王璽惠 陳依 俞衛(wèi)鋒

凋亡是生物體內(nèi)細胞進行的自發(fā)、有序的死亡過程，它在維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)細胞增殖周期中發(fā)揮重要作用[1]。細胞凋亡不僅存在于胚胎發(fā)育、細胞分化、組織再生、器官發(fā)生等各個生理階段，也發(fā)生于腫瘤、免疫缺陷、器官萎縮等病理過程中[2]。細胞凋亡伴隨著細胞核固縮、碎裂向細胞質(zhì)釋放，隨后形成含固縮核碎片的囊泡分泌到細胞外，同時凋亡細胞也會分泌一種僅包含細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)致密的圓形囊泡。它們被巨噬細胞或鄰近細胞吞噬或隨細胞外液向遠處傳遞[3]。在隨后的研究中，人們發(fā)現(xiàn)這些囊泡可以作為凋亡細胞產(chǎn)生的重要細胞通信載體，參與調(diào)節(jié)凋亡細胞對自身和周圍細胞的凋亡和再生過程，以及影響病理狀態(tài)下組織的炎癥反應(yīng)和腫瘤發(fā)展[4]。細胞外囊泡是細胞分泌的各種球狀或杯狀的含有質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的囊泡，可分為外泌體、微囊泡和凋亡小體3 種類型[5]。凋亡胞外囊泡（apoptotic extracellular vesicles，Apo-EVs）是微囊泡的一種特殊亞型，與其他囊泡在形成、結(jié)構(gòu)和功能等方面均有差異。盡管Apo-EVs 在直徑上與外泌體有部分重疊，但它們的分泌方式并不相同，相比于外泌體需要通過內(nèi)吞體分選復(fù)合體機制和腔內(nèi)囊泡機制分泌到細胞外，Apo-EVs 可以直接從凋亡細胞的質(zhì)膜脫落產(chǎn)生[6]。此外，Apo-EVs 與凋亡小體均產(chǎn)生于凋亡細胞，但是凋亡小體的直徑通常＞1 μm，并且包含大量核糖體RNA，而Apo-EVs 直徑0.05～1 μm，主要包含非核糖體非編碼RNA 比如內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄因子RNA、非編碼RNA 以及Alu 重復(fù)序列等[7]。Apo-EVs作為凋亡細胞的特有產(chǎn)物，一方面攜帶與凋亡相關(guān)的標志物，一方面攜帶供體細胞的蛋白、脂質(zhì)、核酸以及細胞器[8]。因此，Apo-EVs 既可以協(xié)助巨噬細胞清除凋亡產(chǎn)物[9]，也可以轉(zhuǎn)運生物活性分子（如蛋白質(zhì)和核酸）或?qū)⒐w細胞產(chǎn)生的信號進行傳遞，實現(xiàn)細胞-細胞間交流[10]，在凋亡細胞清除、細胞再生、免疫反應(yīng)調(diào)控、腫瘤生長調(diào)節(jié)等病理生理過程中發(fā)揮重要作用。

