楊麗楠,常樂,李志艷,閆存玲,曾爭,馮珍如

(1.太原市第三人民醫(yī)院檢驗科,太原030012;2.北京大學第一醫(yī)院a.檢驗科,b.感染疾病科,北京100034)

機體乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)陽性表示乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的感染,乙型肝炎病毒表面抗體(hepatitis B surface antibody,HBsAb)的出現表示具備對HBV的免疫力,預示著HBV的清除和HBsAg的消失。然而,臨床上存在一小部分慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)患者,其血清中能夠同時檢測到HBsAg和HBsAb,即HBsAg和HBsAb雙陽性者,為臨床診斷和判定CHB患者的疾病狀態(tài)帶來困擾。

CHB患者HBsAg和HBsAb共存機制的既往研究主要集中在HBV S基因突變、不同血清型HBV感染、HBV再活動以及HBsAg/HBsAb免疫復合物的形成[1]。近年來研究發(fā)現HBsAg新增N-糖基化突變、HBV準種多樣性、宿主遺傳基因的突變和免疫組庫表達的差異也可能與HBsAg和HBsAb的共存有關。本文旨在綜述CHB患者HBsAg和HBsAb雙陽共存機制的新近研究。

1 HBsAg新增N-糖基化突變

病毒包膜N-糖基化是一種翻譯后修飾,其修飾位點需有一致的氨基酸序列N-X-S/T(N為天冬酰胺,X為脯氨酸以外的任意氨基酸,S為絲氨酸,T為蘇氨酸),在病毒的生物合成、穩(wěn)定性、抗原性和傳染性方面發(fā)揮重要作用。HBsAg蛋白在分泌過程中需要經過N-糖基化修飾,尤其是sN146位的糖基化修飾,其對HBsAg分泌最為重要,能夠幫助HBsAg蛋白正確折疊,增加其穩(wěn)定性和親水性,維持其抗原性[2]。

有研究報道顯示,HBsAg新增的N-糖基化可導致過度糖基化,掩蓋HBsAg抗原表位“a”決定簇,降低中和抗體的結合能力,造成免疫逃逸[3-4]。盧姍姍等[5]研究發(fā)現,HBsAg和HBsAb雙陽性患者HBsAg新增N-糖基化突變率顯著高于HBsAg單陽性患者,體外試驗顯示HBsAg抗原性降低,與中和抗體HBsAb結合能力下降,造成血清中HBsAg和HBsAb共存。另外,CHB患者HBsAg和HBsAb雙陽者,HBV S基因主要親水區(qū)(major hydrophilic region,MHR)新增的N-糖基化突變可能是肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)發(fā)生的危險預測指標[6]。

2 HBV準種多樣性

在HBV復制過程中,由于逆轉錄酶缺乏校正功能,無法對錯配的堿基進行校正,同時HBV的復制能力極強,從而導致HBV基因組高度變異,在HBV感染者體內形成一群基因序列相似但又存在差異的病毒株,稱之為準種(quasispecies)[7]。既往研究只從部分HBV基因組的角度來研究HBsAg和HBsAb的共存,難以全面反映HBsAg和HBsAb共存與HBV基因組間的關系。

高通量測序技術可以研究HBV基因組的全長,發(fā)現準種特征。Zhou等[8]評估HBsAg和HBsAb雙陽實驗組和HBsAg單陽對照組的HBV全基因組準種特征,發(fā)現雙陽實驗組HBV準種多樣性顯著增加,且觀察到更多的陽性選擇位點、突變和缺失,突變多位于人類白細胞抗原Ⅰ類分子(human leukocyte antigen Ⅰ,HLA Ⅰ)、HLA Ⅱ或B細胞表位,表明積累突變可能為HBV提供逃避宿主免疫攻擊的機會。

準種的變異譜在疾病的不同時期具有不同的適應度[9]。Wang等[10]利用二代測序和生物信息學技術,分析HBV基因C型的HBsAg和HBsAb共存患者HBV S區(qū)準種特征,發(fā)現HBsAg和HBsAb共存患者組與HBsAg單陽組準種特征有顯著差異,HBV S區(qū)細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)表位的免疫原性和主要親水區(qū)(main hydrophilic region, MHR)的抗原性均下降,且HBsAg和HBsAb共存的CHB患者與HBV相關HCC患者之間的準種特征也有差異,存在不同的突變位點,如CHB中的I126S和HCC中的I126T。因此,準種特征的差異表達對HBV感染轉歸有影響。

3 宿主遺傳基因的突變

既往CHB患者HBsAg和HBsAb共存的研究主要集中在HBV的因素上。然而,一些報道的病例存在HBsAg序列突變,但血清中沒有檢測到HBsAb[11];也有一些沒有HBsAg突變的病例同時存在HBsAg和HBsAb[4]。這表明HBV突變體可能不是慢性HBV患者發(fā)生HBsAg與HBsAb共存的唯一原因。為了探討HBsAg和HBsAb共存機制的其他因素,有研究團隊進行了宿主因素方面的研究。

全基因組關聯(lián)研究(genome wide association studies,GWAS)可以用來探索遺傳基因變異與復雜疾病的關聯(lián),識別復雜疾病易感性與抗性相關基因位點。Wang等[12]用GWAS進行兩階段試驗,第一階段全基因測序發(fā)現HBsAg和HBsAb共存CHB患者的候選基因,第二階段進行候選基因特定區(qū)域直接測序的驗證試驗,發(fā)現HBsAg和HBsAb共存CHB患者12號染色體存在寡聚核苷酸合成酶3(oligoadenylate synthetases 3,OAS3)基因的罕見變異。

