yīng)用。E-mail: rchen3219@163.com

孔 慧（1976—），女，碩士生導(dǎo)師，副研究員，研究方向?yàn)橹兴幪克幬镔|(zhì)基礎(chǔ)研究。Tel: (010)64286705 E-mail: doris7629@126.com

趙 琰（1973—），女，博士生導(dǎo)師，教授，研究方向?yàn)榻?jīng)典方劑的配伍與應(yīng)用及中藥炭藥的物質(zhì)基礎(chǔ)研究。Tel: (010)64286705 E-mail: zhaoyandr@bucm.edu.cn

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]