1 Apo-EVs 的形成與分泌調(diào)節(jié)

1.1 Apo-EVs 的形成 細胞凋亡程序通過半胱氨酸蛋白酶（Caspase）激活啟動[11]，當(dāng)細胞收到凋亡信號后，會發(fā)生明顯的形態(tài)學(xué)變化：細胞收縮、細胞核和染色質(zhì)凝結(jié)、細胞核和細胞器破裂、細胞膜脫落和囊泡形成[12]。凋亡囊泡的形成發(fā)生在細胞凋亡末期，分為3 個階段。第一階段：凋亡囊泡形成的啟動階段，該階段涉及多個凋亡相關(guān)的信號通路的調(diào)控作用，具體機制尚不明確，已經(jīng)確定的有Caspase 介導(dǎo)的ROC 相關(guān)激酶-Ⅰ（Rho-associated kinase-Ⅰ，ROCK-Ⅰ）和p21活化蛋白激酶-2 裂解，激活下游效應(yīng)因子Rho 和Rac/Cdc42，參 與 囊 泡 的 形 成[13]。Caspase-3 通 過 切 割ROCK-Ⅰ，促使LIM 激酶1 磷酸化激活，進而誘導(dǎo)絲切蛋白磷酸化，以調(diào)節(jié)肌動蛋白重組[13-14]。第二階段：囊泡形成階段，信號分子促使肌動蛋白-肌球蛋白系統(tǒng)產(chǎn)生收縮力，協(xié)助DNA 片段從核區(qū)域進入細胞質(zhì)。伴隨細胞局部靜水壓力的改變，細胞膜局部膨大突起，細胞特異性細胞質(zhì)在質(zhì)膜上形成紡錘形結(jié)構(gòu)[15]。同時，功能微管促進核收縮，使核內(nèi)或胞內(nèi)物質(zhì)進入突起膜泡結(jié)構(gòu)成為核周多囊內(nèi)體[16]。第三階段：Apo-EVs 分泌階段，質(zhì)膜與肌動蛋白皮質(zhì)分離并繼續(xù)擴張，與此同時肌動蛋白皮質(zhì)在質(zhì)膜下迅速重新組裝，阻止質(zhì)膜的持續(xù)膨脹。在這種擴張和收縮的雙重調(diào)節(jié)下，細胞碎片被包裝成凋亡囊泡[17]。此外，凋亡囊泡的生物形成還伴隨著細胞脂質(zhì)雙分子層磷脂酰絲氨酸的外翻并與Annexin V 結(jié)合[18]。因此，Apo-EVs 表面會特異性表達與凋亡相關(guān)的信號分子，如磷脂酰絲氨酸、Annexin V、Caspase 3、鈣網(wǎng)蛋白和核纖層蛋白B1[19]。

1.2 Apo-EVs 的分泌調(diào)節(jié) Apo-EVs 的分泌主要依賴于細胞凋亡調(diào)節(jié)信號或肌動蛋白運動抑制劑等。Caspase 抑制劑能夠抑制與凋亡發(fā)展相關(guān)的核變化，并且不增加細胞膜的通透性，表明抑制Caspase 不會誘導(dǎo)細胞轉(zhuǎn)向壞死，而是通過抑制凋亡的方式減少Apo-EVs 的產(chǎn)生[20]。ROCK-Ⅰ通過激活肌動蛋白-肌球蛋白收縮來驅(qū)動Apo-EVs 形成，因此，使用ROCK 抑制劑可以通過抑制該過程，進而抑制Apo-EVs 形成。此外，肌動蛋白聚合抑制劑和非肌肉肌球蛋白Ⅱ抑制劑作為干擾肌動蛋白-肌球蛋白收縮的藥物，也能抑制Apo-EVs 分泌。

2 Apo-EVs 的生物學(xué)功能

2.1 招募巨噬細胞和清除凋亡細胞及產(chǎn)物 細胞在凋亡過程中會釋放可溶性的“find-me”信號，驅(qū)使巨噬細胞向凋亡細胞遷移，同時也會釋放“eat-me”信號，促使巨噬細胞吞噬分解產(chǎn)物[21]。Apo-EVs 作為凋亡細胞釋放的囊泡，會攜帶部分“find-me”和“eat-me ”信號，協(xié)助凋亡細胞清除、減輕炎癥反應(yīng)以及維持穩(wěn)態(tài)[22]。據(jù)報道，飽和脂肪酸刺激的脂肪細胞會釋放Apo-EVs，它們刺激并趨化單核細胞和原代巨噬細胞，促使肥胖相關(guān)的巨噬細胞大量浸潤，這提示了Apo-EVs 可攜帶“find-me”信號在趨化巨噬細胞中起作用[23]。1-棕櫚酰-2-亞油酰-3-乙酰甘油（1-palmitoyl-2-linoleoyl-3-acetyl-rac-glycerol，PLAG）作為中性粒細胞分泌的Apo-EVs 所攜帶的“find-me”信號，促使巨噬細胞中P2Y2 受體從脂筏（一種富含膽固醇和鞘磷脂并與膜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)分選密切相關(guān)的微結(jié)構(gòu)域）轉(zhuǎn)向非脂筏質(zhì)膜域，激活巨噬細胞向中性粒細胞遷移，進而清除凋亡的中性粒細胞，減弱過度激活的免疫反應(yīng)以及繼發(fā)的慢性炎癥[24]。此外黏附分子、乳脂球表皮生長因子等也被證實是Apo-EVs 攜帶的“find-me”信號之一[25-26]。