為了進一步揭示宿主其他相關基因與HBsAg和HBsAb共存是否有關,Fan等[13]在前者第一階段試驗的基礎上,根據P值選擇30個與HBV相關肝病有關的候選基因,擴大HBsAg和HBsAb雙陽組和HBsAg-和HBsAb+對照組的驗證樣本數,通過飛行時間質譜法(time of flight mass spectrometry,TOF)確認遺傳基因,發(fā)現位于9號染色體的胞質分裂蛋白8(dedxcator of Gytokmesis 8,DOCK8)等位基因(rs506121-T)和碳酸酐酶9(carbonic anhydrase 9,CA9)等位基因(rs2071676-A)在HBsAg和HBsAb共存CHB患者中表達升高。以上研究均表明,宿主遺傳基因與CHB患者HBsAg和HBsAb雙陽的產生有一定的關系。

4 宿主免疫組庫(immune repertoire,IR)表達的差異

IR是T細胞受體(T cell receptor,TCR)和B細胞受體(B cell receptor,BCR)(也稱為免疫球蛋白,Ig)的總和,構成機體的適應性免疫系統(tǒng)[14]。

TCR是T細胞特異性識別和結合抗原肽-主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex, MHC)復合物的分子結構,大多數TCR由α和β肽鏈組成,少數T細胞的TCR由γ和δ肽鏈組成。每條肽鏈又可分為可變區(qū)(V 區(qū))、恒定區(qū)(C 區(qū))、跨膜區(qū)和胞質區(qū)等幾部分。而α和β 2條肽鏈的V 區(qū)(Vα、Vβ)又各有3個高變區(qū)CDR1、CDR2、CDR3,其中以CDR3變異最大,直接決定了TCR的抗原結合特異性。TCR的CDR3由V、D、J 3個基因編碼,在淋巴細胞的成熟過程中,通過V、D、J 基因的隨機選擇和重組,連接區(qū)多樣性和α/β或γ/δ鏈配對形成了TCR的多樣性[15-17]。

BCR是一種Y型蛋白,由2條相同的大重鏈(IGH)和2條相同的小輕鏈κ(IGK)或λ(IGL)組成。重鏈可變區(qū)由V、D和J基因家族編碼,輕鏈可變區(qū)由V和J基因家族編碼[18]。在B細胞發(fā)育和成熟過程中,V(D)J基因片段的隨機重組是由幾個酶樣重組激活基因(RAG1/RAG2)介導,V-D和D-J(輕鏈的V-J)連接區(qū)域的隨機插入或刪除有助于BCR的多樣性[19-20]?？乖碳ず?會引起體細胞的高頻突變,主要是在編碼V區(qū)CDR部位的基因序列發(fā)生堿基的點突變。除此之外,基因轉錄和重鏈/輕鏈配對也提高了BCR的多樣性[14]。

免疫組庫測序(immune repertoire sequencing,IRS)可以用來探索宿主免疫系統(tǒng)抵御HBV感染的遺傳反應和免疫特征。常樂等[21]研究HBsAg和HBsAb共存CHB患者TCR β鏈CDR3免疫組庫,發(fā)現V基因型TRBV5-8的表達低于HBsAg-和HBsAb+對照組,V基因型TRBV28低于HBsAg+和HBsAb-對照組;進一步在克隆層面分析發(fā)現,克隆型TRBV7-2/TRBD1/TRBJ2-1在共存組的表達高于HBsAg-和HBsAb+對照組,而克隆型TRBV7-3/TRBD1/TRBJ2-7的表達低于HBsAb-和HBsAb+對照組,說明機體免疫系統(tǒng)表達的差異與HBsAg和HBsAb雙陽模式存在一定的關聯(lián)。

隨后,Zhan等[22]擴大HBsAg+和HBsAb+雙陽實驗組和HBsAg-和HBsAb+以及HBsAg+和HBsAb-對照組入組標本數,分析HBsAg和HBsAb共存CHB患者的TCR β鏈和BCR免疫組庫表達情況,發(fā)現一些V、D和J基因型如IGHV3-64、IGHV3-75、TRBV5-4、TRBV12-5、TRAV14DV4、IGHD3-16、IGHD6-13和IGHJ3,對應表達這些基因型的細胞,尤其是B淋巴細胞,在HBsAg和HBsAb共存患者中擴展程度不同。用序列預測工具發(fā)現“CASSLG”基序在HBsAg和HBsAb雙陽患者實驗組中表達量增加,“GAGPLT”基序只在HBsAg-和HBsAb+健康對照組出現,其可能與HBsAb中和抗體的產生有關。這些研究可能為HBV疫苗的研發(fā)和CHB的治療提供重要參考價值。

5 預后與管理

CHB患者HBsAg和HBsAb共存現象在臨床上越來越多見,且這種雙陽模式的CHB較易發(fā)展為進展期肝病,如肝纖維化、肝硬化和HCC[23-24]。另外,這一情況增加了患者的治療難度,其治愈率也較低[25]。因此,臨床醫(yī)生遇到CHB患者血清中同時出現HBsAg和HBsAb時,對這種雙陽模式的患者要多關注并定期復查,并結合其他檢測指標(如生物化學指標、HBV DNA檢測和影像學檢查等)來評估和判斷患者的臨床狀態(tài),據此調整患者的治療方案。實驗室工作人員發(fā)現HBsAg和HBsAb檢測結果同時陽性時,應進行審核分析。首先要排除標本和檢測程序的問題,通過復測、留樣再測及動態(tài)監(jiān)測等過程,準確發(fā)送檢驗報告。在這個過程中,及時與臨床溝通?？傊?對于此類患者,要加強跟蹤隨訪,密切關注不良肝臟相關疾病的發(fā)生。