Apo-EVs 也攜帶有“eat-me”信號的載體，促使凋亡細胞被清除。2 型糖尿病患者的間充質(zhì)干細胞可以分泌Apo-EVs，可攜帶鈣網(wǎng)蛋白作為一種重要的“eatme”信號，介導(dǎo)巨噬細胞內(nèi)吞Apo-EVs，促使巨噬細胞在轉(zhuǎn)錄水平上轉(zhuǎn)化為2 型糖尿病肝臟中的抗炎表型。最終可減緩包括葡萄糖不耐受和胰島素抵抗在內(nèi)的2 型糖尿病表型的疾病進展[27]。

2.2 促進組織再生 組織再生常伴隨著細胞的增殖、分化和凋亡。其中，凋亡在組織形態(tài)重塑中起到至關(guān)重要的作用[28]。凋亡細胞如干細胞、免疫細胞、前體細胞、成骨細胞和內(nèi)皮細胞等產(chǎn)生的胞外囊泡可以通過轉(zhuǎn)運生物活性分子，或者通過調(diào)節(jié)增殖相關(guān)信號通路的方式促進皮膚、骨骼、肌肉組織再生[29]。Ma 等[19]研究表明，Wnt/β-catenin 信號通路在皮膚和毛發(fā)發(fā)育中起著關(guān)鍵作用，而皮膚和毛囊的間充質(zhì)干細胞釋放的Apo-EVs 可以激活Wnt/β-catenin 通路，促進皮膚和毛囊代謝，加速傷口愈合和毛發(fā)生長。乳牙牙髓干細胞中的Apo-EVs 攜帶線粒體Tu 翻譯延伸因子，被內(nèi)皮細胞內(nèi)化后上調(diào)血管生成相關(guān)因子的表達，增強內(nèi)皮細胞血管生成的能力，促進牙髓血管重建和組織再生[30]。在病理情況下，Apo-EVs 也有促進細胞增殖和組織修復(fù)的作用。凋亡的內(nèi)皮細胞釋放富含腫瘤易感基因101 和翻譯控制腫瘤蛋白的Apo-EVs，它們在血管平滑肌細胞中產(chǎn)生細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶依賴的抗凋亡作用，并促進血管修復(fù)[31]。宮頸癌細胞系Hela 細胞，釋放富含CT10 相關(guān)激酶Ⅰ的Apo-EVs，并將其傳遞給鄰近細胞，通過激活c-Jun 氨基末端激酶的方式發(fā)揮促進細胞增殖的作用[32]?？傊?，凋亡細胞分泌的Apo-EVs不僅有助于組織的生長和修復(fù)，還會影響腫瘤的生長。

2.3 調(diào)控炎癥反應(yīng) 死亡細胞或損傷組織介導(dǎo)的損傷相關(guān)分子模式（damage associated molecular patterns,DAMPs）可以刺激周圍的細胞或組織誘發(fā)非感染性炎癥（即無菌性炎癥）。過去人們認為DAMPs 是細胞壞死導(dǎo)致的，然而最新的研究發(fā)現(xiàn)，在特定條件下，尤其是當(dāng)組織發(fā)生大量繼發(fā)性凋亡或免疫原性細胞死亡時，凋亡細胞也會誘導(dǎo)炎癥或免疫原性反應(yīng)[33]，并且這種作用與凋亡細胞釋放的Apo-EVs 有關(guān)[10]。

Apo-EVs 攜帶凋亡細胞的抗原，如自身免疫抗原、病原體抗原、腫瘤相關(guān)抗原，將其傳遞給免疫細胞，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。由于Apo-EVs 高表達磷脂酰絲氨酸，所以其可以更高效地被遞呈細胞吞噬[34]。在自身免疫性疾病中，Apo-EVs 通過微管結(jié)構(gòu)和肌球蛋白輕鏈激酶的作用，負載來自供體細胞的自身免疫病相關(guān)抗原[16]。通過這種方式，Apo-EVs 使自身抗體在體內(nèi)積累，導(dǎo)致免疫耐受功能失調(diào)，炎癥反應(yīng)加重。比如，干燥綜合征患者分泌的Apo-EVs，攜帶抗α-胞襯蛋白抗體、抗SS-A 抗體以及自身抗原h(huán)y1-RNA，并將其轉(zhuǎn)移給樹突狀細胞，進而影響參與非特異性免疫的Toll 樣受體-7/9的表達和促炎細胞因子的產(chǎn)生[35]。

感染細胞釋放的Apo-EVs 通過將感染因子抗原傳遞給抗原遞呈細胞，刺激機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。比如，結(jié)核分枝桿菌使CD1 陰性的巨噬細胞失去抗原遞呈能力并且誘導(dǎo)其凋亡，這些凋亡的巨噬細胞會釋放包含病原體抗原的Apo-EVs，并將其傳遞給未感染的樹突狀細胞以及活化的CD8 T 細胞，兩者作為抗原遞呈細胞，激活免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[36]。在病毒感染時，Apo-EVs 攜帶感染性病毒，并轉(zhuǎn)移給鄰近細胞，從而加快病毒的繁殖并保護其免受免疫系統(tǒng)攻擊或者導(dǎo)致免疫反應(yīng)異常并產(chǎn)生自身免疫反應(yīng)?；卓涎挪《靖腥镜腍ela 細胞凋亡并分泌攜帶病毒抗原的Apo-EVs，感染鄰近巨噬細胞，抑制其發(fā)揮炎癥保護作用，這提示了攜帶病原體抗原的Apo-EVs 不僅可以促使免疫細胞發(fā)生免疫反應(yīng)，也能促使機體對病原體形成免疫耐受[37]。

Apo-EVs 會觸發(fā)抗移植物抗體產(chǎn)生，加速排斥反應(yīng)。例如，凋亡的內(nèi)皮細胞產(chǎn)生Apo-EVs，通過攜帶20S 蛋白酶體誘導(dǎo)抗移植抗體的產(chǎn)生，增強了主要組織相容性復(fù)合體形成，并促進主動脈移植小鼠中抗移植抗體的產(chǎn)生和同種異體移植炎癥的形成[38]。

Apo-EVs 也可以通過攜帶免疫調(diào)節(jié)因子，直接作用于炎癥細胞，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的不同過程。比如，微血管內(nèi)皮細胞釋放的Apo-EVs 通過激活內(nèi)皮細胞NFκB 相關(guān)通路，促使內(nèi)皮細胞表達與細胞死亡、炎癥、分化和細胞運動相關(guān)的基因，從而產(chǎn)生抑制凋亡，改善傷口閉合，降低血管生成活性以及減少與內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)的內(nèi)皮標志物表達的作用[39]。凋亡細胞釋放的Apo-EVs 通過攜帶的DNA 等與人漿細胞樣樹突狀細胞上Toll 樣受體9 結(jié)合，促使其分泌干擾素-α，最終調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[40]。另有研究發(fā)現(xiàn)多核中性粒細胞釋放的Apo-EVs 協(xié)同TNF-α 參與促進巨噬細胞極化和炎癥反應(yīng)發(fā)生[41]。與之相反的是，骨髓間充質(zhì)干細胞中的Apo-EVs 通過AMPK/SIRTI/NF-κB 通路抑制促炎巨噬細胞極化以及TNF-α 分泌，抑制鄰近破骨細胞的形成[42]。間充質(zhì)干細胞來源的Apo-EVs 被巨噬細胞吞噬清除，隨后在轉(zhuǎn)錄水平誘導(dǎo)巨噬細胞重編程，調(diào)控肝巨噬細胞穩(wěn)態(tài)，促進巨噬細胞向抗炎癥表型轉(zhuǎn)化，從而延緩2 型糖尿病發(fā)展[27]。Hela 細胞釋放的Apo-EVs 攜帶鞘氨醇-1-磷酸受體1 和3 與巨噬細胞接觸后，誘導(dǎo)IL-1β分泌，促進炎癥反應(yīng)發(fā)生[10]。

2.4 影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展 在腫瘤組織中，Apo-EVs攜帶供體細胞內(nèi)容物或表面標志物，通過胞吞的方式將特異的信號傳遞給受體細胞，發(fā)揮調(diào)控腫瘤生長的作用。Apo-EVs 可以通過直接調(diào)節(jié)腫瘤細胞增殖或凋亡，或者間接地通過調(diào)節(jié)腫瘤間質(zhì)細胞或免疫細胞，改變腫瘤生長微環(huán)境的方式，影響腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。

Apo-EVs 直接作用于鄰近的腫瘤細胞，改變受體細胞增殖能力。膠質(zhì)母細胞分泌的Apo-EVs 富含各種剪接體成分RNA 結(jié)合基序蛋白11，它們具有改變受體細胞中的RNA 剪接的作用。因此，Apo-EVs 通過改變受體細胞RNA 剪接，促進腫瘤細胞增殖并增強其耐藥性[43]。

通過調(diào)節(jié)腫瘤生長微環(huán)境的方式，間接調(diào)節(jié)腫瘤生長也是Apo-EVs 的作用方式之一。上皮性卵巢癌細胞分泌的Apo-EVs 含有豐富的CD147，可以誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶形成，分解細胞外基質(zhì)，最終產(chǎn)生促進血管生成，加速惡性腫瘤發(fā)展的作用[44]。在實體瘤和白血病分泌的Apo-EVs 中含有凝血調(diào)節(jié)劑——組織因子，導(dǎo)致血液抗凝能力降低，促使血液形成高凝狀態(tài)，增加癌栓形成和腫瘤定植風(fēng)險[45]。同樣，黑色素瘤產(chǎn)生的Apo-EVs 也被證明有外源性促凝作用，其形成凝血酶原復(fù)合物會激活早期階段的凝血反應(yīng)，促進腫瘤形成癌栓[34]。

Apo-EVs 對免疫系統(tǒng)的調(diào)控作用，也是影響腫瘤生長的重要因素。淋巴瘤細胞衍生的Apo-EVs 攜帶了腫瘤相關(guān)抗原，并被脾臟CD169+巨噬細胞亞群捕獲，抑制樹突狀細胞介導(dǎo)的體內(nèi)細胞毒性反應(yīng)，最終建立免疫耐受[46]。Apo-EVs 也可以通過促進異位生發(fā)中心形成，增強免疫系統(tǒng)的監(jiān)視作用。實體腫瘤患者在內(nèi)皮細胞的血管損傷后，會產(chǎn)生攜帶活性20S 蛋白酶體的Apo-EVs，其將信號傳遞給γδT 細胞，促使γδT 細胞遷移到損傷部位并產(chǎn)生有助于損傷部位三級淋巴樣結(jié)構(gòu)形成和成熟的細胞因子IL-17，使局部產(chǎn)生活躍的免疫反應(yīng)，加強免疫細胞對腫瘤的清除能力[47]。

3 小結(jié)和展望

細胞凋亡是組織生長以及維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要程序。Apo-EVs 形成作為細胞凋亡的環(huán)節(jié)之一，Apo-EVs 攜帶DNA、RNA 和蛋白質(zhì)等物質(zhì)，并且含有特異性蛋白標志物的膜結(jié)構(gòu)，可將特異性的內(nèi)容物運送至靶器官或靶細胞，在組織發(fā)育和再生、炎癥和腫瘤等疾病中發(fā)揮重要作用。與細胞直接釋放細胞因子和生長因子到組織間隙相比，Apo-EVs 傳遞的信號減少了“信號稀釋效應(yīng)”，使生物活性分子可以更高效地作用于鄰近的細胞或遠處的組織。然而，對于Apo-EVs 的作用方式及細胞間通訊的機制仍未完全明確。關(guān)于Apo-EVs 的研究存在一些挑戰(zhàn)，首先，凋亡細胞釋放的Apo-EVs 與正常細胞釋放的外泌體在技術(shù)層面上很難區(qū)分。其次，由于Apo-EVs 共同表達與凋亡相關(guān)的標志蛋白，并且可能不攜帶供體細胞特有的標記蛋白，因此很難區(qū)分體液中Apo-EVs 的來源。此外，由于壞死細胞也會釋放一些囊泡，因此很難辨別囊泡來源于凋亡細胞還是壞死細胞。綜上所述，關(guān)于Apo-EVs 的形成和作用機制尚需要進一步探索，Apo-EVs 向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化任重而道遠。